生物化學(xué) 實(shí)驗(yàn)七 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)七酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

Experimentsonkineticsofenzyme-catalyzedreactions

實(shí)驗(yàn)?zāi)康牧私夥止夤舛确ǖ脑?；熟練使用分光光度?jì)；通過(guò)實(shí)驗(yàn)加深關(guān)于PH對(duì)酶活性影響的理解；明確酶作用的最適PH的概念及其緣故；學(xué)習(xí)和掌握米氏常數(shù)（Km）的測(cè)定原理和實(shí)驗(yàn)方法；驗(yàn)證競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響。。1.底物濃度[S]2.酶的濃度[E]3.溫度[T]4.pH5.酶的激活劑6.酶的抑制劑[I]

酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué):影響酶促反應(yīng)速率(V)的因素:

酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究對(duì)象是酶促反應(yīng)速率和各種因素對(duì)它的影響。實(shí)驗(yàn)原理（一）底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響

當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí),V隨[S]的增大而急劇上升,兩者成正比關(guān)系.隨著底物濃度繼續(xù)增加,反應(yīng)速率增加,而幅度不斷下降,若繼續(xù)加大[S]反應(yīng)速度率就不再增加,達(dá)到一個(gè)極限值Vmax.Vmax[S](V)[S]與V的關(guān)系:米-曼氏方程Vmax--最大速率

Km--米氏常數(shù)當(dāng)V＝1/2Vmax時(shí)，KmKm值是當(dāng)酶反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率一半時(shí)的底物濃度;k2k3

時(shí)Km可用來(lái)表示酶對(duì)底物的親和力大小，Km與酶對(duì)底物親和力大小成反比。＝［S］Km值的物理意義:Km和Vmax值的測(cè)定(1)測(cè)定不同底物濃度的反應(yīng)初速率，以V-[S]作 圖可以得到Vmax，再?gòu)?/2Vmax，可求得相應(yīng)的 [S]，即Km值。Vmax?Vmax[S]vKm(2)雙倒數(shù)作圖法：將米氏方程式兩側(cè)取雙倒 數(shù)，以1/V-1/[S]作圖，得出一直線.Km和Vmax值的測(cè)定（二）抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響

酶的抑制劑：類型可逆性不可逆性競(jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制反競(jìng)爭(zhēng)性抑制

使酶的活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)。可逆性抑制作用的動(dòng)力學(xué)比較

作用特點(diǎn)無(wú)抑制劑

競(jìng)爭(zhēng)性抑制非競(jìng)爭(zhēng)性抑制

反競(jìng)爭(zhēng)性抑制與I結(jié)合組分動(dòng)力學(xué)參數(shù)表觀Km表觀VmKmVmEVmE、ESKmES

本次實(shí)驗(yàn)方案酶：堿性磷酸酶AKP底物：磷酸苯二鈉

1.觀察[S]與V之間的關(guān)系2.觀察抑制劑的作用3.最適pH

抑制劑：磷酸氫二鈉C6H5NH3C-NH3C-CC-NH2C=O

H3C-NOH+

C6H5NH3C-NH3C-CC-N=

C=O

H3C-NOK3Fe(CN)6OH-4-氨基安替比林醌衍生物O-P=OONaONa磷酸苯二鈉+

H2OAKPOHHO-P=OONaONa+

酚

醌衍生物為紫紅色,利用分光光度計(jì)測(cè)出紫紅色溶液的深淺，即光吸收值（A）,A與產(chǎn)物的濃度成正比，而產(chǎn)物的濃度可以代表著酶促反應(yīng)速率。分光光度法CONCEPT應(yīng)用分光光度計(jì)測(cè)定溶液的吸收光譜及其對(duì)某一波長(zhǎng)光線吸收能力，是對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性或定量檢查的方法。實(shí)驗(yàn)原理分光光度法分類紫外與可見(jiàn)光分光光度法比色分析法紅外光譜法熒光光度法化學(xué)發(fā)光分析法了解內(nèi)容定性檢測(cè)1.核酸2.蛋白質(zhì)定量檢測(cè)紫外分光光度法

比色分析法

許多物質(zhì)本身具有一定的顏色，也有許多物質(zhì)本身無(wú)顏色在加入適當(dāng)?shù)娘@色劑后生成有色物質(zhì)。

溶液濃度越大，顏色越深。因此可以利用比較溶液顏色深淺的方法來(lái)測(cè)定有色溶液的濃度。

可見(jiàn)光光度法：用可見(jiàn)光光源測(cè)定有色物質(zhì)也稱為比色分析法。SPECTROPHOTOMETER光源單光色器吸收杯光電放大器STRUCTURE分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)待測(cè)液(濃度C)入射光強(qiáng)度I0單色光器出射光強(qiáng)度I光杯厚度L-lgI/I0=KCLA=T(Transmittance,透光率)=I/I0PercentT=I/I0x100(百分透光率)A(Absorbance,消光度,吸光度)=-lgTA=-lgT=-lgI/I0=kcl則即A=kclA為消光度(吸光度)AbsorbanceA=OD（光密度）

=opticaldensityL:比色杯厚度DepthofsolutionC:溶液濃度Concentrationofabsorbingsolution

K:消光系數(shù)ExtinctioncoefficientA=-lgI/I0=KCLLambert-Beer定律K、L不變A1=KC1LA2=KC2L即：A1/A2=C1/C2A=KCL

溶液的顏色和光吸收的關(guān)系溶液的顏色，是由于不同的有色物質(zhì)有選擇地吸收某種顏色的光而引起的。溶液呈現(xiàn)的顏色是與它吸收的光互補(bǔ)的光的顏色。溶液吸收的光越多，呈現(xiàn)的顏色越深。光的互補(bǔ)色示意圖(/nm)綠500~580nm黃580~600nm紫400~450nm白光青490~500nm橙600~650nm紅650~750nm藍(lán)450~480nm青藍(lán)480~490nm操作步驟（一）1.首先按照下表加樣基質(zhì)液即底物溶液（含有磷酸苯二鈉）表1（加入酶液立即計(jì)時(shí)，迅速混勻）快，準(zhǔn)

37℃水浴15分鐘

加入0.5Mol/LNaOH1.0ml(迅速混勻，終止反應(yīng))

加入0.5％鐵氰化鉀2.0ml.(氧化作用)，充分混勻

室溫放置10分鐘

510nm比色，測(cè)定OD值(6號(hào)管校正零點(diǎn))加入0.3％4－氨基安替比林1.0ml

結(jié)果處理：以pH值為橫坐標(biāo),吸光度A為縱坐標(biāo)繪圖,描述pH值對(duì)酶促反應(yīng)速率影響，找出該酶的最適pH。

表2操作步驟（二）1.首先按照下表加樣（加入酶液立即計(jì)時(shí)，迅速混勻）快，準(zhǔn)

37℃水浴15分鐘

加入0.5Mol/LNaOH1.0ml(迅速混勻，終止反應(yīng))

加入0.5％鐵氰化鉀2.0ml.(氧化作用)，充分混勻

室溫放置10分鐘

510nm比色，測(cè)定OD值(6號(hào)管校正零點(diǎn))加入0.3％4－氨基安替比林1.0ml

結(jié)果處理：

根據(jù)A值,計(jì)算不同底物濃度時(shí)酶的反應(yīng)速度（以產(chǎn)物的生成量表示）,以1/V-1/[S]雙倒數(shù)作圖，獲得Km值。表3操作步驟（三）1.首先按照下表加樣（加入酶液立即計(jì)時(shí)，迅速混勻）快，準(zhǔn)

37℃水浴15分鐘

加入0.5Mol/LNaOH1.0ml(迅速混勻，終止反應(yīng))

加入0.5％鐵氰化鉀2.0ml(氧化作用)，充分混勻

室溫放置10分鐘

510nm比色，測(cè)定OD值(6號(hào)管校正零點(diǎn))加入0.3％4－氨基安替比林1.0ml

結(jié)果處理：

根據(jù)A值,計(jì)算不同底物濃度時(shí)酶的反應(yīng)速度（以產(chǎn)物的生成量表示）,林-貝氏雙倒數(shù)作圖,根據(jù)圖形判斷該抑制劑是對(duì)AKP是何種抑制方式。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的處理1.以pH值為橫坐標(biāo),吸光度A值為縱坐標(biāo)繪圖,描述pH值對(duì)酶促反應(yīng)速率影響，找出該酶的最適pH。2.根據(jù)Linewever-Burk方程作圖求出Km值。3.根據(jù)林－貝氏作圖法求出有競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑存在情況下的酶促反應(yīng)的表觀Km值，并判斷本次實(shí)驗(yàn)為何種類型的抑制作用。[作圖]1/[S]1/V-1/Km

根據(jù)圖獲得Km,并判斷磷酸氫二鈉為何種抑制劑.1/Vmax加樣器的正確使用移液管的正確使用（特別注意每種試劑的專用管不可混用）加樣量的準(zhǔn)確性溫度與時(shí)間的準(zhǔn)確性分光光度計(jì)的校準(zhǔn)和使用注意事項(xiàng)

開(kāi)啟電源，儀器預(yù)熱20分鐘。波長(zhǎng)調(diào)至測(cè)試用波長(zhǎng)（510nm）。將比色皿架處于空白管位置，打開(kāi)試樣室蓋，選擇“T”檔，調(diào)節(jié)“0”按鈕，使數(shù)字顯示為“0.00”。蓋上試樣室蓋，使光電管受光，調(diào)節(jié)透過(guò)率“100%”按鈕，使數(shù)字顯示為“100.0”。吸光度的測(cè)量，將選擇開(kāi)關(guān)置于“A”，調(diào)節(jié)吸光度調(diào)零按鈕，使數(shù)字顯示為"0.00"，然后將被測(cè)樣品移入光路，顯示值即為被測(cè)樣品的吸光度值。分光光度計(jì)使用方法1.比色杯光學(xué)表面不能有任何污

損，否則會(huì)引起光吸收的增加。3.裝液量不能超過(guò)2/3,用前潤(rùn)洗.2.比色杯的外表面應(yīng)以高質(zhì)量的柔軟擦鏡紙或綢布擦干凈，不能使用易磨損比色杯的濾紙。4.任何液體不能滴落和污染儀器比色杯的使用和清洗1.可以一人做無(wú)抑制劑的，另一人做有抑制劑的實(shí)驗(yàn)。2.取樣量準(zhǔn)確,保溫準(zhǔn)確，加樣順序要一致，每步均混勻。3.同一組實(shí)驗(yàn)用相同的比色計(jì)。4.作圖時(shí),實(shí)驗(yàn)點(diǎn)不在同一條直線上時(shí),盡量使各點(diǎn)平均分布在直線的兩側(cè),兩圖畫(huà)在同一坐標(biāo)紙上,便于判斷。注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論結(jié)論實(shí)驗(yàn)報(bào)告

酶是由生物細(xì)胞合成的以蛋白質(zhì)為主要成分，對(duì)底物起高效催化作用的生物催化劑。

還有一類具有催化作用的核酸-核酶（ribozyme）

酶的概念酶－底物復(fù)合物（中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)）1、中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)：

E+SESE+P2、酶與底物結(jié)合特點(diǎn)：（1）可逆的、非共價(jià)的結(jié)合；（2）底物只與酶的活性中心結(jié)合；（3）酶與底物結(jié)合是通過(guò)一種稱為誘導(dǎo)契合模式進(jìn)行的。k1k2k3

酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

概念：研究酶促反應(yīng)速率及其影響因素。反應(yīng)速率：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)底物減少或產(chǎn)物增加的速率，常用初速率來(lái)衡量。產(chǎn)物0時(shí)間初速率酶促反應(yīng)速率逐漸降低酶促反應(yīng)的時(shí)間進(jìn)展曲線影響酶促反應(yīng)速度的因素：底物濃度[S]酶濃度[E]TpH值抑制劑激活劑一、底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響

vVm0.30.2Vm20.1012345678[S][S]與v關(guān)系：當(dāng)[S]很低時(shí)，[S]與v成比例--一級(jí)反應(yīng)當(dāng)[S]較高時(shí)，[S]與v不成比例當(dāng)[S]很高時(shí)，[S]，v不變--零級(jí)反應(yīng)[S]vKmVm2v=（Vm/Km）[S]v=Vm=K3[E]

底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響V=Vmax[S]Km+[S]（一）矩形雙曲線：(二)米---曼氏方程

（Michaelis-Mentenequation）V=Vmax[S]Km+[S]1、米-曼氏方程解釋：當(dāng)[S]Km時(shí)，v=(Vmax/Km)[S],即v正比于[S]當(dāng)[S]Km時(shí)，vVmax,即[S]而v不變（三）Km與Vmax的意義1、Km值等于最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度；2、k2k3

時(shí)Km可用來(lái)表示酶對(duì)底物的親和力大小，Km與酶對(duì)底物親和力大小成反比；3、Km值是酶的特征性常數(shù)之一，Km值范圍在10-6~10-2mol/L4、Vmax是酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，與酶濃度呈正比；5、k3為酶的轉(zhuǎn)換數(shù)：當(dāng)酶被底物充分飽和時(shí)，單位時(shí)間內(nèi)每個(gè)酶分子（或活性中心）催化底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的分子數(shù)。1~104/s（四）Km值與Vmax值測(cè)定1、雙倒數(shù)作圖法又稱林-貝氏作圖法（1934）

1=

Km

1+1VVmax[S]Vmax1/V-1/Km01/[S]斜率=Km/Vmax1/Vmax酶的最適pH:酶催化活性最高時(shí)的pH。2810pH酶的活性

pH對(duì)某些酶活性的影響A:胃蛋白酶;B:葡萄糖-6-磷酸酶四、pH對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響AB一些酶的最適pH值

酶最適pH胃蛋白酶1.8過(guò)氧化氫酶7.6胰蛋白酶7.7延胡索酸酶7.8核糖核酸酶7.8精氨酸酶9.8五、抑制劑對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響抑制作用:直接或間接地影響酶的活性中心,使酶活性降低或喪失。抑制劑：凡能降低酶活性而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)。一、不可逆抑制（irreversibleinhibition）

抑制劑與酶的必需基團(tuán)以牢固的共價(jià)鍵結(jié)合,使酶喪失活性,不能用透析超濾等物理方法除去抑制劑使酶恢復(fù)活性.

SH

SE+Hg2+EHg+2H+

SH

S

SHClSE+As-CH=CHClEAs-CH=CHCl+2HCl

SHClS巰基酶路易士氣例1：巰基酶的抑制二、可逆抑制(reversibleinhibition)

抑制劑與酶以非共價(jià)鍵疏松結(jié)合引起酶活性的降低活喪失,結(jié)合是可逆的,能夠通過(guò)透析、超濾等物理方法使酶恢復(fù)活性。可逆抑制類型：競(jìng)爭(zhēng)性抑制(competitiveinhibition)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制（non-competitiveinhibition）反競(jìng)爭(zhēng)性抑制（uncompetitiveinhibition）(一)競(jìng)爭(zhēng)性抑制(competitiveinhibition)

概念競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的結(jié)構(gòu)與底物結(jié)構(gòu)相似，與底物競(jìng)爭(zhēng)同一種酶的活性中心,從而影響E與S的結(jié)合。SSEEIIEE+P無(wú)I

有I

競(jìng)爭(zhēng)性抑制的底物濃度曲線v

競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用過(guò)程[S]

競(jìng)爭(zhēng)性抑制的動(dòng)力學(xué)方程:v=Vmax[S]Km(1+[I]/Ki)+[S]1v=KmVmax(1+)+[I]Ki1[S]1Vmax

競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特征曲線：[I]無(wú)[I]1v1[S]1Vmax-1Km(1+)[I]Ki-1Km競(jìng)爭(zhēng)性抑制的特點(diǎn)：I與S分子結(jié)構(gòu)相似；Vmax不變，表觀Km增大；抑制程度取決于I與E的親和力，以及[I]和[S]的相對(duì)濃度比例。（二）非競(jìng)爭(zhēng)性抑制（non-competitiveinhibition）

概念

抑制劑與酶分子活性中心以外的其它部位結(jié)合而抑制酶活性，I和S與酶結(jié)合不存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用過(guò)程