研究生實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞培養(yǎng)課件

組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù).鄂征主編.北京出版社,1995年8月出版細(xì)胞培養(yǎng)

司徒鎮(zhèn)強(qiáng)主編.世界圖書出版公司,1996年出版體外培養(yǎng)的原理和技術(shù).薛慶善

主編.科學(xué)出版社,2001年1月出版動物細(xì)胞培養(yǎng)——基本技術(shù)指南(中譯).章靜波等譯.科學(xué)出版社,2004年10月出版.HumanCellCultureProtocols(2ndEd).Joanna

Picot.HumanaPress,October2004.BasicCellCultureProtocols(3rdEd).CDHelgason,CLMiller.HumanaPress,October2004細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)主要參考資料離心機(jī)櫥柜實(shí)驗(yàn)臺冰箱培養(yǎng)箱試劑柜實(shí)驗(yàn)儀器臺超凈工作臺實(shí)驗(yàn)臺實(shí)驗(yàn)臺實(shí)驗(yàn)臺實(shí)驗(yàn)臺水池冰箱衣柜實(shí)驗(yàn)臺顯微鏡遞物窗緩沖間無菌操作室準(zhǔn)備室1.細(xì)胞培養(yǎng)室設(shè)置細(xì)胞培養(yǎng)前的實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備下風(fēng)口上風(fēng)口無菌操作室超凈工作臺和CO2培養(yǎng)箱2.細(xì)胞培養(yǎng)的主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備超凈工作臺的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動空氣通過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內(nèi)構(gòu)成無菌環(huán)境。

CO2培養(yǎng)箱設(shè)定的條件為37℃，5％CO2

使用CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)注意的問題：①用螺旋口瓶培養(yǎng)細(xì)胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。②保持培養(yǎng)箱內(nèi)空氣干凈。定期消毒③箱內(nèi)蒸餾水槽中預(yù)留滅菌蒸餾水，以保持箱內(nèi)濕度，避免培養(yǎng)液蒸發(fā)。血清（天然成分）：基礎(chǔ)培養(yǎng)基（人工合成）：干粉培養(yǎng)基DMEM、α-MEM、RPMI1640水：高純度的去離子水3.細(xì)胞培養(yǎng)的主要試劑（培養(yǎng)基）抗菌素：通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用，使用濃度為100U/ml血清質(zhì)量好壞是實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細(xì)菌、支原體病毒污染。血清的滅活（消除補(bǔ)體活性）：56℃，30分鐘血清的消毒：過濾除菌血清的使用濃度為5％～20％消化液：常用0.25％胰蛋白酶，使細(xì)胞脫離組織或容器壁，用含血清培養(yǎng)液中止其活性4.細(xì)胞培養(yǎng)用器皿的清洗和消毒一般玻璃器皿的清洗分為四個步驟：1、自來水浸泡2、洗滌劑刷洗(如有必要進(jìn)行超聲處理）3、泡酸（濃硫酸、重鉻酸鉀及蒸餾水）4、流水沖洗過夜，依次用蒸餾水、三蒸水漂洗，最后烘干備用常用消毒方法：1、濕熱滅菌法（高壓蒸汽滅菌），15磅，15～20min2、過濾除菌(如：血清的除菌）

原代培養(yǎng)(primaryculture)，或稱為初代培養(yǎng)，就是從供體取下組織細(xì)胞后在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)，中途不分割培養(yǎng)物。常用的原代培養(yǎng)方法有組織塊培養(yǎng)法和消化培養(yǎng)法。原代培養(yǎng)（PrimaryCulture）細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念傳代培養(yǎng)（SecondlyCulture）

傳代培養(yǎng)(secondlyculture)，在原代培養(yǎng)物鋪展為單細(xì)胞層后，將原代培養(yǎng)細(xì)胞分開接種到兩個或多個新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)增殖。細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念培養(yǎng)細(xì)胞的類型貼附型成纖維樣細(xì)胞型上皮樣細(xì)胞型懸浮型細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)人口腔上皮細(xì)胞培養(yǎng)的骨髓瘤細(xì)胞正常培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線退化死亡平臺期細(xì)胞數(shù)增大極限點(diǎn)，出現(xiàn)接觸抑制細(xì)胞指數(shù)生長極限點(diǎn)指數(shù)生長期潛伏期細(xì)胞數(shù)量024487296120小時指數(shù)生長期是最佳實(shí)驗(yàn)期!實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備取材、分離細(xì)胞原代培養(yǎng)維護(hù)培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)著裝操作者進(jìn)入無菌室前先用肥皂洗凈雙手，然后用1‰新潔爾滅浸泡消毒5分鐘原代培養(yǎng)的一般流程實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備取材、分離細(xì)胞原代培養(yǎng)維護(hù)培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)的一般流程組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)方法消化法單細(xì)胞法半消化法原代培養(yǎng)流程圖：組織塊法取材漂洗剪碎沉降洗滌加液涂布接種接種組織塊原代培養(yǎng)流程圖：組織塊法移入培養(yǎng)箱中（注意貼有組織塊的一面朝上），靜止2～3小時，然后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，繼續(xù)靜止培養(yǎng)。原代培養(yǎng)流程圖：消化法取材漂洗剪碎酶解(單細(xì)胞)離心洗滌加液計數(shù)接種原代培養(yǎng)流程圖：半消化法取材漂洗剪碎酶解(部分酶解)沉降洗滌加液接種（一）獲取小鼠胚胎小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)1.將8周齡的昆白♀鼠和12周齡的昆白♂按1:1比例合籠。次日晨10:00前觀察♀鼠陰道口，有乳白色或蛋黃色膠凍狀物（陰道栓）即定為懷孕0.5天；2.斷頸處死孕13.5天的母鼠，置于蠟盤上。75％酒精消毒后，用普通剪刀和鑷子剪開下腹皮膚，并用兩把彎頭止血鉗夾住切口處的皮膚向頭尾兩側(cè)牽拉即剝皮。用眼科彎鑷和眼科彎剪打開腹腔，暴露出子宮。用眼科彎鑷夾住一側(cè)子宮，分離子宮系膜，眼科彎剪剪斷子宮角和子宮頸，將整個子宮分離下來（注意勿使子宮滑落到腹腔外，避免污染）。將子宮置于無菌濾紙上去除血跡。3.在超凈臺內(nèi)將子宮移入預(yù)先盛有PBS的平皿中，洗滌數(shù)次。將子宮移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科彎剪沿子宮系膜打開子宮，取出帶有胎膜的胎鼠，并用兩把眼科鑷子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。將胎鼠移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科剪和眼科鑷去除胎鼠的頭、四肢和內(nèi)臟，得鼠胚軀干。將鼠胚軀干移至另一盛有PBS的平皿中，用PBS洗滌兩次至無肉眼可見的血色。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)（三）接種培養(yǎng)用移液器吸去培養(yǎng)皿中的多余液體加入適量含20%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液，將組織塊轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)皿（瓶）中，并均勻分布在培養(yǎng)皿（瓶）的底部，做好標(biāo)記（日期、名稱、編號），放入37℃，5％CO2，100％相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞沉淀用適量含20%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)液重新懸浮；利用血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為105個/ml，計算細(xì)胞的存活率（具體實(shí)驗(yàn)步驟見“細(xì)胞計數(shù)與活力檢測”部分）；剩余細(xì)胞懸液用于細(xì)胞凍存實(shí)驗(yàn)（具體見“細(xì)胞的冷凍保存”部分）3.第2-3天可以觀察，組織塊半消化原代培養(yǎng)可見組織碎塊附著于培養(yǎng)瓶（皿）底部，周圍細(xì)胞呈放射狀生長，此時可見有多種細(xì)胞類型，有的是呈梭形的成纖維細(xì)胞，有的是呈圓形的上皮細(xì)胞。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)流程圖處死孕鼠，取出鼠胚去除鼠胚的頭、四肢及內(nèi)臟，PBS清洗剪碎鼠胚軀干，PBS清洗加入適量胰酶消化5min取少量組織于EP管中繼續(xù)消化20min，獲取單細(xì)胞剩余組織加入含血清的1640培養(yǎng)液終止消化倒置顯微鏡下觀察將半消化的組織塊接種至新的培養(yǎng)皿或瓶，并加入新鮮的1640培養(yǎng)液用移液槍反復(fù)吹打消化液，形成單細(xì)胞懸液，吸取少量懸液進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)將原代培養(yǎng)物分割后重新接種到兩個或多個培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，這一操作稱為傳代培養(yǎng),傳代比例為1:3至1:6，依細(xì)胞種類而異.細(xì)胞傳代培養(yǎng)的意義傳代時機(jī)的把握傳代培養(yǎng)的代數(shù)限制；少數(shù)細(xì)胞可出現(xiàn)永生化每一代培養(yǎng)細(xì)胞的生長過程分期退化死亡平臺期細(xì)胞數(shù)增大極限點(diǎn)，出現(xiàn)接觸抑制細(xì)胞指數(shù)生長極限點(diǎn)（MI、細(xì)胞群體倍增時間）指數(shù)生長期潛伏期細(xì)胞數(shù)量024487296120小時吸去舊液加入消化液解離細(xì)胞約2min在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈圓粒狀細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：貼附型PBS洗滌1~2次吹打懸浮細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度

分裝接種，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中加入適量含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞的觀察細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：貼附型培養(yǎng)細(xì)胞的觀察培養(yǎng)液顏色、是否清亮培養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)：貼附型吸去舊液加入消化液解離細(xì)胞約5min在倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈圓粒狀PBS洗滌1~2次吹打懸浮細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度

分裝接種，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)在培養(yǎng)瓶中加入適量含血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞的觀察胰酶消化數(shù)分鐘細(xì)胞脫離器壁，