3-基因工程的酶學基礎

第二章基基因工程程的酶學基基礎Enzymes1本章節(jié)內(nèi)容容第一節(jié)限限制性核核酸內(nèi)切酶酶第二節(jié)DNA連連接酶第三節(jié)DNA聚聚合酶第第四節(jié)DNA修修飾酶第第五節(jié)核核酸外切切酶第六節(jié)單單鏈核酸酸內(nèi)切酶2本章學習內(nèi)內(nèi)容重點討論限限制性核酸酸內(nèi)切酶和和DNA連連接酶在DNA切割割和連接中中的應用，，并簡要介介紹其他與與基因克隆隆有關的其其它的重要要的酶。3一、限制性性核酸內(nèi)切切酶第一節(jié)限制性核酸酸內(nèi)切酶是一類能夠夠識別雙鏈DNA分子中的某某種特定核苷酸酸序列，并由此處處切割DNA雙鏈的核酸內(nèi)切酶。（Restrictionendonuclease））42.性質(zhì)質(zhì)內(nèi)切酶主要來源于于原核生物物即在核酸分分子鏈的內(nèi)部制造切口的的酶。形成5’-P和3’’-OH末末端自我保護作作用3.功能能細菌的限制制和修飾系系統(tǒng)（R/M體系））1.來源源56限制性內(nèi)切切酶將侵入入細菌體內(nèi)內(nèi)的外源DNA進行分解解，切成小片斷斷。（1）限制制（Restriction）7細菌自身的的DNA堿堿基被甲基化酶甲基化修飾飾所保護，，不能被自自身的限制制性內(nèi)切酶酶識別切割割。（2）修飾飾（Modification）①Dam甲基化酶酶(DNAAdenineMethylase)GATC腺腺嘌呤呤N6位位置引入入甲基②Dcm甲基基化酶(DNAcytosineMethylase)CCAGG或或CCTGG序序列在第第二個C上C5位置上引引入甲基基89（3）限限制與修修飾系統(tǒng)統(tǒng)相關的的三個基基因①hsdR:編編碼限制制性內(nèi)切切酶②hsdM:編編碼限制制性甲基基化酶③hsdS:編編碼限制制性內(nèi)切切酶和甲甲基化酶酶的協(xié)同同表達這類酶能能識別DNA分分子上的的特定位位點，并并將雙鏈鏈DNA切斷這類酶使使DNA分子特特定位點點上的堿堿基甲基基化，即即起修飾飾DNA的作作用。作用是協(xié)協(xié)同上述述兩種酶酶識別特特殊的作作用位點點。101973年H.OSmith和D.Nathans提議的的命名系系統(tǒng)，命命名原則則如下：：二、限制制性內(nèi)切切酶的命命名用屬名的第一個個字母和和種名的頭兩個個字母組組成3個個字母的的略語表表示寄主菌的物種名名，組成成酶的基基本名稱稱。大腸桿菌菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示112.如果酶存存在于一一種特殊的菌菌株中，則將將該菌株株名的第第一個字字母加在在基本名名稱后，，若酶的的編碼基基因位于于噬菌體（（病毒））或質(zhì)粒粒上，則用用一個大大寫字母母表示此此染色體體外遺傳傳成分。。如HindⅡ：d菌株EcoRI：抗抗藥性R質(zhì)粒123.如果一種種特殊的的菌株內(nèi)內(nèi)有幾種種不同的的限制與與修復系系統(tǒng)，用用羅馬字字母表示示該菌株株中發(fā)現(xiàn)現(xiàn)某種酶酶的先后次序序。如HindⅡ：d菌株株中發(fā)現(xiàn)現(xiàn)的第二二個酶4.所有的限限制酶，，除以上上名稱外外還要冠冠以系統(tǒng)名稱稱。限制性性內(nèi)切酶酶的系統(tǒng)統(tǒng)命名為為R，甲甲基化酶酶為M。。如R.HindⅢ表示限制性性內(nèi)切酶M.HindⅢ表示示相應的甲基基化酶實際應用中，，R常被省略略。13Ⅰ型限制性性內(nèi)切酶目前鑒定出四種不同類型型的限制性內(nèi)切切酶。主要的的三種：三、限制性內(nèi)內(nèi)切酶的類型型Ⅱ型限制性性內(nèi)切酶Ⅲ型限制性性內(nèi)切酶14首先由M.Meselson和R.Yuan在在1968年年從大腸桿菌菌B株和K株分離的。（1）識別位位點序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC1.Ⅰ型限制性內(nèi)切切酶的基本特特性如EcoB和EcoK。未甲基化修飾飾的特異序列列。15需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫硫氨酸）（3）輔助因子在距離特異性性識別位點約約1000—1500bp處隨機切開一條單鏈，不產(chǎn)生特異片斷，應用不大Recognizesitecut1-1.5kb（2）切割位點16首先由H.O.Smith和K.W.Wilcox在在1970年年從流感嗜血血菌中分離出出來。（1）識別位位點序列未甲基化修飾飾的雙鏈DNA上的特殊靶序序列（多數(shù)是是呈典型的旋轉(zhuǎn)對稱型的的回文結(jié)構(gòu)）。與DNA的的來源源無關關，即即沒有種種的特特異性性。2.Ⅱ類限限制性性內(nèi)切切酶的的基本本特性性分離的的第一一個酶酶是HindⅡⅡ基因工工程用用途最最大17稀有切切割限限制酶酶（rarecutter）可以識識別6個以以上的的核苷苷酸序序列的的少數(shù)數(shù)的限限制內(nèi)內(nèi)切酶酶。如NotI（GCGGCCGC）某些限限制性性內(nèi)切切酶的的識別別序列列中，，某一一個或或兩個個堿基基并非非嚴格格專一一。如HindⅡⅡ可識識別4種核核苷酸酸序列列：Y:C或TR:A或或GGTYRAC-3’’5’-18EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

產(chǎn)生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

產(chǎn)生平齊末端（2））切割位位點切開雙鏈DNA，形形成粘性末末端（stickyend）或或平齊末末端（bluntend））。如如：識別位位點處處19含有幾幾個核核苷酸酸單鏈的末端端。分兩種種類型型：GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG5’--3’’3’--5’’5’--3’’3’--5’’[1]粘粘性末末端（stickyends，cohensiveends））?。?’’端凸凸出（（如EcoRI切點點）20CTGCAGGACGTC5’--3’’3’--5’’5’--3’’3’--5’’CTGCAGGACGTCⅱ）3’’端凸凸出（（如PstI切點點）21i）不同的DNA雙雙鏈：只要粘性性末端堿堿基互補補就可以以連接。。ii）同一個DNA分分子內(nèi)連連接：通過兩個個相同的的粘性末末端可以以連接成成環(huán)形分子子。這比連接接兩個平平齊末端端容易得得多。[2]粘粘性末末端的意意義①連接便利利2223B末端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚聚核苷酸的尾尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性性末端。A末端可用DNA多核苷酸激酶酶進行32P標記。粘性末端可以以用DNA聚聚合酶補平成成平齊末端。。②末端標記記③補平成平平齊末端24[3]平齊齊末端（bluntend）在識別序列的的對稱軸上同時切割5’-GATATC-3’3’--5’CTATAG如EcoRV25[4]平齊齊末端的特點點連接困難，連接效率低，只有粘性末末端連接效率率的1%，這這種連接常出出現(xiàn)多聯(lián)體連接。粘性末端與平平齊末端連接接的處理方法法?。┨硌a法：：利用DNA聚合酶酶Ⅰ(klenowfragment）將堿基添補到到目的基因的的粘性末端上上。26ⅱ）削除(平平)法利用S1和Bal31等核酸酶將目的基因粘粘性末端的單單鏈突出部分分削去，使其其成為平齊末末端27不同來源的酶酶，識別相同的序序列，切割方式相同同或不同。識別位點和切切點完全相同同如HindⅢ和HsuIHindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’[5]同裂裂酶（Isoschizomer)①完全同裂酶：：28XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’識別位點相同同，但切點不不同。如XmaI和SmaI。②不完全同裂酶酶：29識別的序列不不同，但能切出相同的粘粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；；Y代表嘧啶啶。[6]同尾尾酶(Isocaudamers））305’-GATC----3’’3’----CTAG-5’Sau3A同尾酶的粘性性末端互相結(jié)結(jié)合后形成的的新位點一般不能再被原來的酶酶識別。5’-G3’-CCTAGGATCT-3’A-5’BamHIBglⅡ5’-GGATCT-3’3’-CCTAGA-5’BamHIBglⅡSau3A31限制性內(nèi)切酶酶的識別和酶酶切活性一般般在一定的溫度、離子強強度、pH等條件下才表表現(xiàn)最佳切割割能力和位點點的專一性。。如果改變反應應條件就會影影響酶的專一性和切割割效率，稱為星號（（*）活性。。所以一般使用用專一的反應應緩沖液。[7]限限制酶的酶酶活性①星號（（*）活性性32EcoRI和BamHI等都都有*活性性。在低鹽、高高pH（>8）時可可識別和切切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等等GAATTCEcoRI：：使用用的的時時候候要要特特別別注注意意！！733②誘誘發(fā)發(fā)星星號號（（*））活活性性的的原原因因?。└吒吒矢视陀秃苛竣ⅲ﹥?nèi)內(nèi)切切酶酶用用量量過過大大ⅲ））低低離離子子強強度度ⅳ））高高pHⅴ））含含有有機機溶溶劑劑，，如如乙乙醇醇ⅵ））Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二二價價陽陽離離子子的的存存在在酶量量不不宜宜過過多多，，盡盡量量遵遵循循生生產(chǎn)產(chǎn)商商推推薦薦的的反反應應條條件件34在離離它它的的不對對稱稱識識別別位位點點一側(cè)側(cè)的的特定定距距離離處切切割割DNA雙雙鏈鏈。。移動動切切割割（（shiftedcleavage):GACGCNNNNNHgaICTGCGNNNNNNNNNN5’3’[8]Ⅱs型型限制性內(nèi)切切酶35（3）Ⅱ型限制性內(nèi)內(nèi)切酶不具有有甲基化功能能Ⅱ型酶的甲基化化修飾活性由由相應的甲基基化酶承擔。。它們識別相同的DNA序列列，但功能不同。如EcoRI限制性性內(nèi)切酶和EcoRI甲基化化酶前者：5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’后者：5’-GAA*TTC-3’3’-CTT*AAG-5作用的位點也也不相同36（4）II型限制性內(nèi)切切酶對單鏈DNA的切割割定義為為切割割雙鏈鏈DNA，，但有有一些些還可可以特特異識識別并并切割割單鏈鏈DNA的的相應應位點點，只只是切割效率比比較低如：HhaⅠ切割單鏈DNA比切割雙鏈DNA效率率低50％％373.Ⅲ類限制性性內(nèi)切酶在完全肯定定的位點切切割DNA，但反應應需要ATP、Mg2+和SAM（（S-腺苷苷蛋氨酸））。在基因工程程操作中用用途不大。。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG38核酸限制制性內(nèi)切切酶的特性

Ⅰ類內(nèi)切酶Ⅱ類內(nèi)切酶Ⅲ類內(nèi)切酶限制和修飾活性單一多功能的酶內(nèi)切酶和甲基化酶分開共同亞基的雙功能酶內(nèi)切酶的蛋白結(jié)構(gòu)3種不同的亞基單一成分2種不同的亞基限制作用所需要的輔助因子ATP、Mg2+和SAMMg2+ATP、Mg2+和SAM寄主特異性位點識別序列EcoB：TGA(N)8TGCTEcoK：AAC(N)6GTGC回文序列（Ⅱs型除外）EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG39切割位點在距離識別位點至少1000bp處隨機切開一條單鏈位于寄主特異性位點或其附近距寄主特異性位點3’端24－26bp處酶催轉(zhuǎn)換不能能能DNA易位作用能不能不能甲基化作用的位點寄主特異性位點寄主特異性位點寄主特異性位點識別未甲基化的序列進行切割能能能序列特異的切割不是是是基因工程中的用途無用十分有用用處不大40四、限制制性內(nèi)切切酶酶解解反應條條件1.標標準酶解解體系的的建立一個單位位（U））的限制制性內(nèi)切切酶定義義：在合適的的溫度和和緩沖液液中，在在20μl的反反應體系系中，1h完全全酶解1μgDNA所所需要的的酶量。。推薦：稍稍過量的的酶（2-5倍倍）和較較長的反反應時間間412.酶酶解過程程配酶解體體系混勻反應終止止酶解結(jié)果果鑒定42①酶解解體系一般20μl，保證酶酶液體積不超超過反應總體體積的10%前提下，盡盡量降低反應應總體積。加樣順序一般般是：ddH2ObufferDNA酶酶43大部分分II型型核酸酸內(nèi)切切酶需需要相相似的的反應應條件件：Tris-HCl50mMpH7.5MgCl210mMNaCl0-150mMDTT1mM0-50mM低鹽酶100mM中鹽酶150mM高鹽酶Volume20-100mlTT37℃1-1.5hr44②混混勻移液槍槍吹打打或手指輕輕彈管管壁若底物物分子子很大大（如如基因因組DNA），，應避避免強強烈振振蕩。?；靹蚝蠛笪⒘苛扛咚偎匐x心心機進進行短短暫離心心，使使管壁壁液體體全部部下沉沉。45③反反應應終終止止三種種方方法法：：?。┘蛹右乙叶钒匪乃囊乙宜崴幔ǎ‥DTA）至至終終濃濃度度10mmol/L;加加十十二二烷烷基基硫硫酸酸鈉鈉（（SDS）至終濃度度0.1%(W/V)ⅱ）65℃加熱20min或者者70℃℃加熱10minⅲ）酚/氯仿抽提46④酶解解結(jié)果鑒鑒定快速進行行微型瓊瓊脂糖凝凝膠電泳泳觀察然后決定定是否終終止反應應47酶切后發(fā)發(fā)現(xiàn)除了了目的DNA條條帶外，，還有其其它條帶帶酶存在““星號””活性，，造成非非特異性性切割；；不正確的的操作，，導致其其它內(nèi)切切酶污染染；底物DNA中可可能存在在其它DNA污污染。電泳后電電泳條帶帶擴散，，電泳條條帶移動動距離異異常底物DNA不純純；內(nèi)切酶不不純；酶蛋白自自身或其其它雜蛋蛋白與DNA結(jié)結(jié)合在一一起使電電泳條帶帶移動距距離異常常483.限限制性內(nèi)內(nèi)切酶對對DNA分子的的消化1986年J.A.McClarin等等通過X射線晶晶體衍射射發(fā)現(xiàn)Ⅱ型限制酶酶是以同型二聚聚體的形式與與靶序列列結(jié)合。。CTTAAGGAATTC（1）內(nèi)內(nèi)切酶與與識別序序列的結(jié)結(jié)合模式式49內(nèi)切酶在在DNA上的所有識別位點點都被切切開12341234（2））完完全消消化50只有有有限數(shù)數(shù)量的的酶切切位點點被切切開通過縮縮短保保溫時時間、、降低低反應應溫度度、增增大反反應體體積或或減少少酶量量可達達到局局部消消化的的目的的。123414（3））局局部消消化51（4））幾幾種常常用限限制酶酶識別別位點點5253AATTACGTAGCTATATCATGCCGG********MaeIIHpaⅡcMspIc

****AluI****A****TNlaⅢA****TApoI

HindⅢAflIII

AgeIBsrFIA****TA****TSspIA****T（5））限制制性內(nèi)內(nèi)切酶酶識別別序列列的交交叉列列表54AATTACGTAGCTATATCATGCCGGA****TNsp7524C****GNcoIStyIDsaI

XmaIAvaIC****GNdeIC****GPmlIBsaAIPvuIINspBII

SmaIC****GC****GG****CEcoRIApoINgoMIBsrFI55AATTACGTAGCTATATCATGCCGGG****CBseHIG****CEcl136IIEcoRV

NaeIG****CG****CAatIISacIBanIIHgiAIBsp1286

SphINsp7524T****ABspHIBspMIIT****AT****ASnaBIBsaAI

T****AT****A56CGCGCTAGGATCGCGCGGCC****MboIcSau3AIc

****BfaIHinpI****BstUIDpnIHaeIII****HhaIA****TA****TMluIAflIIISpeIBglIIBstYIA****TA****TEco47IIIStuIA****T

57CGCGCTAGGATCGCGCGGCCA****THaeIIC****GDsaIAvrIIStyIEagIEaeIGdiII

C****GC****GNspBIIC****GSacIIPvuIC****GBsiEIBsiEIG****CBssHIINheIBamHIBstYIKasIBanIBsp120I58CGCGCTAGGATCGCGCGGCCG****CNarIBsaHIG****CG****CG****CT****ABbeIHaeIIApaIBanIIBsp1286

T****AXbaIBclIEaeIT****ANruIFspIMscIT****AT****A59GTACTATATCGATGCATTAA********Csp61TaqIMseI****RsaI****A****TA****TA****TClaIAseIA****TScaIA****T60GTACTATATCGATGCATTAAA****TNsiIC****GBsiWISfcIXhoIAvaIAvaISfcIC****GC****GC****GC****GPstIG****CAsp718BanISalIApaLI61GTACTATATCGATGCATTAAG****CAccIAccI

G****CBsrl107IHincIIHpaIHincIIG****CG****CKpnIBsp1286HgiAIT****AT****ABstBIT****ADraIT****AT****A624.限限制制性內(nèi)內(nèi)切酶酶酶解解反應應中的的注意意事項項①大大多數(shù)數(shù)廠家家供應應的限限制內(nèi)內(nèi)切酶酶為濃濃縮液液1U的的酶液液足以以在1h內(nèi)內(nèi)消化化10μgDNA，酶和和底物物比例例2-10U/ugDNA,避避免使使用過過高的的酶濃濃度②濃縮液液使用前可可用1×限限制酶緩沖沖液稀釋③限制性性內(nèi)切酶在在含50%的甘油的的緩沖液中中，于-20℃穩(wěn)穩(wěn)定保存63④酶分裝裝成小份，，避免反復復凍融⑤反應中中盡可能少少加水，使使反應體積積減到最低低⑥通常增增加反應時時間，可降降低酶量64DNA中的的雜質(zhì)如蛋白質(zhì)、酚酚、氯仿、、乙醇、SDS、EDTA等都會影響響酶的活性性。1.DNA的純度度五、影響限限制性內(nèi)切切酶活性的的因素①純化DNA②加大酶的的用量，1ugDNA用10U酶③延長保溫溫時間④擴大反應應體積（>20l）一般采取65需要合適的的底物：底物（DNA）純度度要高.不不能含有RNA和蛋蛋白質(zhì);也也不能含有有過高的EDTA。。更不能含含有酚、氯氯仿、乙醇醇、SDS和其他有有機試劑。。DNA的的濃濃度度不宜宜過過高高，，高高濃濃度度的的DNA會會使使溶溶液液的的粘粘度度增增加加從從而而抑抑制制酶酶分分子子的的擴擴散散導導致致酶酶切切反反應應不不徹徹底底。。常常為為50ul內(nèi)內(nèi)含含1ugDNA。。66大腸腸桿桿菌菌一一般般有有兩種種甲甲基基化化酶酶修飾飾質(zhì)質(zhì)粒粒：：2.DNA的的甲甲基基化化程程度度DNA腺腺嘌嘌呤呤甲甲基基化化酶酶（DNAadeninemethylas,dam)（（修修飾飾GATC中中的的A）；；DNA胞胞嘧嘧啶啶甲甲基基化化酶酶（DNAcytosineethylas,dcm)（（修修飾飾CCA/TGG的的C）?；蚬こ讨斜乇仨毷褂眉谆甘Щ钔煌蛔兊木?。。67不同的限制性性內(nèi)切酶的最最適反應溫度度不同。大多數(shù)是37oC，少數(shù)要求40-65oC。每微克DNA用1～5單單位的酶，保保溫1~2小小時。酶最適溫度oC酶最適溫度oC酶最適溫度oCApaIBclIMaeIITaqI30505065ApyIBstEIIMaeIII306055BanIMaeISmaI5045253.溫度68是影響限制酶酶活性的重要要因素4.緩沖液液(Buffer)（1）緩沖液液的化學組成成MgCl2、NaCl/KCl：提提供Mg2+和離子強度Tris-HCl：維維持pH,大多數(shù)為為7-7.6二硫蘇糖醇（（DTT）：：防防止酶氧化,保持酶穩(wěn)定定性牛血清白蛋白白（BSA））等：中性蛋蛋白質(zhì),防止止酶在低濃度的蛋白質(zhì)質(zhì)溶液中變性性商品化的限制制酶一般都帶帶有專用緩沖沖液69（2）兩種或或兩種以上的的酶切割DNA樣品①在相同的的緩沖液中反反應同時進行行②若需要不不同的緩沖液液,采用3種種方法ⅰ)先用要求求低離子強度的酶酶切割（低鹽鹽酶）,再加加NaCl調(diào)調(diào)節(jié)離子強度,并并用第二種酶酶切割（高鹽鹽酶）；ⅱ)先用一種酶切割,然后后用2.5倍倍體積的乙醇醇沉淀酶解產(chǎn)產(chǎn)物,再重懸于另一一種緩沖液中中進行第二種種酶切割；ⅲ)使用所有有限制性酶的通用buffer,如KGB(谷氨酸鉀buffer),經(jīng)適當當稀釋可達到到各種限制性性酶要求的buffer條件。70練習題何為限制性內(nèi)內(nèi)切酶？有哪哪些類型，各各有什么作用用和特點什么是限制性性內(nèi)切酶的星星號活性？受受哪些因素影影響？限制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶是由細細菌產(chǎn)生的，，其生理意義義是【】】

Ａ修修復自身的遺遺傳缺陷ＢＢ促進自自身的基因重重組

Ｃ強強化自身的的核酸代謝ＤＤ提高高自身的防御御能力ＥＥ補充自身身的核苷酸消消耗71從細菌DNA環(huán)化現(xiàn)象推推測，必定存存在一種能把把兩條DNA雙鏈連接到到一起的酶。。第二節(jié)DNA連接接酶一、DNA連連接酶（ligase)的發(fā)現(xiàn)DNA復制一一定有斷口72DNA連接酶酶:一種能夠催化化在兩條DNA鏈之間形形成磷酸二酯鍵的酶1967年，，世界上數(shù)個個實驗室?guī)缀鹾跬瑫r發(fā)現(xiàn)了了一種能夠催催化在2條DNA鏈之間間形成磷酸二酯鍵的酶，即DNA連接酶。。73（1）大腸桿桿菌連接酶1.兩種共共價連接DNA限制片段段的DNA連連接酶只能連接粘性末端，背背景低，準確確性高二、DNAligase的特點（2）T4噬噬菌體的連接接酶不但能連接粘粘性末端；還還能連接齊平末端74（1）必須是是兩條雙鏈DNA（2）DNA3’端有游游離的-OH，5’端有一個個磷酸基團（（P）（3）需要能量動物或噬菌體體中：ATP大腸桿菌中：：NAD+2.連接條條件75（4）DNA連接酶的反反應條件Tris-HCl50-100mM，pH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃，4-16hr1UDNA連接酶的的酶活性：在在最佳反應條條件下15℃反應1小小時，完全連連接1mgl-DNA（HindⅢ片段）所需的的酶量。761.ATP（NAD+)提供激活的的AMP。三、連接反應應的機理2.AMP與連接酶形形成共價“連接酶-AMP”復合物，并并釋放出焦磷磷酸PPi（（NMN））。3.AMP與連接酶的的賴氨酸-氨基相連。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi774.AMP隨后從連接酶酶的賴氨酸-氨基轉(zhuǎn)移移到DNA一一條鏈的5’端P上，形成“DNA-腺苷苷酸”復合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP785.3’-OH對磷原子作親親核攻擊，形形成磷酸二酯酯鍵，釋放出出AMP。79如何連接由限限制性內(nèi)切酶酶切割形成片片斷的末端？80連接酶反應的的最佳溫度是是37C。四、連接反應應的溫度1.最佳溫溫度但在37℃下粘性末端的結(jié)合很不穩(wěn)穩(wěn)定。2.實用溫溫度所以一般采用用4~16C81增加插入片段段與載體的接接觸機會，減減少同一個分分子末端自我我連接的現(xiàn)象象。1.DNA末端的濃度度五、影響連接接反應的因素素10~20倍倍2.插入片片段與載體的的濃度比例兩種構(gòu)型：線線狀分子和環(huán)環(huán)狀分子與DNA濃度及DNA分子長長度相關823.反應溫溫度黏性末端：12～16℃℃平頭末端：10～20℃℃4.ATP濃度一般，ATP最適的終濃濃度為0.5mmol/L.ATP濃度高高至5mmol/L，影影響平頭末端端的連接ATP濃濃度高至至7.5mmol/L，抑制制粘性末末端及平平頭末端端的連接接。83六、DNA連接接的反應應體系酶切純化化后的DNA片片斷連接緩沖沖液DNA連連接酶84從分子動動力學的的角度講講，由限限制性核核酸內(nèi)切切酶創(chuàng)造造的粘性性末端的的連接屬屬于分子子內(nèi)部的的連接，，而平頭頭末端的的連接則則屬于分分子間的的連接，，因此后后者反應應速度要要慢得多多。七、平頭雙鏈鏈DNA片段的的連接操操作85加大連接接酶用量量（10倍大于粘粘性末端端的連接接）加大平頭頭末端底底物的濃濃度，增增加分子子間碰撞撞機會加入10%PEG8000，促進大大分子之之間的有有效作用用加入單價價陽離子子（NaCl），最終終濃度150-200mM提高平頭頭末端連連接效率率的方法法包括：：86第三節(jié)DNA聚合合酶DNA聚聚合酶（（DNApolymerase)能在引物和模板的存在下下，把脫脫氧核糖糖多核苷苷酸連續(xù)續(xù)地加到到雙鏈DNA分子子引物鏈的的3’－OH末端端，催化化核苷酸酸的聚合合作用.87一、基因因工程中中常用的的DNA聚合酶酶大腸桿菌菌DNA聚合酶酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚聚合酶4.T4DNA聚聚合酶5.修修飾過的的T7DNA聚合酶酶6.逆逆轉(zhuǎn)錄酶酶7.TaqDNA聚聚合酶881.共共同特點點把dNTPs連連續(xù)地加加到引物物的3’’－OH端2.主主要區(qū)別別T7DNA聚聚合酶可以連續(xù)續(xù)添加數(shù)數(shù)千個dNTPs而不不從模板板上掉下下來。其它幾種種DNA聚合酶酶只能連連續(xù)添加加10多多個dNTPs就會從從模板上上解離下下來。二、常用用的DNA聚合合酶的特特點持續(xù)合成成能力和和外切酶酶活性不不同。89DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持續(xù)能力大腸桿菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低無中低T4DNA聚合酶高無中低T7DNA聚合酶高無快高化學修飾T7DNA聚合酶低無快高遺傳修飾T7DNA聚合酶無無快高逆轉(zhuǎn)錄酶無無低中TaqDNA聚合酶無有快高3.常常用DNA聚合合酶的特特性比較較90三、DNA聚合合酶在在基因因工程程中的的用途途1.大大腸腸桿菌菌DNA聚聚合酶酶ⅠⅠ主要用用來制制備帶帶放射射性標標記的的DNA探探針（（32P標記記）。。（1））大腸腸桿菌菌DNA聚聚合酶酶Ⅰ的的性質(zhì)質(zhì)①一條條單鏈多多肽②5’’3’外外切酶酶活性性位于于N端端③用枯草桿桿菌蛋蛋白酶酶處理可可以切切掉N端的的5’3’外外切酶酶活性性部分,就成成為Klenowfragment。91①底底物：：dNTPs（dATP、、dGTP、dCTP、、dTTP）②Mg2+③帶有3’-OH游離端的的引物④DNA模板（2）DNA聚合酶酶I（PolI））的反應條條件-OH5’3’dNTPs92標記①核酸酸探針（（probe））能夠同某某種被研研究的核核酸序列列特異性性結(jié)合的的，帶有有標記的的寡聚核核酸分子子。（3）用用DNA聚合酶酶Ⅰ制備探探針已知序列列的核酸酸片斷顯示位置置與互補的的待測序序列雜交交93標記已知序列列的核酸酸片斷②探針針的標記記方式標記已知序列列的核酸酸片斷帶有放射射性的已已知序列列的核酸酸片斷5’3’94③DNA聚合合酶I對對探針針序列的的標記切口平移移法(nicktranslation)：：放射性同同位素標標記：當存在dNTP時，DNA聚聚合酶I同同時具備備5’3’外外切酶活性和5’3’的的聚合酶酶活性。955’3’外外切酶活活性從DNA缺缺口的下一段DNA5’端除除去一個個核苷酸酸后，聚聚合酶活活性就會會在缺口口的上一段DNA的的3’一一側(cè)補上上一個新新的核苷苷酸。缺口缺口5’5’3’3’5’3’5’3’96純化的DNA片片斷DNaseI制造單單鏈缺口口DNAPolI進進行切口口轉(zhuǎn)移一種-32P-dNTP和和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’32P-dNTP32P-dNTP從頭至尾尾都被標標記972.Klenowfragment具有5’’3’聚合合酶活性性和3’’5’外切酶活活性。（失去了5’3’外切酶活活性）。（1）Klenowfragment的性質(zhì)質(zhì)DNAPolIKlenowfragment(76KD））枯草桿菌蛋白白酶98①3’端補補平5’5’klenow②DNA3’末端標標記補平限制性內(nèi)內(nèi)切酶切后形形成的3’隱蔽端。在3’隱蔽端加上放射性標標記的dNTP。klenow（2）主要用用途993’隱蔽末端端的DNA片片斷Klenowfragment補補平根據(jù)末端的順順序選擇一種種-32P-dNTPs末端標記的DNA限制性內(nèi)切酶酶切5’----G3’3’----CTTAA5’5’----GAA3’3’----CTTAA5’5’----GAATT3’3’----CTTAA5’’5’’----G3’’3’’----CCTAG5’’5’’----GG3’3’----CCTAG5’’5’----GGATC3’3’----CCTAG5’’EcoRIBamHI-32P-dATP-32P-dGTP25oC1h100③cDNA第第二鏈的的合成mRNAcDNA第一鏈鏈逆轉(zhuǎn)錄cDNA第二鏈鏈klenow5’3’3’5’5’3’引物101（1）T4DNA聚合酶酶的性質(zhì)質(zhì)3.T4DNA聚聚合酶從T4噬噬菌體感感染后的的大腸桿桿菌培養(yǎng)養(yǎng)物中分分離純化化，由噬菌體基基因43編碼。有5’3’聚合合酶活性性和3’’5’外切切酶活性性（降解解單鏈更更快）。。①來源源②酶活活性102③特點點A當沒沒有dNTP時時，T4DNA聚合合酶行使使3’5’外切切酶功能能，制造出3’隱蔽蔽端。B如果果只有一一種dNTP，，則降解解到該dNTP的位置置。C在四四種dNTP均均存在時時，聚合合活性占占主導地地位。1035’5’3’3’5’5’3’3’T4DNA聚聚合酶無dNTPsT4DNA聚聚合酶有dNTPs5’5’104（2）T4DNA聚合酶酶的用途途標記末端端（取代代合成法法或置換換合成法法）用3’5’外外切酶活活性作用用于所有末端端形式的的3’端端（平端、、3’隱蔽蔽端、5’隱蔽蔽端）制制造出3’隱蔽蔽端。再利用它它的5’’3’聚聚合酶活活性補平平，并加加入放射射性標記記的dNTP。。①補平平隱蔽末末端②DNA3’末端端標記105酶切中間間產(chǎn)生兩兩個末端端標記加入某種種32P-dNTP和和dNTPsT4DNA聚聚合酶（3’5’外外切）DNA酶酶切片斷斷T4DNA聚聚合酶（5’3’聚聚合）5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’內(nèi)切酶切切無dNTPs106a.放射性性標記的優(yōu)缺點：制作簡單高比放射性放射自顯影效效果好優(yōu)點：缺點：半衰期短（32P只有14.3天）不易保存對人體有害要求在專門實實驗室操作107b.非放射射性標記i）生物素標標記生物素（biotin）），又稱維生生素H、輔酶酶R可以與dNTP?；Y(jié)合合成為biotin-1,6-dUTP、biotin-1,4-dATP、biotin-1,1-dUTP等。。CH2-CH-NH-CO-NH-CH-(CH2)4-COOH也可以被生物物素連接酶（（biotinligase）催催化與蛋白質(zhì)質(zhì)共價結(jié)合。。108純化的DNA片斷DNaseI制造單單鏈缺口DNAPolI進進行缺口轉(zhuǎn)移移biotin-dTTP和和dNTPs5’5’5’5’5’5’5’5’3’3’3’3’3’3’3’3’生物素-dTTP生物素-dTTP利用切口轉(zhuǎn)移移法將生物素素摻入DNA探針中109ii）地高辛辛標記：可以與dNTP連接成地地高辛-dUTP等，參參入DNA合合成過程，形形成地高辛標標記的DNA探針。生物素和地高高辛標記的探探針都有商品品化的試劑盒盒(kit)。地高辛的結(jié)合合物是抗地高辛抗體體。1104.T7DNA聚合合酶（1）來源從T7噬菌體體感染大腸桿桿菌細胞中純純化出來的，，由兩個亞基基組成：①T7噬菌菌體基因5編編碼的大亞基基：T7噬菌體5蛋白。有5’3’聚合酶和和3’5’外切酶活活性。②大腸桿菌菌編碼的小亞亞基：硫氧還蛋白。。增加大亞基對對模板的親和性性。111（2）T7DNA聚合合酶的特點①持續(xù)合成成能力強一旦與模板結(jié)結(jié)合就會不間間斷地合成互互補鏈。②3’5’外切酶活活性高單鏈和雙鏈都都能降解。③不受DNA二級結(jié)構(gòu)構(gòu)的影響其它DNA聚聚合酶受DNA二級結(jié)構(gòu)構(gòu)的阻礙112②進行末端端標記①催化大分分子量DNA為模板的合合成如M13噬菌菌體③補平隱蔽蔽末端（3）T7DNA聚合合酶的用途合成補平3’隱蔽蔽末端；水解修平3’突出出末端。1135.修飾后后的T7DNA聚合酶酶（1）T7DNA聚合酶酶的化學修飾飾去除3’5’外切酶活活性，使DNA聚合能力力和聚合速率率提高了3倍倍。（2）修飾后后的T7DNA聚合酶酶的用途①DNA測測序雙脫氧法。②標記DNA3’隱隱蔽末端③更有效地地補平末端1146.逆轉(zhuǎn)錄錄酶最普遍使用的的是來源于鳥類骨髓母細細胞瘤病毒（avianmyeloblastosisvirus,AMV）：依賴RNA的的DNA聚合合酶（RNA指導的DNA聚合酶））。（1）來源RNA腫瘤病病毒。（2）AMV的性質(zhì)由和兩條多肽鏈組組成，最適反反應溫度為41～45℃115①鏈有反轉(zhuǎn)錄活性性和RNaseH活性。RNaseH：以5’3’’或3’5’方向特異異地水解RNA-DNA雜交雙鏈中中的RNA鏈。RNaseHRNADNARNADNA116（3）逆轉(zhuǎn)錄錄酶的用途②鏈RNA-DNA雜交交雙鏈中5’3’DNA外切酶活性性。①合成cDNA以oligodT為引物（（與mRNA的polyA尾尾巴互補結(jié)結(jié)合）。AAAAATTTTT5’’3’’mRNA5’’cDNA117②合合成成DNA探探針針用隨隨機機引引物物（（randomprimer））或或oligodT做做引引物物。。隨機機引引物物：：隨機順序形成成的寡聚DNA片斷。（理論上它能能與各種序列列的模板結(jié)合合）118第四節(jié)DNA修飾飾酶一、末端脫氧氧核苷酸轉(zhuǎn)移移酶1.來源小牛胸腺。2.組成大小兩個亞基基。3.特性5’3’DNA聚聚合酶活性（terminaltransferase）119②不需要模板?、傩枰?’’—OH、二二甲胂酸緩沖沖液。③底物可以以是單鏈DNA、是3’’—OH突出出的雙鏈DNA、平末端需Co2+激活，但反應應效率低。④隨機添加加的dNTPs。如果只有一種種dNTP，，就添加上同聚物。DNA5’’3’TTTdTTP，，末端轉(zhuǎn)移酶酶1204.末端轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移酶的用途途（1）同聚物物加尾給外源DNA片片斷和載體分子分別加上上互補的同聚聚物尾巴，以以使它們有效效地連接。外源DNA載體DNA5’3’5’3’CCCCCCGGGGGGdGTPdCTP末端轉(zhuǎn)移酶121（2）再生酶酶切位點便于回收克隆隆片斷。AAGCTTTTCGAA5’5’HindⅢ酶切ATTCGAAGCTTAKlenow補平122AAGCTTTCGAAGCTTTCGAAAAGCATTTTTCGAAGCTTTTTTCGAA末端轉(zhuǎn)移酶dTTPAAAAAA外源DNA123（3）DNA3’－OH末端標記AAGCTTTTTTCGAAGCTTTTTTCGAAAAAAAAHindⅢ位點HindⅢ位點連接催化非放射性或放放射性標記物摻入DNA片斷的的3’端。（生物素-11-dUTP等）124二、T4多核核苷酸激酶1.來源T4噬菌體的的pseT基因編碼。。從T4感染染大腸桿菌細細胞中分離出出來。多種哺乳動物物細胞中也發(fā)發(fā)現(xiàn)這種酶。。2.功能其激酶活性位于N－端附附近，磷酸酶活性位于C－端附附近。催化-磷酸從ATP轉(zhuǎn)給雙鏈或或單鏈DNA或RNA的的5’-OH端。不論5’-OH端突出與與否。1255’3’HO--OH5’3’HO--OH3’P--OH5’3’HO--P5’ATPT4多核苷酸酸激酶如果ATP的的-磷酸帶有32P標記，就可可見被轉(zhuǎn)移到到DNA的5’端。但天然的DNA的5’端端都是磷酸化化的。1263.多核苷苷酸激酶的用用途DNA5’-OH端磷磷酸化化、標標記DNA的5’端端。5’3’HO--OH5’3’HO--OH3’32P--OH5’3’HO--32P5’(-32P)ATP多核苷苷酸激激酶3’P--OH5’3’HO--P5’堿性磷磷酸酶酶（1））正向向反應應（forwardreaction））127（2））交換換反應應標記記法反應混混合物物中具具有超超量(-32P)ATP和ADP時，，多核核苷酸酸激酶酶能催催化(-32P)ATP的-32P與DNA5’端端的磷磷酸交換。3’P--OH5’3’HO--P5’3’32P--OH5’3’HO--32P5’(-32P)ATP、ADP多核苷酸激激酶反應效果不不理想。128三、堿性磷磷酸酶1.堿性性磷酸酶種種類從大腸桿菌菌中分離出出來。Bacterialalkalinephosphatase，BAP（1）細菌菌性堿性磷磷酸酶（2）小牛牛腸堿性磷磷酸酶Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP從小牛腸中中純化出來來。具有抗熱性性。SDS中加加熱68oC可完全失失活。1292.堿性性磷酸酶的的特性催化脫掉DNA（或或RNA））5’端的磷磷酸根。3’P--OH5’3’HO--P5’5’3’HO--OH5’3’HO--OH堿性磷酸酶酶3.堿性性磷酸酶的的功能（1）防止止線性化的的載體份子子自我連接接130單一酶切口口的載體的的粘性末端端容易自我我連接。AAGCTTTTCGAAHindⅢⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A堿性磷酸酶酶5’5’