四川大學(xué)生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)生版

生物技術(shù)綜合實(shí)驗(yàn)甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表達(dá)學(xué)生：學(xué)號(hào)：同實(shí)驗(yàn)者：<研究背景>谷胱甘肽(glutathione,GSH)GSH擁有多種重要生理功能,抗自由基和抗氧化應(yīng)激作用,保護(hù)細(xì)胞膜的完滿性等。γ-GCS是植物細(xì)胞中GSH生物合成的限速酶,能夠調(diào)控GSH的生物合成量。GSH在生物體抵擋冷害、干旱、重金屬、真菌等威脅過程中起重視要作用,說明γ-GCS也與植物抗逆過程親近相關(guān)。實(shí)驗(yàn)一甘薯葉片RNA提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼J(rèn)識(shí)真核生物RNA提取的原理；掌握Trizol提取的方法和步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理Trizol試劑是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的單相的迅速抽提總RNA的試劑，在勻漿和裂解過程中，能在破碎細(xì)胞、降解細(xì)胞其余成分的同時(shí)保持RNA的完滿性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚獲得釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能夠完滿控制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來控制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。%的8－羥基喹啉能夠控制RNase，與氯仿結(jié)合使用可增強(qiáng)控制作用。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失，以致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分別。β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。在氯仿抽提、離心分別后，RNA處于水相中，將水相轉(zhuǎn)管后用異丙醇積淀RNA。用這種方法得到的總RNA中蛋白質(zhì)和DNA污染很少。三、實(shí)驗(yàn)資料資料甘薯（IpomoeabatatasLam）葉片，品種為徐薯18試劑①無RNA酶滅菌水：加入%的DEPC，辦理過夜后高壓滅菌；Trizol試劑；③氯仿；④異丙醇、75％乙醇；⑤TBE緩沖液；⑥上樣緩沖液（6×）儀器高壓滅菌鍋、微量移液器、臺(tái)式離心計(jì)、超凈工作臺(tái)、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、塑料離心管、槍頭和EP管架四、實(shí)驗(yàn)方法1.將葉片取出放入研缽中，加入合適液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物葉片加入1mLTrizol試劑，室溫放置5min，使樣品充分裂解；2.每1mLTrizol試劑加入200μL氯仿，用手激烈振蕩混勻后室溫放置3-5min使其自然分相；4℃12,000rpm離心15min，吸取上層水相轉(zhuǎn)移到新管中；在上清中加入等體積冰冷的異丙醇，室溫放置15min；4℃12,000rpm離心10min，棄上清，RNA積淀于管底；RNA積淀中加入1mL75%的乙醇（用RNase-free水配制），平易震蕩離心管，懸浮積淀；4℃8,000rpm離心2min，棄上清；室溫放置10min晾干積淀；積淀中加入20μLRNase-freeddH2O，輕彈管壁，以充分溶解RNA，-70℃保留；用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，用EB染色并照相。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果RNA提取結(jié)果依照Trizol試劑盒方法，提出的RNA較少，此部分未以圖或數(shù)據(jù)顯示。RNA后電泳結(jié)果如圖1.其中9a為本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由圖可知RNA條帶特別模糊，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，幾乎無法分清詳盡條帶，亮度較大。點(diǎn)樣孔周邊的紅色部分為雜質(zhì)，在提取過程中并未很好除去。圖1.RNA提取跑膠結(jié)果。其中1泳道為樣品Marker，9a泳道為本小組RNA樣品。與標(biāo)準(zhǔn)比較可見條帶模糊，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。六、解析與談?wù)?.RNA的提取產(chǎn)量其實(shí)不多，可能是因裂解樣品不充分或RNA積淀未完滿溶解所致。在實(shí)驗(yàn)過程中，由于對(duì)操作時(shí)間的掌握不熟練、操作技巧不完滿，留上清與棄上清季節(jié)RNA損失了部分，使最后RNA產(chǎn)量不理想。RNA電泳結(jié)果有EB存在時(shí)，電泳后28SrRNA和18SrRNA在紫外燈下應(yīng)看得很清楚，另出現(xiàn)條由tRNA，rRNA和5SrRNA組成的較模糊、遷移較快的帶。若是RNA沒有降解，則28SrRNA的亮度應(yīng)為18SrRNA的2倍，且這兩條帶都無彌散現(xiàn)象發(fā)生。由圖1.9a可知，RNA拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，說明RNA已大部分被降解；其余點(diǎn)樣孔附近出現(xiàn)紅色部分雜質(zhì)，解析可能有并未除盡的蛋白質(zhì)，同樣影響RNA電泳結(jié)果。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，本小組成員未嚴(yán)格戴上口罩并勤換手套，這可能使外源RNAase進(jìn)入樣品，以致其降解嚴(yán)重。其余，提取出RNA后本小組未馬上將樣品放入-70℃保留，也為以致結(jié)果不理想的重要原因之一。在最初用氯仿萃取分層的過程中，由于水相吸取過多，混淆入部分蛋白質(zhì)雜質(zhì)而未于后續(xù)純化步驟除盡，RNA條帶拖尾嚴(yán)重可能還受該蛋白質(zhì)影響。七、總結(jié)：本次試驗(yàn)RNA提取特別失敗，從跑膠結(jié)果可見其降解嚴(yán)重。誠(chéng)然大實(shí)驗(yàn)無法防范試劑交織污染的可能性，且電泳用膠的質(zhì)量也會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但從圖1.2a，3a，2b等條帶較為清楚的小組實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，瓊脂糖凝膠質(zhì)量以及試劑對(duì)結(jié)果攪亂不大。那么本小組成員在提取過程中的操作必然出現(xiàn)了很大失誤。第一口罩、手套應(yīng)該嚴(yán)格按規(guī)定佩戴，提取過程對(duì)移液槍等儀器使用需謹(jǐn)慎仔細(xì)，盡量防范混入雜質(zhì)。其次為消除部分雜質(zhì)影響可對(duì)RNA樣品用紫外線分光光度計(jì)測(cè)定吸光值檢驗(yàn)，將有助于結(jié)果解析。最后，細(xì)節(jié)決定成敗，我們應(yīng)吸取教訓(xùn)防范接下來的實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)近似問題。實(shí)驗(yàn)二第1鏈cDNA的合成和模板的考據(jù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆盏?鏈cDNA的合成方法和步驟二、實(shí)驗(yàn)原理真核生物基因多為斷裂基因，編碼區(qū)不連續(xù)，需經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工才能成為成熟mRNA。以真核成熟mRNA為模板合成cDNA，進(jìn)而獲得有連續(xù)氨基酸編碼的DNA序列，無需轉(zhuǎn)錄后加工，即可在原核細(xì)胞中表達(dá)。真核生物的mRNA都有PolyA尾巴。引物：OligodT（12-18個(gè)T）。莫洛尼氏鼠白血病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）以單鏈RNA為模板，在引物的惹起下合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈（cDNA）。mRNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA可作為PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增稱為RT-PCR，RT-PCR比Northern雜交更矯捷，對(duì)RNA的質(zhì)量要求較低，操作簡(jiǎn)略，它是在轉(zhuǎn)錄水平上檢測(cè)基因時(shí)空表達(dá)的常用方法。三、實(shí)驗(yàn)資料資料徐薯18葉片RNA樣品試劑dNTPmixture（10mMeach）；TotalRNA；RNasefreeddH2O；⑤M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶；⑥5×First-strandBuffer；MDTT；⑧RibonucleaseInhibitor(40U/μL)儀器10μL和100μL的移液槍、的EP管、PCR儀等四、實(shí)驗(yàn)方法1.在RNasefreeMicrotube管中配制以下混淆液：dNTPmixture（10mMeach）1μL*Oligo(dT)Primer(10μM)4μLTotalRNA2μLRNasefreeddH2Oupto12μL將混淆物65°C加熱5min，迅速在冰上冷卻2min，迅速離心，爾后加入以下成分：5×First-strandBuffer

4

μLMDTT2

μLRibonucleaseInhibitor(40U/

μL)

1

μL將混淆物輕輕混勻，37℃溫浴2min；加入M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（200U/μL）1μL，用槍頭輕輕吹打混勻；37℃溫浴50min；6.70℃加熱15min，使反轉(zhuǎn)錄酶失活，所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于PCR反應(yīng)。附反轉(zhuǎn)錄模板的看家基因的考據(jù)（β-actin）引物primerssequencessizeIbActinF5'-TTCCCCGGTATTGCGGATAGAATG-3'IbActinR198bp5'-CGGACCGGACTCATCATACTCTG’-3以第一鏈cDNA為模板，β-actin-F和β-actin-R為引物，使用Taq酶進(jìn)行PCR。表1β-actinPCR反應(yīng)系統(tǒng)（25μL系統(tǒng)）DNA模板1μL(約50ng)10×PCR緩沖液(Mg2+plus)μLMg2+μL10mol/LTPS-F1μL10mol/LTPS-R1μLmmol/LdNTPμLTaq酶μL滅菌去離子水μL合計(jì)25μLPCR反應(yīng)條件94℃2min95℃30sec個(gè)循環(huán)62℃30sec68℃30sec最后，1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.β-actin考據(jù)如圖1.其中編號(hào)1為Marker，3為本小組RNA樣品β-actin考據(jù)結(jié)果。由圖可知，使用RNA模板經(jīng)過RT-PCR獲得了長(zhǎng)度為198bp近似條帶，但因產(chǎn)物濃度較低，該條帶不甚清楚，并有部分彌散現(xiàn)象發(fā)生。圖1.β-actin考據(jù)電泳結(jié)果。其中編號(hào)1為Marker，編號(hào)3為本小組RNA樣品經(jīng)RT-PCR在加入引物IbActinF、IbActinR后擴(kuò)增出的β-actin產(chǎn)物。六、解析與談?wù)?.RNA提取因?qū)嶒?yàn)一本小組RNA提取失敗，故此實(shí)驗(yàn)采用老師準(zhǔn)備的RNA進(jìn)行考據(jù)。2.β-actin考據(jù)結(jié)果如圖1.第3組為本小組考據(jù)結(jié)果。其中β-actin能被cDNA模板擴(kuò)增出，但條帶模糊并有拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)。第一，因所得產(chǎn)物量較少，故電泳條帶模糊，推測(cè)可能是在進(jìn)行RT-PCR前，RNA有部分降解或于操作過程中損失部分所致。其次，本實(shí)驗(yàn)在對(duì)β-actin產(chǎn)物進(jìn)行電泳后結(jié)果出現(xiàn)拖帶，可能原因主要有：1）cDNA第一鏈產(chǎn)物的含量過高；2）DNase降解DNA產(chǎn)生的寡核苷酸有非特異性擴(kuò)增；3）PCR反應(yīng)中引物過多；4）循環(huán)次數(shù)過多；5）退火溫度過低；6）Taq酶過多；7）Mg2+濃度不合適。綜合本次試驗(yàn)解析，因?qū)嶒?yàn)條件已起初經(jīng)過試一試，故以致拖帶的最可能因素應(yīng)為cDNA降解產(chǎn)生了寡核苷酸非特異性擴(kuò)增片段。由于照片清楚度欠佳，非特異性擴(kuò)增片段無法清楚顯示，但若與圖2.進(jìn)行比較則可發(fā)現(xiàn)第2組β-actin考據(jù)圖出現(xiàn)了非特異性擴(kuò)增片段。圖2.第2組β-actin考據(jù)圖。其中1為Marker，編號(hào)2、6可見清楚的兩條帶。若要進(jìn)行改進(jìn)，則需盡量提取高質(zhì)量RNA，防范其被DNA污染。其余進(jìn)一步優(yōu)化PCR反應(yīng)條件也是必不能少的環(huán)節(jié)，提高退火溫度可防范非特異性初步與延伸。七、總結(jié)本次實(shí)驗(yàn)雖只進(jìn)行了模板考據(jù)，但讓我們理解了RT-PCR的原理與其在真核生物基因克隆方面的運(yùn)用。整個(gè)過程中本小組成員較嚴(yán)格依照操作規(guī)范進(jìn)行，所得β-actin產(chǎn)物考據(jù)也較成功。今后實(shí)驗(yàn)需更加注意細(xì)節(jié)，不斷完滿自己的操作技巧，積累經(jīng)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)三甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因克隆一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆誔CR的方法和步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它擁有特異、敏感、產(chǎn)率高、迅速、簡(jiǎn)略、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬以致百萬倍。其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟組成：①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至必然溫度后，使模板DNA雙鏈解離，成為單鏈，與引物結(jié)合，為以下的反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配春結(jié)合。③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，即可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2-4分鐘，2-3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。三、實(shí)驗(yàn)資料資料反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物DNA樣品試劑dNTPmixture（10mMeach）；②第一cDNA；③β-actin的引物（IbActinF和IbActinR）；④γ-GCS的引物（γ-GCS-F和γ-GCS-R）；⑤10×PCR緩沖液(Mg2+plus)；⑥

Taq

酶；3.儀器PCR儀、μL、10μL和100μL的移液槍、的EP管、電泳儀。四、實(shí)驗(yàn)方法擴(kuò)增甘薯γ-GCS基因的引物primerssequencesSize:5'-CGGGATCCATGGCGTTGATGTCCCAATCTG-3'γ-GCS-F斜體：BamHI酶切位點(diǎn)1575bp:5'-CCGCTCGAGTCAATAGAGCAGCTCCTCAAATAC-3'-GCS-R斜體：XHOI酶切位點(diǎn)甘薯γ-GCS基因的PCR擴(kuò)增甘薯γ-GCS基因的PCR擴(kuò)增系統(tǒng)（表2）（25μL系統(tǒng)）以第一鏈cDNA為模板，F(xiàn)和R為引物，使用Taq酶高保真酶進(jìn)行PCR；表2γ-GCSPCR反應(yīng)系統(tǒng)DNA模板1μL(約50ng)10×PCR緩沖液(Mg2+plus)μL2+μLMg10mol/Lγ-GCS-F1μL10mol/Lγ-GCS-R1μLmmol/LdNTPμLTaq酶μL滅菌去離子水14μL合計(jì)25μL.PCR反應(yīng)條件94℃4min94℃40sec65℃30sec35個(gè)循環(huán)72℃2min1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，并進(jìn)行膠回收純化；甘薯γ-GCS基因PCR產(chǎn)物膠回收——依照膠回收試劑盒的說明書進(jìn)行：1）將PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，5V/cm電泳1h后，溴乙錠（也許Goldview）染色，在紫外燈下切下2500bp左右大小片段的凝膠；2）稱凝膠重量，按1g/mL系統(tǒng)加Bindingbuffer，在55°C水浴中孵5min，直到凝膠完滿溶解；3）將凝膠溶液到DNAspin-column中，室溫放置2min，1,2000rpm離心1min，棄廢液；4）用700μLwashingbuffer沖洗柱子，1,2000rpm離心1min；5）棄廢液后再1,2000rpm離心2min，以除去節(jié)余的washingbuffer；6）把column放到另一干凈的mL離心管，加50μLelutionbuffer，室溫放置2min后，1,2000rpm離心1min以洗脫DNA；4.pET-32a質(zhì)粒的Bam和XHO雙酶切HII酶切系統(tǒng)（10μL系統(tǒng)）：Bam1μLbuffer(HI)BamμLHIXhoIμL質(zhì)粒μL酶切反應(yīng)：37℃水浴中孵化1h；5.甘薯γ合成酶基因膠回收產(chǎn)物的Bam和XHO雙酶切-GCSHII酶切系統(tǒng)（10μL系統(tǒng)）：Bam1μLbuffer(HI)BamHIμLXhoIμLPCR膠回收產(chǎn)物μL酶切反應(yīng)：37℃水浴中孵化1h。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果甘薯γ-GCS基因PCR電泳圖如圖1.其中1為Marker（最大片段2kb），4a為本小組甘薯γ-GCS基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。由圖可知該組各條帶均較光明清楚，模板經(jīng)引物R、F擴(kuò)增后得大小在1575bp左右的目標(biāo)產(chǎn)物，即約，跟Marker比較并進(jìn)行了注明（圖1.紅色框）。另圖中除注明部分以外還出現(xiàn)節(jié)余條帶，但因后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用割膠回收方式獲得γ-GCS基因片段，故其余片段不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成影響。γ-GCS基因左右右圖1.甘薯γ-GCS基因PCR電泳圖。其中編號(hào)1為Marker，4a為本小組γ-GCS基因電泳結(jié)果。紅框已圈出γ-GCS所在條帶地址，大小在左右。六、解析與談?wù)摳适恙?GCS基因PCR電泳結(jié)果由圖1.4a可知，本次甘薯γ-GCS基因PCR較為成功。該產(chǎn)物條帶比較光明，邊緣整齊，但除目的條帶外仍擴(kuò)增出了很多節(jié)余條帶，說明DNA模板存在小部分降解。實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)盡量防范DNAase污染以及機(jī)械剪切力傷害樣品，而操作時(shí)更應(yīng)注意加樣時(shí)間，經(jīng)解析電泳結(jié)果出現(xiàn)非目的基因小片段可能是加樣時(shí)間過長(zhǎng)惹起的。其余，本實(shí)驗(yàn)在電泳時(shí)還可設(shè)計(jì)陰性比較（滅菌去離子水、緩沖液），以使結(jié)果更加完滿。膠回收與雙酶切由于嚴(yán)格依照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行，膠回收與雙酶切均完成較好。此處未以數(shù)據(jù)、圖片表示。七、總結(jié)本次實(shí)驗(yàn)包括PCRγ-GCS基因片段（目的基因）并作電泳檢測(cè)、膠回收純化目的基因以及BamHI、XhoI雙酶切質(zhì)粒與目的基因三個(gè)步驟。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知目的基因擴(kuò)增較為成功，雖有節(jié)余雜質(zhì)出現(xiàn)但條帶依舊清楚、整齊。膠回收時(shí)，溶液放置2min是為使buffer與產(chǎn)物溶液混淆平均并牢固以減少雜質(zhì)影響，最后雙酶切的孵化時(shí)間與溫度是要點(diǎn)，故于操作過程中我們應(yīng)重視細(xì)節(jié)，多領(lǐng)悟才能理解、掌握成功要領(lǐng)。實(shí)驗(yàn)四原核表達(dá)質(zhì)粒成立一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆者B接和轉(zhuǎn)變步驟。二、實(shí)驗(yàn)原理DNA體外連接即在必然條件下，由DNA連接酶催化兩個(gè)雙鏈DNA片段相鄰5’端磷酸、3’端羥基間形成磷酸二酯鍵的過程，DNA分子的連接是在酶切反應(yīng)獲得同種酶互補(bǔ)序列基礎(chǔ)進(jìn)步行的。連接反應(yīng)成功與否，最后的檢測(cè)要轉(zhuǎn)變宿主菌、陽性克隆的精選來確定。質(zhì)粒轉(zhuǎn)變不同樣細(xì)菌有不同樣的轉(zhuǎn)變效率，轉(zhuǎn)變效率的高低與實(shí)驗(yàn)的成敗直接相關(guān)，平時(shí)轉(zhuǎn)變效率可達(dá)105-107轉(zhuǎn)變子/μgDNA，獲得高轉(zhuǎn)化效率的要點(diǎn)是感覺態(tài)細(xì)菌的制備。體外經(jīng)過基因工程手段所成立含目的基因的重組質(zhì)粒，經(jīng)過轉(zhuǎn)變和精選技術(shù)，可獲得含重組子的陽性克隆。在此陽性克隆中，DNA可在生物系統(tǒng)內(nèi)大量擴(kuò)增、生殖、保留及表達(dá)目的基因產(chǎn)物，這是PCR體外擴(kuò)增DNA所不能夠取代的。配合DNA重組技術(shù)所獲得的陽性菌株已廣泛應(yīng)用于科研，醫(yī)藥生產(chǎn)和生物發(fā)酵等領(lǐng)域。三、實(shí)驗(yàn)資料資料甘薯γ-GCS基因酶切片段、載體片段試劑①10×T4DNAligasebuffer；T4DNAligase；③ddH2O；④SOC培養(yǎng)液；⑤bufferBamHI；⑥D(zhuǎn)MSO；⑦TFB溶液(100mmol/LKCl,45mmol/LMnCl2，10mmol/LCaCl2,10mmol/LK-MES；⑧β-巰基乙醇；儀器：10μL和200μL移液槍、的EP管、離心計(jì)、培養(yǎng)皿、電泳儀、37℃培養(yǎng)箱、4℃冷藏室四、實(shí)驗(yàn)方法甘薯γ-GCS基因酶切產(chǎn)物與pET-32a酶切產(chǎn)物的連接連接系統(tǒng)（10μL系統(tǒng)）：10×T4DNAligasebuffer

1μL載體片段

4μLPCR酶切片段

3μLT4DNAligase

μLddH2O

μL連接條件：

16℃連接過夜；2.大腸桿菌感覺態(tài)細(xì)胞的制備1）接種JM109于2mLSOB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜；2）取mL菌液轉(zhuǎn)種于50mLSOB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)h(OD550值約為后，冰浴10min，4,000r/min離心5min，棄上清液；3）加入17mL預(yù)冷的TFB溶液(100mmol/LKCl,45mmol/LMnCl2，10mmol/LCaCl2,10mmol/LK-MES沖洗菌體1次，離心收集菌體；4）加入4mLTFB制成懸液，冰浴10min，加入140μL二甲基亞砜(DMSO)，冰浴上輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)10min，加入140μLβ-巰基乙醇，于冰浴上輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)10min，再加入140μLDMSO，輕輕混勻后在冰浴上靜置5min，即得感覺態(tài)細(xì)胞；連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)變1）在預(yù)冷的EP管中加入1-10μL質(zhì)粒DNA，加入200μL上述感覺態(tài)細(xì)胞，混勻后在冰浴上靜置30min；2）42℃水浴熱沖擊30s，冰浴上放置10min，加入mLSOC培養(yǎng)液。置于37℃振蕩培養(yǎng)1h；3）取mL涂布于加有抗生素的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)過夜。若轉(zhuǎn)變子很少，特別是連接DNA的轉(zhuǎn)變，可將轉(zhuǎn)變細(xì)胞離心3min(4,000r/min)，棄上清液，把全部的菌體涂布在含相應(yīng)抗生素的平板上；4）正放于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)約1h使接種物完滿被吸取，爾后將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12～16h后，將平板移入4℃(冰箱冷藏室)放置數(shù)小時(shí)；4.質(zhì)粒的小量提取：采用試劑盒（PlasmidMiniKitI）方法進(jìn)行提取實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1）使用前，將RNaseA全部加入SolutionI中并于4度保留；2）按下表用無水乙醇稀釋DNAWashBuffer，并于室溫保留；D6942-00,3：加入ml無水乙醇D6942-01,D6943-01：加入80ml無水乙醇D6842-02,D6943-02：每瓶中加入80ml無水乙醇離心操作方案：1）將帶有質(zhì)粒的接種于5mlLB/抗生素培養(yǎng)液中，37°C搖床培養(yǎng)12~16h；2）取~的菌液，室溫下10,000xg離心1min收集細(xì)菌；3）倒棄培養(yǎng)基。加入250ulSolutionI/RNaseA混和液，旋渦振蕩使細(xì)胞完滿懸??；4）往重懸混和液中加入250ulSolutionII，輕輕顛倒混勻4-6次。此操作防范激烈混勻裂解液且裂解反應(yīng)不要高出5min；5）加入350ulSolutionIII，平易顛倒數(shù)次至形成白色絮狀積淀；6）室溫下，≥10,000xg離心10min；7）轉(zhuǎn)移上清液至套有2ml收集管的HiBindDNA結(jié)合柱中，室溫下10,000xg離心1min，倒去收集管中的濾液；8）把柱子重新裝回收集管，加入500ulHBBuffer，按上述條件離心，棄去濾液；9）把柱子重新裝回收集管，加入700ulDNAWashBuffer，按上述條件離心，棄去濾液。注濃縮的DNAWashBuffer在使用從前必定按標(biāo)簽的提示用無水乙醇稀釋；10）棄去濾液，重復(fù)第9步驟一次；11）棄去濾液，把柱子重新裝回收集管，10,000xg離心空柱2min以甩干柱子基質(zhì)。注不要忽略此步――這對(duì)去除柱子中殘留的乙醇至關(guān)重要；12）把柱子裝在干凈的離心管上，加入30-50ulElutionBuffer(10mMTris-HCl,或無菌水到柱子基質(zhì)中，靜置1-2min，10,000xg離心1min洗脫出DNA；重組子的PCR判斷。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：重組質(zhì)粒粗提檢測(cè)如圖1.粗提后均出現(xiàn)了大小不同樣的質(zhì)粒，較小者應(yīng)為pET-32a質(zhì)粒載體以及原有質(zhì)粒，較大者為重組質(zhì)粒，而重組陽性質(zhì)粒則需后續(xù)實(shí)驗(yàn)判斷。其中4a為本小組提取結(jié)果，由于拍照條件不好，最大條帶較模糊（圖中紅色方框圈出），但還可以鑒識(shí)出3條帶。原有質(zhì)粒與pET-32a質(zhì)粒空載體條帶最亮，而成功轉(zhuǎn)變的重組質(zhì)粒條帶相對(duì)黯淡，很難分辨清楚。圖1.重組質(zhì)粒粗提電泳檢測(cè)圖。其中4a為本小組樣品條帶，紅框圈出部分為重組質(zhì)粒，量較少。重組質(zhì)粒PCR檢測(cè)如圖2.所示，2b即本小組實(shí)驗(yàn)條帶，9為Marker條帶（同實(shí)驗(yàn)三）。以大質(zhì)粒為模板，γ-GCS-F、R為引物進(jìn)行PCR，得左右條帶十分清楚，已由圖中標(biāo)出。圖2.重組質(zhì)粒PCR電泳檢測(cè)圖。其中9為Marker條帶，2b由紅箭頭所指為本小組重組質(zhì)粒PCR條帶，大小在左右。六、解析與談?wù)撝亟M質(zhì)粒粗提電泳結(jié)果如圖1.可大體觀察到重組質(zhì)粒的形成，但由于產(chǎn)量較少，重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)變率不好，解析可能是在進(jìn)行目的基因與載體連接時(shí)成功率較低所致。另因圖中無Marker顯示，對(duì)重組質(zhì)粒的條帶確認(rèn)增加了難度，單一完滿pET-32a質(zhì)粒與E.Coli受體菌自己已攜帶質(zhì)粒的電泳條帶可起輔助解析作用，以使電泳結(jié)果更完整。重組質(zhì)粒PCR電泳結(jié)果圖2.2b條帶較為清楚整齊，說明有陽性重組質(zhì)粒形成，轉(zhuǎn)變?yōu)楣Α５珬l帶稍有拖尾現(xiàn)象產(chǎn)生，解析可能是由PCR過程中升溫所以致的質(zhì)粒不規(guī)則變性、斷裂而惹起，并形成了些大小不一的片段，電泳時(shí)呈彌散狀分布于主條帶后，分子量較大。七、總結(jié)本次試驗(yàn)過程中，因酶切判斷結(jié)果不理想而改用PCR判斷。對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行提取時(shí)的機(jī)械力傷害、PCR升溫步驟均可以致質(zhì)粒片段受損，這些失誤在操作或?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)方面都需盡量防范，誠(chéng)然重組質(zhì)粒量較少但其能成功轉(zhuǎn)變受體菌，這也為隨后IPTG引誘目的基因表達(dá)γ-GCS產(chǎn)物打下了必然基礎(chǔ)。多做、多思慮、多總結(jié)，才能于每個(gè)環(huán)節(jié)中學(xué)習(xí)到更多知識(shí)。實(shí)驗(yàn)五甘薯γ-GCS基因的原核表達(dá)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖褂肐PTG引誘外源基因表達(dá)，認(rèn)識(shí)精選原理；掌握SDS檢測(cè)表達(dá)蛋白質(zhì)的原理與方法。二、實(shí)驗(yàn)原理表達(dá)系統(tǒng)是重要的原核表達(dá)系統(tǒng)。在重組基因轉(zhuǎn)變?nèi)刖杲窈?，?jīng)過溫度的控制，引誘其在宿主菌內(nèi)表達(dá)目的蛋白質(zhì)，將表達(dá)樣品進(jìn)行SDS以檢測(cè)表達(dá)蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)采用異丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）引誘外源基因表達(dá)。lacI是大腸桿菌中l(wèi)ac控制子（Operon）的調(diào)治基因，它所表達(dá)的隔斷蛋白是lac控制基因（Operator）的控制因子，控制轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)。當(dāng)有乳糖存在時(shí)，這種隔斷蛋白能與過分的乳糖結(jié)合而失去對(duì)控制基因的控制，使lac控制子上的結(jié)構(gòu)基因lacZ（β-半乳糖苷酶)、lacY（透性酶)、lacA(乙?；D(zhuǎn)移酶）得以正常表達(dá)，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。IPTG（異丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷)作為乳糖的近似物與lacI隔斷蛋白結(jié)合而使控制基因不被控制，因此IPTG經(jīng)常作為lac控制子的引誘劑運(yùn)用于精選。2.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）使用含有十二烷基硫酸鈉（SDS）和還原劑（平時(shí)為巰基乙醇）的樣品辦理液對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行辦理（一般煮沸3-5分鐘），經(jīng)過加熱和SDS能夠使蛋白質(zhì)變性，多亞基的蛋白質(zhì)也將解離為單亞基。SDS是變性劑，它能破碎蛋白質(zhì)分子中的氫鍵和疏水作用。巰基乙醇打開二硫鍵以使蛋白質(zhì)分子處于伸展?fàn)顟B(tài)。蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的遷移率取決于它所帶的凈電荷以及分子大小和形狀等因素。加入SDS（十二烷基磺酸鈉）和少許巰基乙醇，則蛋白質(zhì)分子的遷移率主要取決于它的分子量，而與原來所帶電荷、分子形狀沒關(guān)。電泳過程中分子遷移的規(guī)律為：小分子走在前頭，大分子滯后。電泳凝膠相當(dāng)于凝膠過濾中的一個(gè)帶孔膠粒。四、實(shí)驗(yàn)資料資料已得甘薯γ-GCS基因陽性重組子試劑引誘表達(dá)LB培養(yǎng)基；②SOC培養(yǎng)液；50μg/mLAmp；④IPTG；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳①30%丙烯酰胺凝膠貯液：丙烯酰胺30g，N,N-亞甲雙丙烯酰胺g；4×Tris·Cl/SDSpH：gTris堿溶解于40mL水中，用1mol/L的鹽酸調(diào)pH為后，定容到100mL，再加gSDS；4×Tris·Cl/SDSpH：gTris堿溶解于40mL水中，用1mol/L的鹽酸調(diào)pH為后，定容到100mL，再加gSDS；④樣品緩沖液：1mL4×Tris·Cl/SDS(pH，1gSDS，2mLβ-巰基乙醇，1mL%溴酚蘭，5mL甘油，加蒸餾水定容到50mL；⑤電極緩沖液：gTris堿，g甘氨酸，gSDS；⑥固定液：50%甲醇，10%冰醋酸；⑦染色液：%(w/v)考馬斯亮藍(lán)R-250，50%甲醇，10%冰醋酸；⑧脫色液：7%冰醋酸，5%甲醇；SDSLoadingBuffer；3、儀器電泳儀、染液缸五、實(shí)驗(yàn)方法1.E.coliBL21(DE3)感覺態(tài)的制備；重組子轉(zhuǎn)變BL21；原核表達(dá)1）挑取上述方法獲得的單菌落于2mLLB液體培養(yǎng)基(氨芐青霉素50μg/mL)中。同時(shí)，BL21作為比較（不加抗生素）。于37℃培養(yǎng)至OD600為；2）取20μL菌液接種2mLLB液體培養(yǎng)基(氨芐青霉素50μg/mL),37℃培養(yǎng)OD600為；3）加入IPTG最后濃度梯度2mM，18℃引誘表達(dá)16h；4）引誘結(jié)束后，用超聲波破碎細(xì)胞；5）1mL菌液加入100μL的SDSLoadingBuffer，100℃煮沸5min；6）取30μL上清樣品點(diǎn)樣，解析SDS膠，觀察表達(dá)結(jié)果；按下表配方制備SDS凝膠，加樣。先10mA恒流電泳至分別膠，再調(diào)為mA恒流到電泳結(jié)束；組分丙烯酰胺貯液4×Tris·Cl/SDS,pH4×Tris·Cl/SDS,pH

12%分別膠(mL)--

%濃縮膠(mL)--ddH2O10%過硫酸銨TEMED5.考馬斯亮藍(lán)染色（1）將聚丙烯酰胺凝膠用固定液固定2h；（2）傾去固定液，以考馬斯亮藍(lán)染色液染色4h；3）傾去染色液，加入脫色液，緩慢搖動(dòng)脫色。中間換脫色液，脫色到獲得藍(lán)色條帶及干凈的背景為宜。六