一測多評法測定丹參藥材中4種丹參酮類成分的含量-中草藥

一測多評法測定丹參藥材中4種丹參酮類成分的含量藍天鳳[收稿日期][基金項目]國家自然科學(xué)基金項目(20872083)；山東省科技攻關(guān)項目（2009GG2001021-16）；中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所科研基金項目(ZZ20090107)[通訊作者[收稿日期][基金項目]國家自然科學(xué)基金項目(20872083)；山東省科技攻關(guān)項目（2009GG2001021-16）；中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所科研基金項目(ZZ20090107)[通訊作者]于宗淵，研究員，碩士生導(dǎo)師，TelE-mail:yuzys@(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟南，250355；2.山東省分析測試中心濟南，250014；3.山東省中醫(yī)藥研究院，濟南，250014)[摘要]目的：建立測定丹參藥材中4種丹參酮類成分含量的一測多評法。方法：采用HPLC法，以丹參酮ⅡA為對照品，用外標(biāo)法測定其在丹參藥材中的含量，同時測定丹參酮ⅡA與丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮的相對校正因子，用獲得的相對校正因子計算后3種成分的含量，實現(xiàn)一測多評；用外標(biāo)法測定丹參藥材中丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和二氫丹參酮的含量，比較其與采用相對校正因子計算值之間的差異。結(jié)果：各相對校正因子重現(xiàn)性良好；各成分采用相對校正因子計算的含量值與外標(biāo)法測定值之間無顯著性差異。結(jié)論：一測多評法的適用性和可行性在丹參藥材4種丹參酮類成分的含量測定中得到驗證。[關(guān)鍵詞]丹參；丹參酮；一測多評法；校正因子QuantitativeanalysisoffourtanshinonesinrootandrhizomeofSalviamiltiorrhizawithonemarkerLANTianfeng1,WANGXiao2,WANGDaijie2,WANGLiang3,LIUQing3,YUZongyuan3*(1.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan,250355;2.ShandongAnalysisandTestCenter,Jinan,250014;3.ShandongAcademyofChineseMedicine,Jinan,250014)[Abstract]Objective:Todevelopamethodforsimultaneousdeterminationof4tanshinonesinrootandrhizomeofSalviamiltiorrhizabymeansofquantitativeanalysisofmulti-componentswithsinglemarker(QAMS).Method:TanshinoneⅡAwasselectedasthemarker.Therelativecorrectionfactors(RCF)oftanshinoneI,cryptotanshinoneanddihydrotanshinonetothemarkerwerecalculatedbyHPLC.Thecontentsofthe4tanshinonesin10samplesofrootandrhizomeofSalviamiltiorrhizaweredeterminedbybothexternalstandardmethodandtheQAMSmethod.ThevalidityoftheQAMSmethodwasevaluatedbycomparisonofthetwoquantitativeresults.Result:TheRCFhadgoodreproducibility.Nosignificantdifferencesbetweenthequantitativeresultsobtainedbythetwomethodswereobserved.Conclusion:ThepracticabilityofQAMSmethodhasbeenverifiedinthequantitativeanalysisof4tanshinonesinrootandrhizomeofSalviamiltiorrhiza.[Keywords]rootandrhizomeofSalviamiltiorrhiza;tanshinone;quantitativeanalysisofmulti-componentswithsinglemarker;relativecorrectionfactor如何有效地評價中藥質(zhì)量是中藥現(xiàn)代研究面臨的關(guān)鍵問題之一。中藥成分復(fù)雜，現(xiàn)行的用1～2種化學(xué)成分評價中藥質(zhì)量的模式，無法表征中藥化學(xué)成分的整體性和復(fù)雜性，不能有效地評價中藥的質(zhì)量[1]。因此，應(yīng)逐步建立采用多指標(biāo)成分評價中藥質(zhì)量的新模式。但由于采用多指標(biāo)成分評價中藥質(zhì)量需要有足夠數(shù)量的化學(xué)對照品，致使其在實際應(yīng)用中受到限制。針對這一矛盾，王智民等提出了中藥質(zhì)量評價“一測多評”的新思路[2]，即只采用1個對照品（供應(yīng)充足、容易獲得者），來實現(xiàn)對多個成分(對照品不能充足供應(yīng)者)的同步測定，并已成功運用于人參、三七、黃芩、吳茱萸等藥材中多種成分的含量測定[3-5]。丹參為唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖，是臨床常用大宗中藥材之一。丹參藥材因品種、產(chǎn)地、采收期等的不同，致使其所含主要成分差異較大[6]，因此應(yīng)嚴格控制丹參藥材的質(zhì)量。目前已有以多個丹參酮類成分的同步測定來評價丹參質(zhì)量的相關(guān)報道[7]，但這種方法目前還難以推廣應(yīng)用，主要是由于丹參中這類成分的對照品供應(yīng)不足。筆者受“一測多評”思路的啟發(fā)，采用HPLC法，建立了以丹參酮ⅡA為對照品，同步測定丹參藥材中丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和二氫丹參酮4種成分含量的一測多評法?，F(xiàn)將方法和結(jié)果報道如下：1儀器與試藥Agilent1200系列高效液相色譜系統(tǒng)，Waters600-996高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱Shim-packPREP-ODS(H)KITC18(4.6mm×250mm,5μm),WelchMaterialC18(4.6mm×250mm,5μm),AmethystC18-P(4.6mm×250mm,5丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮對照品均為自制，經(jīng)HPLC面積歸一化法測定，純度均大于98%。乙腈為色譜純（山東禹王實業(yè)有限公司），水為超純水，其他試劑均為分析純。10批丹參藥材樣品分別購自濟南市中魯醫(yī)院、中山大藥房、一笑堂大藥房、泉城大藥房、金日大藥房、澤生大藥房、魯醫(yī)南苑大藥房、漱玉平民大藥房、齊魯大藥房和神農(nóng)本草大藥房。經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院于宗淵研究員鑒定均為唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根及根莖。2方法與結(jié)果2.1色譜條件色譜柱Shim-packPREP-ODS(H)KITC18（4.6mm×250mm,5μm)，流動相乙腈-0.2%乙酸（55∶45），流速1.0mL·min-1，柱溫30℃，檢測波長270nm。在該色譜條件下，各待測成分分離度良好，AAB123412341.二氫丹參酮；2.隱丹參酮；3.丹參酮Ⅰ；4.丹參酮ⅡA圖1混合對照品（A）和丹參藥材樣品（B）HPLC圖2.2對照品溶液的制備分別取丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，配制成含丹參酮ⅡA0.03mg·mL-1、丹參酮Ⅰ0.04mg·mL-1、隱丹參酮0.03mg·mL-1、二氫丹參酮0.005mg·mL-1的混合對照品溶液，置棕色瓶內(nèi)，避光保存。2.3供試品溶液的制備取丹參藥材粉末（過60目篩）約0.3g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，加熱回流1小時，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，用0.45μm的微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液，2.4線性范圍考察取2.2項下制備的混合對照品溶液，準確稀釋1、4、8、12、16、20倍，配制成系列濃度的混合對照品溶液，每個濃度分別進樣10μL，以各對照品的進樣量對峰面積積分值進行回歸處理，得丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮的回歸方程及相關(guān)系數(shù)r，結(jié)果表明，各對照品的進樣量與峰面積積分值均呈良好的線性關(guān)系，見表1。表1線性范圍考察結(jié)果成分回歸方程r線性范圍μg丹參酮ⅡAY=1457.2C0.99950.015-0.30丹參酮ⅠY=1348.1C+3.61640.99970.020-0.40隱丹參酮Y=1575.1C-9.66650.99900.015-0.30二氫丹參酮Y=254.63C+0.75280.99920.0025-0.0502.5色譜系統(tǒng)精密度試驗取同一供試品溶液，連續(xù)進樣6次，每次10μL。計算丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮峰面積的RSD依次為0.31%、0.43%、0.68%、0.38%。2.6供試品溶液穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，分別于室溫避光放置0、4、8、12，16、20、24h時進樣，計算丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮峰面積的RSD依次為0.40%、0.30%、1.1%、1.4%，表明供試品溶液于室溫避光放置24h內(nèi)穩(wěn)定。2.7方法重復(fù)性試驗取丹參藥材(濟南中山大藥房)粉末(過60目篩)6份，每份約0.3g，精密稱定，按2.3項下的方法制備各供試品溶液，測得其中丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮含量的平均值依次為3.15mg·g-1、1.68mg·g-1、1.13mg·g-1、0.297mg·g-1，RSD依次為1.3%、1.2%、1.6%、1.1%。2.8加樣回收試驗取2.7項下的丹參藥材粉末6份，每份約0.15g，精密稱定，按各成分在藥材中的含量分別加入計算量的對照品，按2.3項下的方法制備各供試品溶液，測定其中各成分的含量，分別計算加樣回收率。結(jié)果丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮的平均回收率依次為99.5%、96.8%、98.7%、99.6%。RSD依次為1.6%、1.3%、0.90%、2.9相對校正因子重現(xiàn)性考察取2.4項下配制的系列濃度的混合對照品溶液，每個濃度分別進樣10μL。以丹參酮ⅡA為內(nèi)標(biāo)，分別計算丹參酮ⅡA對丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和二氫丹參酮的相對校正因子，取平均值。分別考察了Waters600-996和Agilent1200系列兩種高效液相色譜系統(tǒng)和Shim-packPREP-ODS(H)KITC18(4.6mm×250mm,5μm),WelchMaterialC18(4.6mm×250mm,5μm),AmethystC18-P(4.6mm×250mm,5μm)3種色譜柱測得的各相對校正因子的重現(xiàn)性，結(jié)果表明，不同儀器及不同色譜柱所測得的各成分的相對校正因子無表2相對校正因子重現(xiàn)性考察結(jié)果(n=6)儀器色譜柱相對校正因子Waters600Shim-packPREP-ODS(H)KITC180.7330.8270.636WelchMaterialC180.7540.8230.613AmethystC18-P0.7530.8200.633Agilent1200Shim-packPREP-ODS(H)KITC180.7470.8250.634WelchMaterialC180.7500.8340.634AmethystC18-P0.7520.8210.638平均值0.7480.8250.631RSD1.0%0.63%1.4%2.10待測成分色譜峰定位參數(shù)考察為了在僅采用丹參酮ⅡA為對照品時，能夠確認丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和二氫丹參酮色譜峰的位置，從而通過獲得的相對校正因子同時計算后3種成分的含量，達到一測多評的目的，分別考察了采用不同儀器系統(tǒng)和不同色譜柱時其他待測成分色譜峰與丹參酮ⅡA色譜峰間的保留時間差和相對保留時間兩個參數(shù)。結(jié)果表明，其他待測成分與丹參酮ⅡA保留時間差的RSD在1.7%～2.0%，相對保留時間的RSD在0.61%～1.7%，見表3、表4?？梢?，與丹參酮ⅡA色譜峰間的保留時間差和相對保留時間均可作為其他3個待測成分色譜峰的定位參數(shù)，相對保留時間較保留時間差的變異更小。表3保留時間差考察結(jié)果儀器色譜柱保留時間差Waters600Shim-packPREP-ODS(H)KITC1823.0724.7635.39WelchMaterialC1822.6923.9634.43AmethystC18-P22.9924.8835.53Agilent1200Shim-packPREP-ODS(H)KITC1822.2624.5334.65WelchMaterialC1821.9423.8633.96AmethystC18-P22.2424.4734.94平均值22.5424.4934.82RSD2.0%1.8%1.7%表4相對保留時間考察結(jié)果儀器色譜柱相對保留時間Waters600Shim-packPREP-ODS(H)KITC180.5470.5140.305WelchMaterialC180.5490.5240.314AmethystC18-P0.5490.5120.303Agilent1200Shim-packPREP-ODS(H)KITC180.5520.5060.303WelchMaterialC180.5550.5040.311AmethystC18-P0.5550.5160.301平均值0.5510.5130.306RSD0.61%1.4%1.7%2.11樣品測定結(jié)果對10批丹參藥材中4種丹參酮類成分進行了測定，分別采用一測多評法和外標(biāo)法計算其中丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮和二氫丹參酮的含量，見表5。數(shù)據(jù)表明，兩種方法所得結(jié)果無顯著性差異。表5樣品測定結(jié)果（mg.g-1）樣品編號樣品來源丹參酮IIA丹參酮I隱丹參酮二氫丹參酮bababab1中魯醫(yī)院1.690.7510.7500.5900.5920.2190.2202中山大藥房3.101.641.651.081.120.2970.2993一笑堂大藥房2.711.381.390.6800.6770.2180.2194泉城大藥房1.910.8890.8910.6310.6300.3080.3105金日大藥房1.840.9760.9800.6790.6750.2740.2766澤生大藥房3.832.052.071.591.520.3600.3627魯醫(yī)南苑大藥房1.570.7810.7810.5080.5150.2330.2348漱玉平民大藥房1.640.6560.6540.4170.4310.1730.1739齊魯大藥房3.262.042.051.291.240.3460.34810神農(nóng)本草大藥房1.690.5730.5700.5800.5780.1530.153注:a一測多評法計算結(jié)果；b外標(biāo)法測定結(jié)果。3討論本文采用HPLC法，以丹參酮ⅡA為對照品，用外標(biāo)法測定了其在丹參藥材中的含量，同時測定丹參酮ⅡA與丹參酮Ⅰ、隱丹參酮、二氫丹參酮的相對校正因子，然后用獲得的相對校正因子計算丹參酮Ⅰ、隱丹參