細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)--精子細(xì)胞學(xué)

精子細(xì)胞學(xué)分析低滲膨脹實(shí)驗(yàn)（HOS)

原理：基于完整細(xì)胞膜半滲透性簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)，其引起低滲狀態(tài)下的精子膨脹，即當(dāng)有水流入時(shí)細(xì)胞體積膨脹。

結(jié)果分析：

精子尾部腫脹率=尾部腫脹數(shù)/精子計(jì)數(shù)的總數(shù)

精液標(biāo)本中有60%以上的精子出現(xiàn)尾部腫脹，則認(rèn)為HOS實(shí)驗(yàn)正常。如果尾部腫脹精子數(shù)低于50%，該精液標(biāo)本則被認(rèn)為異常。

方法：取新鮮精液一滴加伊紅Y溶液一滴，于玻片上混合染色lmin后光鏡檢。精子存活率染色原理：

精子存活率是采用染料對(duì)精子進(jìn)行染色，根據(jù)精子是否著色判斷精子的死活。一般精子死亡后，細(xì)胞通透性改變，易于著色。染料通過(guò)精子受損細(xì)胞膜將精子染成紅色，而結(jié)構(gòu)完整的精子則不著色。染色方法：

取新鮮精液一滴加伊紅Y溶液一滴，于玻片上混合染色lmin后光鏡檢查。結(jié)果判定：活精子不著色，死精子著紅色

精子活率（%）=（活精子數(shù)/計(jì)數(shù)精子數(shù)）×100%

計(jì)數(shù)200個(gè)精子，得出活精子百分?jǐn)?shù)冷凍方法

[冷凍原理]

細(xì)胞在冷凍過(guò)程中會(huì)發(fā)生如下變化：當(dāng)細(xì)胞被冷至-5℃時(shí)，因溶液中加有冷凍保護(hù)劑而降低溶液的冰點(diǎn)，細(xì)胞內(nèi)外溶液仍未結(jié)冰；當(dāng)被冷至-5～-15℃之間時(shí)，細(xì)胞外溶液先出現(xiàn)結(jié)冰而細(xì)胞內(nèi)仍保持未結(jié)冰狀態(tài)。細(xì)胞內(nèi)未結(jié)冰的水分子會(huì)比細(xì)胞外部分結(jié)冰溶液中的水分子具有更高的化學(xué)能。其結(jié)果是，細(xì)胞內(nèi)水分子為了和細(xì)胞外水分子保持化學(xué)能的平衡，會(huì)向細(xì)胞外流動(dòng)。

緩凍法是目前成功精子低溫保存常用方法，其原理是在精子冷凍過(guò)程中，隨著溫度不斷下降，細(xì)胞外液中水分結(jié)冰使溶液的濃度升高，細(xì)胞內(nèi)水分通過(guò)細(xì)胞膜滲透至細(xì)胞外，導(dǎo)致自身不斷脫水皺縮，從而減少胞內(nèi)冰晶形成。緩凍法即將精液與保護(hù)劑混合后緩慢降溫至2～4℃(平均0.6～0.8℃min),保持這一溫度冷平衡約20～60分鐘，以1～2℃/min速率降至約-30℃，再以8～10℃/分鐘速率降至-80℃以下，然后直接浸泡于液氮(-196℃)中保存。

速凍法原理是迅速跨過(guò)冰晶期，以減少冰晶對(duì)精子膜損傷作用。速凍法與緩凍法區(qū)別在于降溫前期不做冷平衡，利用液氮蒸汽直接降溫，一般以2～4℃/分鐘速率降溫至-30℃后，再按緩凍法步驟凍存。

精液冷凍保護(hù)劑主要作用是減少冷凍和解凍過(guò)程中細(xì)胞滲透性損傷和減少冰晶形成，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。主要分為滲透性保護(hù)劑(如甘油等)和非滲透性保護(hù)劑(如單糖、卵黃等)。

[精子復(fù)溫速率和復(fù)蘇溫度]復(fù)溫速度越快越好。常規(guī)做法是在37℃水浴中，于1～2分鐘內(nèi)完成復(fù)蘇。細(xì)胞內(nèi)外不會(huì)重新形成較大冰晶，也不會(huì)暴露在高濃度電解質(zhì)溶液中過(guò)長(zhǎng)時(shí)間，從而無(wú)冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇后仍保持其正常結(jié)構(gòu)和功能。復(fù)溫速度過(guò)慢，細(xì)胞內(nèi)往往重新形成較大冰晶而導(dǎo)致細(xì)胞損傷，復(fù)溫時(shí)導(dǎo)致的細(xì)胞損傷非?？欤跇O短時(shí)間內(nèi)發(fā)生。為減輕復(fù)溫過(guò)程中冰晶及滲透腫脹對(duì)精子損害，復(fù)溫速率一般要比冷卻速率高得多，目前常用精子復(fù)溫方法多采用37℃水浴復(fù)溫和室溫復(fù)溫兩種。治療不育癥預(yù)防遺傳病提供“生殖保險(xiǎn)”

預(yù)防性傳播性疾病開(kāi)展低溫生物學(xué)研究冷凍技術(shù)應(yīng)用[冷凍方法]

將精液與保護(hù)劑按1:1混勻后裝入凍存管，封好放入布袋，直接放在液氮面上20cm處，熏蒸20分鐘，然后侵入液氮里。[復(fù)蘇方法]

將凍存的標(biāo)本從液氮取出后直接放入37度水浴5分鐘即可。精子形態(tài)分類頭部缺陷頸部和中段缺陷瑞氏染粉(伊紅美藍(lán))是由伊紅和美藍(lán)混合組成的中性鹽染料，其中伊紅是酸性染料，美藍(lán)是堿性染料。這兩種有色離子可以與細(xì)胞蛋白質(zhì)選擇性的吸附進(jìn)而使細(xì)胞呈現(xiàn)不同的著色，胞漿中的堿性蛋白與伊紅結(jié)合稱嗜酸物質(zhì)，胞核的核蛋白和原始細(xì)胞胞漿等酸性蛋白質(zhì)與美藍(lán)結(jié)合呈紫紅色，稱嗜堿物質(zhì)。吉姆薩染色法對(duì)細(xì)胞核著色較好．結(jié)構(gòu)顯示更清晰，而胞漿和中性顆粒則染色較差，兩者混合染色可兼二者之長(zhǎng)。通過(guò)此方法對(duì)精液涂片染色可清晰的觀察精子形態(tài)和精子頂體。精子瑞氏-吉姆薩染色法實(shí)驗(yàn)步驟

1.精液液化后，取10μl涂片，晾干；95％乙醇固定10min，晾干。2.瑞吉染液臨用前按9：1比例新鮮配制。3.將固定涂片用瑞吉染液染色30～60s，加等量磷酸鹽緩沖液，染色5～8min。（滴染）4.流水沖洗后，染色片子置95％乙醇中2～4s，自然干燥后顯微鏡下觀察。Smearmethod：巴氏染色精子顯微鏡照片6巴氏染色精子顯微鏡照片7巴氏染色精子顯微鏡照片8巴氏染色精子顯微鏡照片9巴氏染色精子顯微鏡照片101.低滲膨脹實(shí)驗(yàn)，取新鮮精液5ul加低滲伊紅Y溶液5ul，于玻片上混合染色lmin后光鏡檢。精子尾部腫脹率=尾部腫脹數(shù)/精子計(jì)數(shù)的總數(shù)。精液標(biāo)本中有60%以上的精子出現(xiàn)尾部腫脹，則認(rèn)為HOS實(shí)驗(yàn)正常。2.精子活率檢測(cè)取新鮮精液5ul加伊紅Y-NaCl溶液5ul，于玻片上混合染色lmin后光鏡檢。精子活率（%）=（活精子數(shù)/計(jì)數(shù)精子數(shù)）×100%?；罹硬恢?，死精子著紅色精子形態(tài)學(xué)檢測(cè)

1.精液液化后，取10μl涂片，晾干；95％乙醇固定10min，晾干。。

2.將固定涂片用瑞吉染液染色30～60s，加等量磷酸鹽緩沖液，染色5～8min。（滴染）

3.流水沖洗后，染色片子