當(dāng)歸滴丸藥效學(xué)研究

當(dāng)歸滴丸的主要藥效學(xué)、急性和長期毒性01方向李晶對局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用分組、給藥Wastar大鼠60只隨機(jī)分成6組，每組10只，分別為：生理鹽水組(等容積)、模型組(等容積)、

高劑量當(dāng)歸揮發(fā)油組(100mg/kg/d)、中劑量當(dāng)歸揮發(fā)油組(75mg/kg/d)、低劑量當(dāng)歸揮發(fā)油組(50mg/kg/d)、陽性對照組(藁本內(nèi)酯20mg/kg/d)，灌胃給藥7d，每天2次，于最后一次給藥1h后造模。造模參照Zealonga線栓法10％的水合氯醛(3.5mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，頸部正中切口，逐層分離暴露右側(cè)頸總動脈，于頸外動脈分叉處做切口置入2～0魚線(頭端加熱呈直徑約0.3mm的圓球形)，插入約18～20mm至大腦前動脈起始端，阻斷大腦中動脈血流。以絲線結(jié)扎頸總動脈遠(yuǎn)端固定魚線。逐層縫合切口，魚線殘端留置切口外約5mm，再灌注時(shí)，將魚線拔出約10mm。假手術(shù)組暴露出MCA后縫合即可，術(shù)中維持大鼠肛溫37℃左右，對不符合要求的大鼠剔除，補(bǔ)充所缺。缺血45min后,再灌注2h，觀察以下指標(biāo)。腦損傷大鼠神經(jīng)功能缺損評分于造模后及殺檢前分別對各組造模大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分。評分參照Bederson的方法稍加改進(jìn):(1)提起鼠尾，觀察前肢有無異常表現(xiàn)。凡有左前肢內(nèi)收、內(nèi)旋者，視其輕重評為1～3分。如果大鼠表現(xiàn)為軀體向左側(cè)旋轉(zhuǎn)，評為4分。(2)將大鼠置于金屬網(wǎng)上，向后輕拉鼠尾，觀察大鼠兩前肢肌張力。根據(jù)其左前肢肌力下降程度評為0～2分。(3)將大鼠置于光滑平面上，觀察側(cè)向推擋阻力。根據(jù)向左側(cè)推擋阻力下降程度評為0～2分。(4)大鼠出現(xiàn)左眼上瞼下垂、左眼分泌物增多者評為2分?？偡譃?0分，得分越高，行為障礙越嚴(yán)重，評分采用雙盲法。腦損傷大鼠血清中NO、NOS、SOD、MDA和GSH—Px活性測定大鼠達(dá)再灌注時(shí)限時(shí)，股動脈取血4mL，以3000r/min離心10min，分離血清，置－20℃冰箱凍存，用比色法按照試劑盒說明書檢測NO、NOS、MDA含量，以及SOD和GSH—Px酶活性NF—kB免疫組化的檢測制備大鼠(MCAO)模型并分組、給藥。再灌后24h，用水合氯醛麻醉大鼠，開胸暴露心臟，將穿刺針經(jīng)左心室插入升主動脈，切開右心耳，依序用37℃生理鹽水，4%多聚甲醛灌注，然后斷頭取出大腦組織置10%中性福爾馬林中，常溫固定12h，行梯度乙醇脫水,常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為5μm。切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測相關(guān)炎性因子NF—kB。切片于60℃烘烤一晚，逐一放入二甲苯、100%、95%、80%、70%乙醇進(jìn)行脫蠟和脫水，60℃烘烤30min，用去離子水兩次漂洗，置于3%H2O2避光封閉20min。去離子水漂洗3次后，將切片置pH6枸櫞酸緩沖液中，采用微波加熱方式修復(fù)抗原。修復(fù)完全后，以pH7.2PBS兩次漂洗，吸盡切片上多余的液體，加5%BSA進(jìn)行封閉(封閉需在37℃飽和PBS中2h)。取出切片，甩去多余的液體，加入一抗(一抗由pH7.2PBS以1:50進(jìn)行稀釋)。加入量為每切片40μmol·L-1。于4℃冰箱中過夜(約12h)，用pH7.2PBS漂洗后加生物素化羊抗兔IgG，37℃飽和PBS中放置1h,再用pH7.2PBS漂洗，甩去多余液體后，加入SABC，于37℃飽和PBS液中孵育30min，甩去多余液體，進(jìn)行DAB染色(DAB染色液為1mL去離子水分別加入A、B、C液各1滴)。加入量為每切片20μL,染色時(shí)間十幾秒至幾十秒不等，至顯微鏡下觀察出現(xiàn)棕色背景時(shí)，清水終止反應(yīng)。滴加蘇木素(每切片50μL)輕度復(fù)染3min，用鹽酸乙醇分色，洗去多余蘇木素，置0.2%氨水中返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，以中性樹膠封片，封片完成的免疫組織化學(xué)切片在成像儀下采圖。保證光源一致的前提下，每組每個(gè)樣本隨機(jī)取額頂葉皮層5個(gè)區(qū)域。腦損傷大鼠腦梗死體積測定大鼠股動脈取血后迅速斷頭取腦，－20℃冷凍20min后冠狀切片(厚1mm)，37℃，2％TTC染色15min，采用病理圖像分析系統(tǒng)計(jì)算腦梗死體積比。腦損傷大鼠腦組織含水量測定60只大鼠隨機(jī)分為6組，分組、給藥及造模方法同上，到達(dá)再灌注時(shí)限后斷頭處死，迅速取出右側(cè)腦組織，用濾紙吸取表面水分，電子天平稱濕重，放入干燥箱105℃烘24h至恒重，稱取干重，按照Elliott公式計(jì)算腦含水量：腦含水量(％)=(濕重-干重)/濕重·100％腦損傷大鼠腦血管通透性大鼠60只隨機(jī)分為6組，分組、給藥及造模方法同上，于末次給藥1h后7％的水合氯醛麻醉，頸部正中切口，分離結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，假手術(shù)組只分離不結(jié)扎。結(jié)扎前5min尾靜脈注射伊文思藍(lán)50mg/kg。結(jié)扎3h后斷頭取腦，稱重后放入甲酰銨溶液中，45℃溫箱放置72h，待色素浸出后，取浸出液620nm處紫外分光光度儀測OD值。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件處理。以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組別劑量(mg/kg/d)神經(jīng)功能缺損評分腦梗死體積比(％)腦含水量(％)伊文思藍(lán)含量(ｕg/g)生理鹽水組模型組低劑量當(dāng)歸揮發(fā)油組中劑量當(dāng)歸揮發(fā)油組高劑量當(dāng)歸揮發(fā)油組陽性對照組表1當(dāng)歸揮發(fā)油對腦缺血大鼠神經(jīng)功能缺損評分、腦梗死體積比、腦組織含水量及腦血管通透性的影響組別劑量(mg/kg/d)NO(ｕmol/L)NOS(U/mL)MDA(nmol/L)SOD(NU/mL)GSH—Px(NU/mL)NF—kB生理鹽水組模型組低劑量當(dāng)歸揮發(fā)油組中劑量當(dāng)歸揮發(fā)油組高劑量當(dāng)歸揮發(fā)油組陽性對照組表2當(dāng)歸揮發(fā)油對腦缺血大鼠血清中NO、NOS、MDA、SOD、GSH-Px和NF-kB的影響防止血栓形成的作用當(dāng)歸揮發(fā)油對血液流變學(xué)的影響分組、給藥：將60只大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，分別為：假手術(shù)組(等容積生理鹽水)、模型組(等容積生理鹽水)、當(dāng)歸揮發(fā)油小劑量組(50mg/kg/d)、當(dāng)歸揮發(fā)油中劑量組(75mg/kg/d)、當(dāng)歸揮發(fā)油大劑量組(100mg/kg/d)、陽性對照組(藁本內(nèi)酯20mg/kg/d)，各組灌胃7d，每天2次，每次2mL，于末次給藥1h后造模。造模以7％水合氯醛(5mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠固定，使右側(cè)面部朝上，剃毛消毒后，在右眼與右耳間中點(diǎn)劃一長約2cm的垂直弧形切口，切開顳肌并向嘴側(cè)翻起，在顴弓與顳鱗骨接合處的前端2mm處用牙科鉆做一直徑約4mm的骨窗，暴露大腦中動脈(MCA)，輕輕挑起后電凝阻斷位于嗅束內(nèi)1～2mm至大腦下靜脈處的一段，阻斷血管后逐層縫合顳肌及皮膚，待蘇醒后放回鼠籠，單獨(dú)飼養(yǎng)。假手術(shù)組按上述步驟切開，縫合，但不凝閉MCA。術(shù)后72h股動脈取血，以20U/mL肝素制備抗凝血液及血漿，測定全血黏度、血漿黏度和紅細(xì)胞壓積，由計(jì)算機(jī)直接計(jì)算出全血還原黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和紅細(xì)胞變形指數(shù)。組別劑量(mg/kg/d)全血黏度(mPa·s)血漿黏度(mPa·s)全血還原黏度(mPa·s)假手術(shù)組模型組

當(dāng)歸揮發(fā)油小劑量組

當(dāng)歸揮發(fā)油中劑量組當(dāng)歸揮發(fā)油大劑量組陽性對照組表3當(dāng)歸揮發(fā)油對腦缺血損傷大鼠全血黏度、血漿黏度、全血還原黏度的影響組別紅細(xì)胞壓積紅細(xì)胞剛性指數(shù)紅細(xì)胞聚集指數(shù)紅細(xì)胞變形指數(shù)假手術(shù)組模型組

當(dāng)歸揮發(fā)油小劑量組

當(dāng)歸揮發(fā)油中劑量組當(dāng)歸揮發(fā)油大劑量組陽性對照組表4當(dāng)歸揮發(fā)油對腦缺血損傷大鼠血流變指標(biāo)中紅細(xì)胞指數(shù)的影響對膠原蛋白—腎上腺素誘發(fā)小鼠血栓形成的影響方法：將50只小鼠隨機(jī)分為5組，即模型組(等容積生理鹽水)、當(dāng)歸揮發(fā)油小劑量組(50mg/kg/d)、當(dāng)歸揮發(fā)油中劑量組(75mg/kg/d)、當(dāng)歸揮發(fā)油大劑量組(100mg/kg/d)、陽性對照組(藁本內(nèi)酯20mg/kg/d)，各組灌胃7d，每天2次，每次0.2mL。末次灌胃給藥1h后尾靜脈注射膠原蛋白(225ｕg/只)—腎上腺素(9ｕg/只)混合誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)血栓形成，小鼠出現(xiàn)死亡或者偏癱，觀察5min內(nèi)小鼠的死亡數(shù)和15min內(nèi)小鼠偏癱恢復(fù)數(shù)。組別劑量(mg/kg/d)5min內(nèi)死亡數(shù)15min內(nèi)偏癱恢復(fù)數(shù)模型組當(dāng)歸揮發(fā)油小劑量組當(dāng)歸揮發(fā)油中劑量組當(dāng)歸揮發(fā)油大劑量組陽性對照組表5當(dāng)歸揮發(fā)油對膠原蛋白G腎上腺素誘發(fā)小鼠血栓形成的影響急性毒性試驗(yàn)小鼠灌胃給予當(dāng)歸揮發(fā)油，經(jīng)預(yù)試驗(yàn)確定其對小鼠的最大致死劑量，最小致死劑量。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，在正式試驗(yàn)中將50只Wastar小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半，以最大致死劑量為初始劑量，組間劑量比值為K，按1：K等比稀釋法配制系列濃度當(dāng)歸揮發(fā)油，各組小鼠按0.2mL/10g體質(zhì)量一次性灌胃給藥(給藥前禁食不禁水12h)，給藥后連續(xù)觀察14d，詳細(xì)記錄各組小鼠毒性反應(yīng)和死亡情況。采用Bliss軟件計(jì)算半數(shù)致死量(LD50)。組別劑量(mg/kg)對數(shù)劑量動物數(shù)/只死亡數(shù)/只死亡率(％)12345表6當(dāng)歸揮發(fā)油急性毒性試驗(yàn)結(jié)果長期毒性試驗(yàn)選取6～8周齡大鼠80只,體質(zhì)量(120±15)g,雌雄各半,隨機(jī)分成當(dāng)歸揮發(fā)油高劑量、中劑量、低劑量和空白對照4組,每組20只。每組大鼠分籠飼養(yǎng),每籠5只。高劑量組按臨床成人的50倍日劑量，中劑量組按臨床成人的30倍日劑量，低劑量組臨床成人的10倍日劑量對大鼠灌胃給予當(dāng)歸揮發(fā)油,空白對照組給予等體積蒸餾水,1次/d,給藥體積為1.0ml/100g體質(zhì)量,連續(xù)13周。每日觀察記錄大鼠一般狀況如進(jìn)食,行為活動,糞便等。每周稱體質(zhì)量1次。末次給藥24h后,每組選取10只大鼠(雌雄各半),腹腔注射10%水合氯醛麻醉,從腹主動脈采集血樣,處死動物解剖觀察并進(jìn)行組織器官取樣,采集的血樣于血細(xì)胞分析儀上檢測紅細(xì)胞(RBC)、白細(xì)胞(WBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(P)、淋巴細(xì)胞系(LY)、單核細(xì)胞系(MO)、凝血時(shí)間(CT)等血液學(xué)指標(biāo)。另外取血分離血清,于生化自動分析儀上測定血清中的總膽紅素(T-Bj1)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、總膽固醇(Tc)、葡萄糖(GLU)等生化學(xué)指標(biāo)。取心、肝、脾、肺、腎、胃等臟器稱重,計(jì)算臟器系數(shù),10%甲醛固定,進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)檢查。各組余下大鼠停藥觀察2周后,同法處理,并檢測上述指標(biāo)。所得結(jié)果作統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,以t檢驗(yàn)比較組間差異顯著性。組別給藥前給藥后1周給藥后2周給藥后3周給藥后4周給藥后5周給藥后6周給藥后7周當(dāng)歸揮發(fā)油高劑量組當(dāng)歸揮發(fā)油中劑量組當(dāng)歸揮發(fā)油低劑量組空白對照組表7當(dāng)歸揮發(fā)油對大鼠體質(zhì)量增長的影響組別給藥后8周給藥后9周給藥后10周給藥后11周給藥后12周給藥后13周停藥后1周停藥后2周當(dāng)歸揮發(fā)油高劑量組當(dāng)歸揮發(fā)油中劑量組當(dāng)歸揮發(fā)油低劑量組空白對照組組別心肝脾肺腎當(dāng)歸揮發(fā)油高劑量組當(dāng)歸揮發(fā)油中劑量組當(dāng)歸揮發(fā)油低劑量組空白對照組表8當(dāng)歸揮發(fā)油用藥13周后對大鼠主要臟器系數(shù)的影響組別心肝脾肺腎當(dāng)歸揮發(fā)油高劑量組當(dāng)歸揮發(fā)油中劑量組當(dāng)歸揮發(fā)油低劑量組空白對照組表9當(dāng)歸揮發(fā)油停藥2周后對大鼠主要臟器系數(shù)的影響組別WBC/109/LRBC/1012/LHGB/g/LPLT/109/ｕLLY/109/LMO/109/LCT/s當(dāng)歸揮發(fā)油高劑量