基于RPA-LFD的寨卡病毒檢測方法的建立與評價

基于RPA-LFD的寨卡病毒檢測方法的

建立與評價摘要本研究旨在建立一種寨卡病毒的RPA-LFD檢測體系，達到簡捷、靈敏、特異的檢測目的，更好地應用于口岸衛(wèi)生檢疫及基層現(xiàn)場檢測。通過引物設計篩選和反應條件的優(yōu)化，建立寨卡病毒RPA-LFD檢測技術，并對其靈敏性、特異性進行評估。通過檢測41例臨床樣本，對檢測體系的可行性及效果進行評估。檢測結果具有特異性，與常見病原無交叉反應；與熒光定量PCR（qPCR）技術、PCR技術進行比較，具有很好的靈敏度，且可通過肉眼判斷檢測結果。結果顯示，該方法可彌補PCR技術無法進行現(xiàn)場篩查的缺陷，非常適合口岸衛(wèi)生檢疫及基層現(xiàn)場檢測，具有廣闊的應用前景。關鍵詞寨卡病毒；RPA-LFD;快速檢測；衛(wèi)生檢疫EstablishmentandEvaluationofDetectionMethodfor

ZikaVirusBasedonRPA-LFDAbstractTheaimofthisstudywastoestablishasimple,sensitiveandspecificRPA-LFDdetectionsystemforZikavirus,whichcouldbebetterusedinporthealthquarantineandfrontlinedetection.Byscreeningprimerdesignandoptimizingreactionconditions,theRPA-LFDdetectiontechniqueforZikaviruswasestablished,anditssensitivityandspecificitywereevaluated.Inaddition,41clinicalsamplesweretestedtoevaluatethefeasibilityandeffectivenessofthedetectionsystem.ComparedwithfluorescencequantitativePCR(qPCR)andPCR,theresultsofRPA-LFDshowedgoodsensitivityinthedetectionofZikavirusandnocross-reactionwithcommonpathogens,andtheresultscouldbejudgedbythehumaneye.Theresultsshowedthatitwasverysuitableforporthealthquarantineandfrontlinedetection,withbroadprospectforapplication.KeywordsZIKV;RBA-LFD;quicktest;healthquarantine寨卡病毒病是由寨卡病毒（Zikavirus，ZIKV）引起的，屬于黃病毒科，主要通過伊蚊叮咬進行傳播［1］，是近年來重要的新發(fā)傳染病之一。該傳染病最近幾年在拉丁美洲和加勒比海國家廣泛流行，對人體具有較大的危害，能引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如格林巴利綜合征，若孕婦感染則引起胎兒小頭癥等。隨著全球貿易一體化，交通和旅游業(yè)飛速發(fā)展，我國也面臨著寨卡病毒的輸入性風險。目前，針對ZIKV的檢測方法主要有2種：①病原學檢測，可以通過病毒核酸（PCR技術）、病毒抗原（免疫組化法）以及病毒分離培養(yǎng)進行檢測；②血清學診斷，可以采用酶聯(lián)免疫吸附法、免疫熒光法及中和試驗等，檢測寨卡病毒的IgM個和中和抗體，發(fā)病后7d左右可以被檢出。PCR核酸檢測技術對實驗室資質、環(huán)境、儀器設備及實驗人員都有較高要求，而可應用于基層及現(xiàn)場檢測的快速且簡便的核酸擴增技術相對缺乏。重組酶聚合酶擴增技術（RPA）相較于其他恒溫核酸擴增技術，優(yōu)勢更加明顯［2-3］。該技術對樣本及實驗室要求較低，在25?45。。環(huán)境下反應3?10min,即可將少量核酸分子擴增至可檢出水平，結合側流層析試紙條（LFD）形成RPA-LFD快速診斷方法，該方法的可視化診斷通過肉眼直接判定結果［4-6］。RPA-LFD更加適合口岸現(xiàn)場、社區(qū)、門診、基層等資源受限領域的應用［7-9］，具有廣闊的應用前景。本研究是以RPA技術為基礎，結合膠體金試紙條LFD,建立RPA-LFD檢測體系，在臨床上能夠快速、準確地檢測寨卡病毒，為現(xiàn)場快速篩查提供了一種新方法。1材料與方法1.1材料登革熱病毒核酸、ZIKV核酸、黃熱病毒核酸、基孔肯雅熱病毒核酸和日本腦炎病毒核酸，均來自大連國際旅行衛(wèi)生保健中心的媒介生物實驗室、重慶國際旅行衛(wèi)生保健中心的媒介生物實驗室和江蘇國際旅行衛(wèi)生保健中心的媒介生物實驗室。引物、探針及基因測序工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成；QIAampViralRNAMiniKit購于QIAGEN公司；TwistAmpTMexoRTkit和TwistAmpTMnfo由英國TwistDx公司生產(chǎn)；PCRMasterMix試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司；膠體金側向流免疫層析試紙條購于杭州優(yōu)思達生物技術有限公司；相關耗材（Tip頭、EP管等）購于ThermalScientificFisher公司，均為無RNase、DNase和無熱源的分子生物學耗材。1.2實驗方法ZIKV核酸檢測及序列測定參照QIAampViralRNAMiniKit試劑盒提取ZIKV病毒總RNA。本課題檢測方法參照了美國疾病預防控制中心的檢測方法，以寨卡病毒E蛋白基因RNA為靶基因，上游擴增引物為ZIKVE-F（5'-CCGCTGCCCAACACAAG-3'），下游擴增引物為ZIKVE-R（5'-CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT-3'），探針為ZIKVE-Probe（5'-FAMAGCCTACCTTGACAAGCAGTCAGACACTCAATAM-3'）。ZIKVE基因質粒標準品的制備以測序后的ZIKVE基因DNA為模板，50應反應體系，反應程序后將純化過的核酸片段克隆到PMD18-T載體上用于構建質粒，測定核酸含量按照公式計算：拷貝數(shù)（copies/應）=質粒濃度（ng/應）10-9X6.02X1023/（660X質?？傞L度），計算出ZIKVE基因質?？截悢?shù)為5.6X106拷貝/應。1.2.3弓物的設計與篩選根據(jù)RPA引物設計原則，在保守基因區(qū)域，設計3對候選引物及探針引物，從中選擇最佳引物。上下游引物5'端分別用FAM和Biotin進行標記，擴增反應參照試劑盒說明書進行，反應條件采用37。溫育20min，反應結束后測量熒光強度，選擇強度最合適的一對引物。標記后引物用于RPA-LFD方法的建立。1.2.4RPA-LFD試紙條檢測體系的建立以拷貝數(shù)為104拷貝/應質粒標準品為模板進行反應條件的優(yōu)化。通過對反應溫度（25。、30°C、35°C、37°C、40°C、42C）以及反應時間（5min、10min、15min、20min、25min、30min）進行比對，選取最優(yōu)化的反應溫度和時間，將優(yōu)化后的擴增產(chǎn)物均通過膠體金側向流試紙條進行檢測。1.2.5膠體金側向流免疫層析試紙條反應裝置使用方法核酸擴增結束后，將0.2mLPCR管放入膠體金側向流免疫層析試紙條反應裝置中觀察結果，結果判定如下。①陽性：出現(xiàn)質控線和反應線兩條紅線，其中一條位于檢測區(qū)（T）內，另一條位于質控區(qū)（C）內。②陰性：僅出現(xiàn)一條紅色質控線，在檢測區(qū)（T）內無條帶出現(xiàn)。1.2.6靈敏度檢測以拷貝數(shù)為104拷貝/^L的質粒標準品為模板，將構建的標準質粒作10倍倍比稀釋至單拷貝/應，分別進行RPA-LFD檢測、實時熒光定量PCR（qPCR）和PCR檢測，對比3種檢測方法的敏感度。RPA擴增反應的溫度、時間均按照優(yōu)化后的條件進行，擴增產(chǎn)物通過膠體金側向流免疫層析試紙條的檢測，確定該方法靈敏度。每個試驗至少重復3次，確定RPA-LFD方法的靈敏度。1.2.7特異性檢測以乙型腦炎病毒、基孔肯雅熱病毒、黃熱病毒和登革熱病毒DNA為模板作為特異性反應對照組，模板濃度為104拷貝々L,按照優(yōu)化后的條件進行RPA擴增反應，通過膠體金側向流免疫層析試紙條檢測擴增產(chǎn)物，觀察試紙條T、C線顏色變化。對所建立的RPA-LFD檢測方法進行特異性分析，每個試驗至少重復3次，確定RPA-LFD方法的特異性。1.2.8樣本檢測為了評估該RPA-LFD檢測體系的實際應用效果，用RPA-LFD技術對25名健康志愿者和16個寨卡病毒核酸陽性樣本進行檢測，同時用傳統(tǒng)的RT-PCR方法和qPCR法對上述樣本進行檢測，比較3種檢測方法的靈敏度、特異性、陽性數(shù)等參數(shù)。2結果與分析2.1引物的篩選根據(jù)熒光曲線產(chǎn)生的時間和熒光強度選擇Zika-RPA-1引物，該引物在5min左右即可產(chǎn)生熒光曲線，比其他引物更早，因此選擇其作為建立RPA-LFD方法的引物。在此基礎上依據(jù)探針設計原則設計RPA-LFD探針。結果顯示3對引物均能夠激發(fā)出熒光，如圖1所示。圖1圖1引物的篩選Fig.1Primerscreening(Am)傘妙玄糕2.2反應溫度的優(yōu)化寨卡病毒RPA-LFD反應體系分別在25。。、30°C、35°C、37°C、40°C、42°C條件下進行擴增結果顯示（圖2），25?42C溫度范圍內均可有效擴增，37C時側向流免疫層析試紙條顯色深度明顯且均勻，因此本實驗優(yōu)選37C作為后續(xù)試驗的反應溫度。圖2反應溫度的優(yōu)化Fig.2Optimizationofreactiontemperature2.3反應時間的優(yōu)化配置上述反應體系，37C條件下進行反應,分別在5min、10min、15min、20min、25min、圖3反應時間的優(yōu)化Fig.3Optimizationofreactiontime圖3反應時間的優(yōu)化Fig.3Optimizationofreactiontime圖6PCR的靈敏度試驗Fig.6PCRsensitivitytest30min終止反應，待全部反應結束后進仃結果判讀（圖3）。綜合實驗時間和結果的可靠性，選取最佳反應時間為20min。2000-1500-1000-圖5qPCR靈敏度試驗2000-1500-1000-圖5qPCR靈敏度試驗Fig.5qPCRsensitivitytest3結論2.4靈敏度分析通過將構建的標準質粒模板作10倍倍比稀釋，分別選取100?104模板濃度進行RPA擴增，反應20min，5min內讀取LFD的檢測結果，結果顯示該RPA-LFD檢測方法可檢出的最低量為102拷貝/應（圖4），qPCR檢測方法的最低限是101拷貝/應（圖5），普通PCR的檢出限為103拷貝@（圖6），說明本試驗所建立的RPA-LFD檢測方法敏感性高于普通PCR，低于熒光定量PCR，具有較高的敏感性。NC 104 103 102 101 10°圖4RPA-LFD靈敏度試驗Fig.4RPA-LFDsensitivitytest

2.5特異性分析特異性實驗結果：滴加至側流試紙20min內，只有寨卡病毒出現(xiàn)明顯陽性條帶，即出現(xiàn)質控線（C）和反應線（T）2條紅線，其他病毒及陰性對照均只出現(xiàn)質控線（C），未出現(xiàn)反應線（T），如圖7所示,證明引物和探針存在高度特異性。該實驗表明本方法對寨卡病毒的檢測具有良好的特異性。圖7特異性試驗Fig.7Specificitytest2.6臨床樣本檢測應用ZIKVRPA-LFD、rt-PCR和qPCR檢測方法分別對25名健康志愿者和16個寨卡病毒核酸陽性樣本進行檢測，結果顯示：RPA-LFD檢測出陽性15例、陰性26例，rt-PCR檢測出陽性12例、陰性29例，qPCR檢測出陽性16例、陰性25例。結果表明，本研究建立的ZIKVRPA-LFD檢測方法靈敏度較高、特異性強，可用于現(xiàn)場檢測。ZIKV為嗜神經(jīng)病毒，可能會造成神經(jīng)和自身免疫系統(tǒng)并發(fā)癥（格林-巴利綜合征［10］）,以及導致胎兒先天性小頭畸形?？刂圃摷膊∽钣行У拇胧┦羌皶r發(fā)現(xiàn)病例并進行隔離。目前，病毒核酸檢測技術具有靈敏、快速、特異性高的優(yōu)點，迄今已建立包括PCR、LAMP和qPCR［11］等多種核酸檢測分子生物學方法。PCR技術雖然具有良好的靈敏度和特異性，但對于實驗室和人員均有較高要求，必須專業(yè)實驗室才可以進行檢測。在實際操作中，對現(xiàn)場或突發(fā)事件的病例篩查不能及時檢測，很容易延誤病情，造成嚴重后果，因此，探究并找到一種快捷、簡單、靈敏、特異的ZIKV診斷技