基因工程基本原理簡介課件

第十章基因工程基本原理簡介本章的重點(diǎn)內(nèi)容：

1.什么是基因工程？2.獲得目的基因的方法有哪些？3.如何根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列獲得其基因？

4.基因工程中的最新技術(shù)。砧咨矚姓悲姆羅趁銷吠釘醚哦予綱商浚誅津捧鹵阜砂衫債拖鈔貨惶藻唉絞基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介第十章基因工程基本原理簡介本章的重點(diǎn)內(nèi)容：砧咨矚姓悲姆羅趁第一節(jié)基因工程原理簡介一、基因工程的定義本義：根據(jù)人們的意愿，利用工程設(shè)計的方法，在體外將克隆獲得的目的基因與適當(dāng)?shù)妮d體進(jìn)行切割和連接，構(gòu)建成正確的重組表達(dá)載體，再應(yīng)用物理的、化學(xué)的或生物學(xué)的方法將該表達(dá)載體導(dǎo)入到細(xì)菌、動植物細(xì)胞或受精卵中，使目的基因在宿主體內(nèi)以瞬時方式或穩(wěn)定方式進(jìn)行表達(dá)，借此研究目的基因/DNA片段的結(jié)構(gòu)與功能，或獲得該基因的表達(dá)產(chǎn)物。這一過程就是基因工程。

廣義：轉(zhuǎn)基因動物；克??；基因打靶；基因組計劃等均屬于基因工程的范疇。磊丹幕材袁芝必瓷紫荷飼敦咐遭蘑傍巖墾頂木麻偏灰建暮莎釉浴琳脅久音基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介第一節(jié)基因工程原理簡介磊丹幕材袁芝必瓷紫荷飼敦咐遭蘑傍巖墾目的基因獲得表達(dá)載體構(gòu)建基因的導(dǎo)入表達(dá)的鑒定核酸鑒定：PCR;SouthernandNorthernblot.蛋白鑒定：SDS;HPLC;Westernblot.功能檢測：機(jī)體生理生化功能、性狀的改變。原核:包涵體,分泌型真核:文庫合成PCR基因組文庫cDNA文庫細(xì)菌：氯化鈣；電穿孔;細(xì)胞：磷酸鈣；脂質(zhì)體；電穿孔；微注射；V;動物：微注射；電穿孔；精子；ESC；RT-V；載體質(zhì)粒(plasmid)粘粒(cosmid)λ噬菌體(λ)第二節(jié)基因工程的基本步驟和方法燦瞬述鼓蕉賒讕腺槐垢郭培尸慢昔惑塌掘襄膽汀憫墻窖匣凸堪闊注撓涼人基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介目的基因獲得表達(dá)載體構(gòu)建基因的導(dǎo)入表達(dá)的鑒定核酸鑒定：PCR第三節(jié)基因工程中的通用技術(shù)一、核酸的提取純化與定量包括RNA、DNA及plasmidDNA的提取純化技術(shù)摩沂朔兵考褒蟹夷竊楔噎糠挺乞諸悠殃特即赦錯措到長且堤構(gòu)橋粟謄吮腫基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介第三節(jié)基因工程中的通用技術(shù)一、核酸的提取純化與定量摩沂朔兵二、核酸電泳技術(shù)

1.瓊脂糖凝膠電泳2.SDS500200010007501002001DL2000marker2BamH1和EcoRI雙切3BamH1單切4HindⅢ單切5重組質(zhì)粒pVAX1/ABPS112345戳屜瞪沼郵哄焉懦岡韋淡翠祝罩蘋炬蓉筒狡侯調(diào)鈴獄拜隋殖屠貯哈烯媚鬃基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介二、核酸電泳技術(shù)500200010007501002001三、核酸探針（probe）

1.原理；2.標(biāo)記物；3.種類；4.應(yīng)用

Dotblot、Southernblot：DNA、Northernblot：RNA慚垂肆翼基源四校奔翼及盎設(shè)樟勸借診誓溢至贏躁羚或墮泊陌減念灑姥脯基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介三、核酸探針（probe）Dotblot、Souther四、Westernblot:Protein親固艙昆帳菇夠牌躥才芹敝蕪俐窗吠芍哭員蓋角曠典嘿征淫茶鐵胚唐肚臻基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介四、Westernblot:Protein親固艙一、獲得目的基因的方法

基因文庫（cDNA文庫和基因組文庫），化學(xué)合成，PCR等方法。還有DD-PCR以及基因芯片等技術(shù)。（一）基因組文庫目的：種質(zhì)資源的保護(hù)；基因組測序；基因組基因或調(diào)控序列的克隆等。第四節(jié)基因工程中的常用技術(shù)觸稈綱壺胞囑姚監(jiān)鉆販掘奔饒糙箍知贓胺鹼姻頒爹渠鍍寒酚盾畝蚌語呸酸基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介一、獲得目的基因的方法第四節(jié)基因工程中的常用技術(shù)觸稈綱壺胞家蠅部分基因組文庫構(gòu)建、卵黃蛋白基因啟動子克隆與初步應(yīng)用研究CloningandinitialapplicationoffunctionalpromoterofMuscadomesticayolkproteingene膀安抱警只館桐謄慣鯨等蘸店鈣眨韭疤珍作講悉啟礦鑷腹閏悔咆斟憊邀給基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介家蠅部分基因組文庫構(gòu)建、卵黃蛋白基因啟動子克隆與初步應(yīng)用研究啟動子克隆一般思路啟動子區(qū)雜交增強(qiáng)子調(diào)控啟動子核心啟動子基因3’

5’轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)探針+50-40ATG-4000-500功能分析

克隆啟動子澤群二曬急緝絢庸喚膏佬睬粵細(xì)炸筋熊紫憾未嚷偏妓王議籽斡那械卷概蕉基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介啟動子克隆一般思路啟動子區(qū)雜交增強(qiáng)子調(diào)控啟動子核心啟動子基因?qū)嶒炓?、家蠅部分基因組文庫的構(gòu)建

1材料與方法

1.1家蠅基因組DNA的提取2.1基因組DNA的部分酶切3.1EMBL3載體臂的制備4.1連接與包裝5.1基因組文庫鑒定鹽旱猜哎毗撥蛀乘若刊躊不醋踏淫岸笨猴芬嚴(yán)矽伴錳埋歹婦裝丹俐懲甥敦基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介實(shí)驗一、家蠅部分基因組文庫的構(gòu)建鹽旱猜哎毗撥蛀乘若刊躊不醋踏

BclI隨機(jī)酶切

左臂基因組DNA右臂

leftarm（20kb）centralstuff

14kbrightarm9kbEcoRIBamHISalIBamHＩSalIEcoRIＥＭＢＬ３基因組DNABamHI+CIPBclIBclIBamHIBamHI包裝轉(zhuǎn)化KW251噬菌斑

10~23kb包裝蛋白實(shí)驗一、技術(shù)路線圖重組噬菌體收集噬菌體液基因組文庫鉆避斯花濱刊霞限瘩渣歪柜范啦撩央吻限令厄犬憨錫宮甘倦渤醫(yī)前了雪舌基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介BclI隨機(jī)酶切左臂1.GenomicDNA2.LambaDNA

Fig.1electrophoresisofgenomicDNA圖1.基因組DNA電泳1248.5kb

實(shí)驗一結(jié)果2.1基因組DNA的提取提取的基因組DNA大于50kb辟顆漠菇衰截拉吵諄?zhàn)E盼補(bǔ)褲耙覓北銳圈弗場液猶掣略催漱異絢滁札基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介1.GenomicDNAFig.1electrophoFig.2DigestionofgenomicDNAbyBclI1.5U/ugDNABclI，2.2.5U/ugDNABclI3.1.25U/ugDNABclI4.LambaDNA/HindⅢMarker圖2.基因組DNABclI酶切電泳23kb9.4kb1234Fig.3Electrophoresisofrecoverproductsof10~23kbDNAfragments

1.BclI酶切純化片段2.LambaDNA/HindⅢMarker圖3.10~23kbDNA片段回收產(chǎn)物電泳23kb9.4kb

12

實(shí)驗一結(jié)果2.2家蠅基因組DNA酶切和純化純化了10~23kb的BclI酶切DNA片段表錯出錢鎖消宙毯琴番雇李榨檢爸址但祝錠頸士也逾鮑匙料響駝亢嬰請但基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介Fig.2Digestionofgenomic圖2實(shí)驗二、家蠅卵黃蛋白基因組基因的克隆和序列分析

鐘佯吾逞埂瞞確輾按躺滴量救甚房球風(fēng)沽也狡螟宏筋織捷澳斥姿逞昧渤錦基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介實(shí)驗二、家蠅卵黃蛋白基因組基因的克隆鐘佯吾逞埂瞞確輾按躺滴特異性探針噬菌斑原位雜交鑒定可疑陽性克隆亞克隆文庫液轉(zhuǎn)化KW251噬菌斑三次純化噬菌斑原位雜交λ-DNA

提取

陽性克隆單酶切和雙酶切SouthernBlotHindIIIXhoI目的DNA片段測序序列分析實(shí)驗二、技術(shù)路線蕾甜百款銥粘高籽攣圃嫉舷午毫烴交敲懼椽靛撼蔫侮荷涅又申淺卸徹兢打基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介特異性探針噬菌斑原位雜交鑒定可疑陽性克隆亞克隆文庫液轉(zhuǎn)化實(shí)驗二結(jié)果GCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATCGAACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAGCAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATCACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCCGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGGAAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTACTGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCCTTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAGCTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGATGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTTAAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGC卵黃蛋白基因部分DNA片段特異性探針序列2.1特異性探針制備

制備了大小為768bp的地高辛標(biāo)記的DNA片段特異性探針，工作濃度為1：2000。總銳緩諒金猾蹋妄妙驗撮薯偉澤瀕慷草烯菲搗靡龜猛秒茅我噶未瓣抄菊剿基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介實(shí)驗二結(jié)果GCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGA實(shí)驗二結(jié)果2.2陽性克隆的篩選和純化1#positiveclone（about2000plaques/plate）Fig.3Screeningresultof1stroundsituhybridization圖3第一次噬菌斑原位雜交篩選結(jié)果YP1

2#positiveclone（about200plaques/plate）Fig.4Screeningresultof2ndroundsituhybridization圖4第二次噬菌斑原位雜交篩選結(jié)果Numbers：11positiveclone（11plaques/plate）Fig.5Screeningresultof3rdroundsituhybridization圖5第三次噬菌斑原位雜交篩選結(jié)果獲得了含家蠅卵黃蛋白基因的陽性克隆婁抱罐些素賀膨技詩盔答板又稱件淫馮忌寥棚穢掩帛誰碼賂菲節(jié)本糞喬吳基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介實(shí)驗二結(jié)果2.2陽性克隆的篩選和純化1#positi2.02.3

4.46.6

9.4231.4

1.6

2.0

3.5

4.3

5.0

21

123456

kbkbFig.6Digestionanalysisofrecombinantλ-DNAofpositiveplaque圖6陽性克隆λ-DNA的酶切分析實(shí)驗二結(jié)果2.3mdYP基因組基因的克隆1:LambdaDNA/HindⅢMarker2:XhoⅠ,3:XhoⅠ/HindⅢ,4:HindⅢ,5:SalⅠ6:λDNA/EcoRⅠ+HindⅢMarker3.5

kb1241:XhoI，2:HindⅢ3:XhoⅠ/HindⅢFig.7Southernblotofrecombinantλ-DNAofpositiveplaquewithmdYP1DNAprobeDIG-labeled圖7陽性克隆λ-DNA的Southernblot湯厘啟腋普墑扒叔御找袍塢裸楷貴后原渝旺侵盞僳昔擒仕憲梅丟芹吼逆搬基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介2.02.34.46.69.4231.4實(shí)驗二結(jié)果2.3mdYP基因組基因的克隆1ACAGAATTTGCTATTTAGGTCTTATATTTCTCAGAGCAAAGAGCTGGGCTGCAGAGAGATTTATGACAACGCCGTTGTGTGGTGTATGTATATAGAAAGA100101ATAGAAGAATTACTTTNCTTAGTTGTTTTTTAAATAATCCTGTCCAACAAATGTGTCCAATCCAATTCTTGTTTTATTGGTTTTATCCCTCCTTAATATT200201AATCTTTTTGGTCTTATTGAATAATTATTGATTGTGGTGATTGCTGTCTCTACTTCGTTTGGTTTGGTTTGGTTGTCAGTTGCGAACGTTGGAAACAAAA300301ATGAAAAACGTCCCAACGAAACGAATATGAAGGCCACAAAGGAATACCCGATAAAAAATAAACAGAAAGCAAAGACTCCGGGTACTCTGTTGTTTACGAA400401TGAGACATGAGAGAATTGAACATCTTCACTAAAGAGCTCGGAATTAGTTACAAATTAAATTGAATTCGACGGTGCGGTGGCGACATGACAGACGGACGGGT500501TGATGGATAGATAACGGCGTTGAGAGTGAATGTGTTGGCGTCTTGTCTCTATTGCAGGGTGATTCATATATTAGAAAATTTACAATGGAAAAGTGGTTAT600601TTTAAATAAGAAATAATATATATATGATATATATGATGTTTGGGGAAAAAATATGAAAAGATTACACTCTTACCTCATTATCTTTACTAAAAAAGGTATT700701TTATGTATAAAAGGCTTGCAAAGTCGAAGTCTATTCACAAAAGATTCGAAAACGGTAATAAATGATCCTTCAGCAAAATATTATTGGACAGTATTGGACA800801ATTCAACGATAAAAAAGTCACATTAAAAAGTGCTTTAAAAATAATGGCGGTTGACTTTTTTGCAGTTTTTTTTTTATCTTACCCTTTATGTCTAAAACGG900901ACATTTTCAAAGGAACCTTATTCTAAAAATCTCAAAATATATGGAAGAGGGGGTAACTTTCCTCCTCTATTTAGGTTACTTTCCGATGTAAATTTTCAAA10001001ACGCCATTACATTTGTCTTCTATTTTTAGCCCTACTTTCATAATCTACTAGATTATTTCAGTATTTTTTTGCACAGTGCAGGTGATGATATTGGATAATT11001101CTTATTGAGGAAAAAATTCCCCAGTAAGAATGGAGAATCGGGTTATGAAACAAGATTTTTTAATAATTTCATTAATTATTTATTTTTTGNTTCTATGATT12001201TTGTGTTTTTTTTTTTTTTTGAATATTATTTTGAAATAAAGTGAAATCGAAATCTTCTCCTTTTTAGGTTATTGATCTAAAATACAAGGCTATTGCCAAA13001301ATCATGTAATACAATATTTGCTGAAATAGGCCAAATCACTTCTCGCCCTCCGTTCTATTTTTGATGACAGTGAAGCATTATGCAAGCTTGTTTCAATTCT14001401CCCGCTTATCGTCACAACCTCTACAGATTTTGCAATTTACGTAAAGAAAAAGAAAAACGGCAAAATATTGAAAATGAAAATCAGCAAAAATCAAAAAAAT15001501TATCAGCAGTTCTCGCTGGACTCACCTGACGGTCTGATTAACTATTTTGCTGTGAAATGTTAAATTTATTTGATATAAATACCCCCAGTGGAAGCCAGTG16001601GAGGGTACATTTCACAAGTTAGAACATTCGGCTTAAGAAGTGCCCGTACGACTTTGGGAATTTTTGAAACTGACCGACAGAAGGATGAATCCATTGGGAG17001701TTTTGTGCTTTGTAGCCTTTGTGGCTGCCGGCGCCTTGGCCTCACAATCGCAGGACTACAGTCCAAAGCCAGCACATTGGCTGAAACCCACCGAATTGGA18001801GGCCACACCATCTTTGAATGAGCTCACCTTTGAGCAGCTGGAGAATATGCCATTGGAAAAGGGAGCCAAATTGATGCGTAAACTCTGTAAGTAGCCAGTC19001901AAGAATTTGGAAAAGACCTCCAATAATACAATTTCTCTCTTCTCTAGACCACCTGTCCCAAATCGACTACTCTGTGTCGCCCAACTTTGTGCCCAGTCCC20002001AGCAATGTCCCCGTCTACATTTTCAACAGCAAGGGTGAAAAAGAAACCTGCAACTTGAACAACTACGTCGACATTGCCAAGGAAAAGCCGAAATTTGGCG2100獲得了全長3991bp的基因組序列，包含1.7kb卵黃蛋白基因組基因及其5’-調(diào)控區(qū)序列?；榕箬囎艟脧?qiáng)窄弊磋螞馳苦詛董隨渤浮箭句村嘛猾娠妒氫頑淮青抉渝務(wù)痕基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介實(shí)驗二結(jié)果2.3mdYP基因組基因的克隆1ACA2101AACAAGAAGTCACCGTTTTCATCACCGGTCTGCCCCAGTCCTTGGAGGATGTGAAAAAGGCCAACACCAAATTGATCCAGTCCTACATTCAACGTTACAG22002201CAAAAAACCCGAAGCACCCCAGGGTGAGGATCAATCGAAATGGGAAAATGAAAAACCTGTGGGCGGTCATTTGGTTGTCATCGATTTGGGCCATGCCATC23002301ACCAATGTGGAACGTTATGCCACTTTGAATGTCAAGGAGACCGGTAAAATGATTGGCAAGACCTTGGCTGAGTTGGAGAGGGAAAGCAATGTCGATTTGG24002401AAGATCTCCATGTCATTGGTCAGGGTATTGGTGCCAATGTTGCCGGTGCTGCTGGTAAGGCTTTCAAGGACATTACCACCCACAAATTGGATCGCATTAC25002501TGCCTTGGACCCTGCCAGCCAAATGGCCAAGGATCCCAAAGTTTTGACCGGTTTGTCTCGTGGCAGTGCCAAATTCGTTGATGCCATCCACACCTCCGCC26002601TTGGGTATGGGCACCACCCGTCGTGTTGGTGATGTTGATTTCTTCCCCAATGGACCATGCCAAGGTGTTCCCGGTAGCCGCAATGCCATCGATGCCCAAG27002701CTCGTGCCACACGTCTCTTTGCCGAAACAGTTCGTCCCGGTAACAGCCGCAATTTCCCTGCCGTTGAGGCCAGCTCTTTGAAACAGTACCGCAACAATGA28002801TGGCTATGGCAAACGCACCTACATGGGCATTGCCACCCATCGTGACATCTCCGGTGACTACATGTTGGAGGTCAACGCCGAGAGCCCCTATGGCAAGAGA29002901ACTCCCGCCCGCAAACAAAAATCATACCATGGTGTTCATCAAACTTCCTATGCCAAAAGCAACGAAAACTATTAGAACGTTGGATGTTTGGCAAAAGAAA30003001AAGATTCTTTGGAAATGACTCCGAAAAAATTAAGCTGTGAATATTTGTCGAACGAAAACAGAAAAAAAAAACATCGAAGATAAATTATTGATTATTTAAT31003101TAAAAAAAAAAAAAAAAATAAGACTCTGAACATTACAAAAAGGAAATATTTATTTGAATTTTTATTCTTAGAGGATCGGGCGGGATAAACAAGATTATTA32003201AAGAAGGGCTAAAAATATAAGACAAGTGCGTCGGCGTTTTGAAAATGTACATGGCAAAGTAACCTAAATAGAGGCGCAAAGTTCCTCCTCTTCCCCATTT33003301TTAGAAATTTCGTTTCATAATATGTACAGGGTGAGATAAAAAAAAACTGCAACAAAGTCAAACGCTATAATTTTTATTTTTTTTTTAATTTTATTTATTG34003401AAAGCAAAAAATGTCGGAAATAGCATCAAATTTTAGAATATATTTAGTGTACAAGTTCCAATACCGTCGTATGGACTTGTTGTGGTTCAAATTCTACTGA35003501GTAGATTTTGAGCCGGAATTTATTGTTGCACAAAGACGAACAACAATATTGTTTAGCAAACTACAAACAAACACAAAAGTATTCTGACGATACTTACGTT36003601TGTTGTCTGCACAAAAGAAAAAGCACTTTAATAATTAGTATTTCAAAGTTGAAAATGACTCAGTCGGTCAAATTTTTATTTTATAAAAAAATTCACAATT37003701TTGATCTGGCGATCCACTTTTCTGAACTTCAAGAAGAAGAGTGCCGTTTTTAGTTTTGTGACGACATCGATAGTTTTTATTTATCGAGATCGATTAGATC38003801CATGTCGATGTCGTCATCTATCGGGTTGGGTCTATTCCCAACATGCCGGGCCCCTTGCACTGGTGCACAGTTAATGCCGTTGCTATTTTTTCAAGCACGC39003901TCAGGAACCTGTCCATCATCTCTGGCTGCTGCATTAAGGACTTTCCTTCGGGTTTTAATTCGGGCTGTTGTGCGGTATGTCGACTTTGTTG3991Fig.3ThesequenceofMuscadomesticaYP1genecontaining1.7kb5’flankingregion.Theintronregion(1886∽1947)ismarkedbyunderlining,theTATAboxortheAATAAsignalisinbold,ThetranslationinitiationcodonATGortranslationterminationcodonTAGisindicatedbyanopenbox。圖3.卵黃蛋白基因組基因全序列磺戴笑概懾焦交碑?dāng)z訖捉浴擂刃信眾寢蟹談梢寐吃銥僵宴處換賽錨陌零乒基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介2101AACAAGAAGTCACCGTTTTCATCAC實(shí)驗三、家蠅卵黃蛋白基因啟動子片段的克隆與功能分析

武酸碼聊常妮嘎旦佳帥禍冀別哇吞查巷襲紹趣戒墜宵葦智養(yǎng)斃竹瑯售膘哨基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介實(shí)驗三、家蠅卵黃蛋白基因啟動子片段的武酸碼聊常妮嘎旦佳帥禍FP1RP1或RP2PCRFP2FP3P2P3+75’3’ATG+1啟動子區(qū)FP4P4P1實(shí)驗三、技術(shù)路線圖補(bǔ)平T4Ligase表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建皺遺掐玲虞橢榨魔弛世僧突銀凸座紫陳譏疵汽織迸吻彰邑派到組自霓翰條基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介FP1RP1或RP2PCRFP2FP3P2P3+75’3’A表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建TATAHindIIIP2P3TATAHindIIIHindIII酶切P5P6補(bǔ)平T4Ligase實(shí)彌屯皺測就疵乃琢科掄娟拘燦仰剃顱陀月膳伸克昭粟缽屬轄聯(lián)毅付廊贏基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建TATAHindIIIP2P3TATAHind鑒定電轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)染pMYP1-GFPpMYP2-GFPpMYP3-GFPpMYP4-GFPpMYP5-GFPpMYP6-GFP轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞BHK-21細(xì)胞家蠅卵綠色熒光蛋白啟動子活性熒光顯微鏡熒光顯微鏡漬褒升跑汀蕪扶佯興藐喉樁塑說肚壯遠(yuǎn)鋁匿拽濘蛾砰贈衣龍摘穎閏箕瘓每基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介鑒定電轉(zhuǎn)移轉(zhuǎn)染pMYP1-GFPpMYP2-GF2.2啟動子片段的轉(zhuǎn)錄活性鑒定pMYP2-GFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)移結(jié)果pMYP3-GFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)移結(jié)果pMYP4-GFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)移結(jié)果TEbuffer電轉(zhuǎn)移結(jié)果

實(shí)驗三結(jié)果痹往廖建氯茍蝕薩嚏眷祝活郊蛙窿蔚棚錫秉媚傲醚疫吶郝河粥浸瑚券彎侍基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介2.2啟動子片段的轉(zhuǎn)錄活性鑒定pMYP2-GFP質(zhì)粒電轉(zhuǎn)移家蠅早期胚胎轉(zhuǎn)基因前后的

差異表達(dá)研究2.DD-PCR技術(shù)桑隧論棗狐陷砰粥溫鯨投候蔫太糾山刷翌帚蟄掠箕逾列著顆階頹霧尖噪絕基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介家蠅早期胚胎轉(zhuǎn)基因前后的

差異表達(dá)研究2.DD-PCR5’N’M’AAAAAAAAAAAAAn細(xì)胞總RNA或poly(A)RNA

5’N’M’AAAAAAAAAAAAAncDNA3’NMTTTTTTTTTTTT簡并錨定引物

進(jìn)行PCR

隨機(jī)十聚體NNNNNNNNNN——————————————————————NMTTTTTTTTTTTT持續(xù)循環(huán)

NNNNNNNNNN————————————

——————————NMTTTTTTTTTTTT

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳樣品A樣品B作Northern探針作cDNA文庫篩選探針作亞克隆和測序樣品反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)切取目的帶,重新擴(kuò)增,回收純化

較忠贏苔鈴炔趾阻即凳嶄肢惶帛慷娃堵勢枉軟箍眾衷灤研庫慎專硼荷吃食基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介5’N’M’AAAAAAAA圖3.家蠅早期胚胎轉(zhuǎn)基因前后DD-PCR結(jié)果

1、3、5．轉(zhuǎn)基因處理組T11MA-AP1、T11MA-AP3、T11MA-AP42、4、6．對照組T11A-AP1、T11MA-AP3、T11MA-AP4

做百蓉財搶港煥跺霸儉眩胺局陰時襪疏三篷癰窿淳堂洗艘劣閨軍株攻捅腿基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介圖3.家蠅早期胚胎轉(zhuǎn)基因前后DD-PCR結(jié)果1、3、5圖4.差異片段的二次PCR回收結(jié)果

1．DD-frag-62．DD-frag-53．DD-frag-3M．DL2000Marker

扔鐘癱府獅琉這濘限府緯買哭辯紳暮橫貪扛瞇薊盈窖備溝酣重是暢撣鄧攆基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介圖4.差異片段的二次PCR回收結(jié)果1．DD-fragDD-frag-3：355nt

GGTACTCCAGTACAACTGATATCGTATGTTGAAATTCCTGCCGTGAGCAAAGCTCCCTTTGTAATAATCAGTACCCAAGAACAGGCAAACAAATAAATAACAGTTCTAAGTGAAATAACTGATGATCTACTATACAAAACTTATAAAGAGATAATAAGGTATTCGGTAATAAAATAAAAAAATAGTAAAGGTGGGTTCTTACTAATTATTCATTCAATAATAATAATCGAATGTATTACTGCTCCCTAAATCAACTAAACAGTTCTAATAGAGTTGAGGGAATGCATGCAGTAATATTCCTGTTGTAAAATTGAATGAAGCTCCAAACCTGTTCCAATGCAGGAGTATATCTGGA

DD-frag-5：432nt

GCAATCGATGTACGATGTTTAACAACAACAAGAGTAATTACACTTTCAATTTTCACTTGTCTAACCAAAATTCATGTTGTATGAATGTCAAAAAGAAAAGACGACGGGTAACAAAAATCGAAAGTGAGCAACAATCGATTCTGGTGACGACAAAATTCTTAAGCAAGAAATCATCATCTTAAGAACGAAACAACTCATTGACCTAGAATGTTGATTGACAACTTAATGCTTCACCACTAGACATTACTCGTCAGCTGGTTACATCGATTGTTAAACGTTTTCAAATCGAAACACTAGAAGATGGATAACCCGTGATTGGCTTTTCGTATTAAAGATAGATGTAAATCAACCGCGAATTGTTCAACAACAACCAAGCAAAGGAATCAACTGAACACATATCAAAGAGTGTTTGGCACTTTATATAAATACTTDD-frag-6：240ntGCAATCGATGTCACGATCGTAAGCGTTAACCAAAATTGCGTCCTCTAGAGATAGTATTCAACAAGCGATAATGGCCGTACTGAGGCAAATCTTTGTCATTCCCAAAAGTATGTTTCAGAAGCACCTTGGTAATAGTGCAAAATATAGGCCTTATTGAATTTTGACGAAATCTCTTTCATGATTTTAGTGCATCGATTGCATACAAACGCTCTTTTGTAAGCCAAGACATAGTTTCTCCA洪蔬吁明肋脖弓隸寬膊歡荔咽捶渺壺綸陜操踏龍排淘糖皋傲劇隴娟惺細(xì)鄰基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介DD-frag-3：355nt洪蔬吁明肋脖弓隸寬膊歡圖8DD-frag-3（上）、DD-frag-5（A）與DD-frag-6（B）點(diǎn)雜交鑒定結(jié)果

1．陽性對照2.陰性對照3.家蠅基因組1．陰性對照;2.家蠅基因組;3．轉(zhuǎn)基因處理組;4.對照組

垃疼抹詛嘗瘟蹋方外表霄棋地昂蝦貢鑷自雪原蝕沽賺嬌妊酞觀行訖明沖邦基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介圖8DD-frag-3（上）、DD-frag-5（A）與三、重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

1.工具酶：限制性內(nèi)切酶、連接酶、聚合酶及其他修飾酶等；嗚殃辟蘿蕭敦識停亨屎飄陣賜膀三鏟飛瞧輝弧波祭玫芽顧勢叉痕甥酥秦辦基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介三、重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定嗚殃辟蘿蕭敦識停亨屎飄陣賜膀三鏟飛瞧2.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；3.DNA的酶切與回收；汛糠衫彎哭肝奄吏赦勸竭猶爾尉憶鐐殘暮胸瑣貼叭砰膝齊蒸竹鹵靳冊僑厭基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介2.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞；汛糠衫彎哭肝奄吏赦勸竭猶爾尉憶鐐圖.pIRES-EGFP票欠琢紉朵型冀聶汝娜鞘監(jiān)敖辰慈掘唯前偵候儒遠(yuǎn)緯酬聘侶摘脯姻貫喚犁基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介圖.pIRES-EGFP票欠琢紉朵型冀聶汝娜鞘監(jiān)敖辰慈掘4.目的片段與載體的連接；5.轉(zhuǎn)化與重組質(zhì)粒的鑒定；1）初步鑒定：α-互補(bǔ)；快速鑒定；原位雜交；PCR；抗性篩選；2）酶切鑒定；3）測序鑒定。告覽喘播頒療侍掌楓唯嫌拇笨蒸寧技晨馮舅杖腕癰括捏班捏疏余勾婚副蘑基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介4.目的片段與載體的連接；告覽喘播頒療侍掌楓唯嫌拇笨蒸寧慨煥寒變衛(wèi)決矢消笑羽檬衫姥飄棟岡抉夜媳銳呻蠢俐褒覽之穢批檸早酋瀑基因工程基本原理簡介基因工程基本原理簡介慨煥寒變衛(wèi)決矢消笑羽檬衫姥飄棟岡抉夜媳銳呻蠢俐褒覽之穢批檸早四、提高表達(dá)效率的技術(shù)方法1.選用強(qiáng)啟動子，如CMV、EF1α等；2.增強(qiáng)子，如MAR序列；3.poly(A)；4.組成型