代謝組學(xué)小常識(shí)

代謝組學(xué)小知識(shí)觀點(diǎn)：代謝組：指一個(gè)細(xì)胞、組織或器官中全部代謝物的會(huì)合,包含一系列不同種類的小分子（往常分子量<1000）,比方肽、碳水化合物、脂類、核酸等。代謝組學(xué)：經(jīng)過(guò)觀察生物系統(tǒng)（細(xì)胞、組織或生物體）受刺激或擾動(dòng)后，其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化，來(lái)研究生物系統(tǒng)的一門(mén)科學(xué)。實(shí)驗(yàn)流程：（以液質(zhì)聯(lián)用為基礎(chǔ)的代謝組學(xué)為例）樣本前辦理：在保證小分子代謝物完好的前提下，辦理的步驟越簡(jiǎn)單越好，以保證操作簡(jiǎn)單重復(fù)，也為大量量樣本的辦理節(jié)儉時(shí)間。數(shù)據(jù)采集：依照實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠兴煌?。非目?biāo)代謝組學(xué)：采納高分辨質(zhì)譜儀（TOF，Orbitrap等），有助于檢測(cè)到盡可能多的化合物，此外高分辨的質(zhì)核比數(shù)據(jù)也有助于數(shù)據(jù)庫(kù)檢索以及化合物的判定。目標(biāo)代謝組學(xué)：往常使用三重四極其桿質(zhì)譜，提升檢測(cè)的敏捷度以及定量的正確性。o

數(shù)據(jù)預(yù)辦理：峰提取，擺列，歸一化。多半質(zhì)譜商家都供給了配套的預(yù)辦理軟件，比如安捷倫企業(yè)的MassHunter，熱電的Sieve，沃特世的MarkerLynx

以及

ProgenisisQI

。o

同時(shí)也有一些鑒于網(wǎng)絡(luò)的能夠免費(fèi)獲取的軟件。建議使用配套的軟件，因?yàn)椴恍枰~外的數(shù)據(jù)變換，不需要上傳數(shù)據(jù)，節(jié)儉時(shí)間。數(shù)據(jù)剖析：多元統(tǒng)計(jì)剖析包含主成份剖析（PCA）,偏最小二乘鑒別剖析（PLS-DA），正交偏最小二乘鑒別剖析（OPLS-DA），聚類剖析（HCA）等。各個(gè)廠商也供給了相應(yīng)的統(tǒng)計(jì)剖析軟件，比方安捷倫的MPP，熱電的Sieve，沃特世的Ezinfor。當(dāng)前常用的第三方軟件是Simca-p，同時(shí)也有一些網(wǎng)絡(luò)的開(kāi)源軟件能夠使用?；衔锱卸ǎ簲?shù)據(jù)庫(kù)檢索，標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，二級(jí)質(zhì)譜對(duì)照。代謝組學(xué)文章中常有的統(tǒng)計(jì)圖（一）主成分剖析（PCA）PCA得分圖（scoreplot），用來(lái)看樣本天然的分組狀況，在剖析時(shí)不加任何分組信息。圖中每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本，樣本在空間中所處的地點(diǎn)由此中所含有的代謝物的差別決定。PCA載荷圖（loadingplot），用來(lái)找尋差別變量。同種的每一個(gè)點(diǎn)代表樣本中還有的一個(gè)代謝物物，距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)的代謝物被以為對(duì)樣本的分類貢獻(xiàn)越大。偏最小二乘鑒別剖析（PLS-DA）得分圖和載荷圖的解說(shuō)同PCA。差別在于，PLS-DA在剖析時(shí)提早給予每個(gè)樣安分組信息，簡(jiǎn)單說(shuō)，就是在剖析時(shí)擴(kuò)大組間差別，減少組內(nèi)差別，多用來(lái)找尋標(biāo)志物。正交偏最小二乘鑒別剖析（OPLS-DA）在OPLS-DA剖析中，找尋標(biāo)志物往常使用S-plot。如圖中所示，得分圖中，兩組樣本散布在y軸雙側(cè)，經(jīng)過(guò)S-plot能夠獲取標(biāo)志物在兩組中相對(duì)含量的變化。也就是說(shuō)，處在S-plot右上角的化合物（距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，對(duì)分類貢獻(xiàn)越大）在處在得分圖y軸右邊的樣本中含量較高，反之亦然。代謝組學(xué)文章中常有的統(tǒng)計(jì)圖（二）圖中每一行代表一個(gè)化合物，每一列代表一個(gè)樣本。上面對(duì)樣本進(jìn)行聚類剖析，左側(cè)對(duì)化合物進(jìn)行聚類剖析。綠色代表該化合物在樣本中含量較低，紅色代表含量較高（也實(shí)用其余顏色表示的）。經(jīng)過(guò)此圖，能夠直觀地看出化合物在樣本間的變化趨向；同時(shí)也能夠找出擁有同樣變化趨向的代謝物。在對(duì)化合物進(jìn)行判定以后或選擇出生物標(biāo)志物以后，可將化合物名稱（或?qū)?yīng)的HMDB或者KEGG編號(hào)）輸入MetaboAnalyst軟件（免費(fèi)）進(jìn)行此剖析，來(lái)察看體內(nèi)哪些代謝門(mén)路遇到了影響。在圖中，p值越?。?logo(p)越大），pathwayimpact越大，證明該條代謝通路被嚴(yán)重?cái)_動(dòng)。此剖析可用來(lái)找尋化合物之間的內(nèi)在聯(lián)系（數(shù)值上的聯(lián)系），如圖中紅色表示負(fù)有關(guān)，黃色表示正有關(guān)?？捎脕?lái)挑選與某一類或許某一個(gè)自己感興趣的化合物產(chǎn)生正有關(guān)或許負(fù)有關(guān)的代謝物。用來(lái)評(píng)論算選出的標(biāo)志物的診療能力。AUC曲線下邊積越大，診療能力越好。非目標(biāo)代謝組學(xué)（untargetedmetabolomics）中常用的方法學(xué)考察的方法QC樣本的制備：混雜同樣體積的全部待檢測(cè)樣本，而后依照與待測(cè)樣真同樣的前辦理方法來(lái)辦理QC樣本，以后進(jìn)樣進(jìn)行LC-MS剖析。樣本檢測(cè)時(shí)，往常在檢測(cè)最開(kāi)始運(yùn)轉(zhuǎn)幾次QC樣本，以后依據(jù)樣本量的大小在每檢測(cè)幾個(gè)樣本以后檢測(cè)一次QC樣本。方法學(xué)觀察：方法一：最早使用的一種方法，從QC樣本的總離子流圖中選擇擁有代表性的離子峰（覆蓋不同的保存時(shí)間，不同的強(qiáng)度），在對(duì)QC樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)以后，計(jì)算這些離子的保存時(shí)間以及峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD），用以觀察剖析方法的穩(wěn)固性以及重復(fù)性。方法二：全部樣品檢測(cè)完以后，采集全部的QC樣本的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)辦理，包含（峰提取，擺列，歸一化等），經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾（80%規(guī)則）以后，計(jì)算剩下的峰的峰面積的RSD值。往常假如在一個(gè)樣本中有超出70%的化合物的RSD值小于等于30%，則證明該方法有優(yōu)秀的穩(wěn)固性以及重復(fù)性，所獲取的數(shù)據(jù)靠譜（也有不同的評(píng)論標(biāo)準(zhǔn)，比方要求LC-MS數(shù)據(jù)小于20%，GC-MS數(shù)據(jù)小于30%等）。圖中柱形圖表示化合物在不同RSD范圍內(nèi)的百分比散布，折線圖表示在不同RSD范圍的累計(jì)百分比。方法三：原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)預(yù)辦理以后，將全部樣本（包含QC樣本）進(jìn)行PCA剖析，在得分圖中察看QC樣本的齊集程度。因?yàn)镼C樣本是等量混雜了全部的被檢測(cè)樣本，理論上

QC樣本包含了全部樣本中的代謝物，所以

QC樣本理論上會(huì)散布在原點(diǎn)四周。圖中QC樣本密切齊集，證明方法穩(wěn)固，重復(fù)性優(yōu)秀。方法四：采納混雜標(biāo)準(zhǔn)品作為QC，該QC往常包含不同物理化學(xué)性質(zhì)的體內(nèi)和體外代謝物（使所選擇的化合物擁有代表性）。檢測(cè)結(jié)束后，計(jì)算這些化合物的保存時(shí)間以及峰面積的RSD用以對(duì)分別剖析方法進(jìn)行評(píng)論。代謝組學(xué)研究中需要認(rèn)識(shí)的質(zhì)譜知識(shí)（一）主要介紹以液質(zhì)聯(lián)用為剖析工具的代謝組學(xué)研究中的常有問(wèn)題：在剖析樣本時(shí)，要采納什么質(zhì)譜？質(zhì)譜儀中往常依照質(zhì)量剖析器以及聯(lián)用方式的不同對(duì)證譜進(jìn)行分類，常有的包含包含：?jiǎn)嗡募?jí)桿，三重四級(jí)桿，飛翔時(shí)間（TOF），Q-TOF，離子阱，線性離子阱（LTQ），靜電場(chǎng)軌道阱（Orbitrap），LTQ-Orbitrap等。這么多質(zhì)譜，我們應(yīng)當(dāng)怎樣選擇？在靶向代謝組學(xué)中，往常使用三重四級(jí)桿質(zhì)譜。因?yàn)榘邢虼x組學(xué)是針對(duì)某一些特定的化合物進(jìn)行定量檢測(cè)，而LC-QqQ/MS在MRM掃描模式下對(duì)化合物進(jìn)行定量剖析（如藥代動(dòng)力學(xué)研究）已特別廣泛，所以使用此方法以達(dá)到更高的敏捷度，更正確的定量。在非靶向代謝組學(xué)研究中，需要選擇高分辨質(zhì)譜進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，因?yàn)楦叻直尜|(zhì)譜能夠幫助我們檢測(cè)到盡可能多的化合物，供給所檢測(cè)化合物的精準(zhǔn)分子量，同位素散布等信息，有助于化合物的判定。何為高分辨？第一認(rèn)識(shí)以下分辨率，分辨率就是指質(zhì)譜儀劃分兩個(gè)質(zhì)量鄰近的離子的能力。這個(gè)劃分能力也有不同的定義，如10%峰谷分別，50%峰谷分別等。理論知識(shí)就不多解說(shuō)了，舉個(gè)例子說(shuō)明便知。以H為例，低分辨質(zhì)譜測(cè)得的H的分子量為1，而高分辨質(zhì)譜測(cè)得的H分子量為（自然，能測(cè)到多精準(zhǔn)，取決于分辨率有多高）。有什么用呢？實(shí)用！以C2H4，CO，N2為例，這三者在低分辨質(zhì)譜中測(cè)得的分子量均為28，也就是說(shuō)低分辨的質(zhì)譜沒(méi)有方法依據(jù)分子量將三者分別；可是高分辨質(zhì)譜測(cè)得三者的分子量分別為，，，能夠?qū)⑷叻珠_(kāi)。所以在非靶向代謝組學(xué)中，因?yàn)樯飿颖局谢衔锏臉?gòu)成特別復(fù)雜，所以要用高分辨的質(zhì)譜儀對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，以達(dá)到盡可能多的檢測(cè)到化合物的目的。常用的高分辨質(zhì)質(zhì)量剖析器：TOF和Or比trap，以及他們與其余質(zhì)量剖析器的聯(lián)用形式如Q-TOF，Q-Orbitrap，LTQ-Orbitrap等。注：能夠簡(jiǎn)單的以為，分辨率越高，劃分別子的能力越強(qiáng)，即能夠劃分別子在很細(xì)微的分子量上的差別。但請(qǐng)不要將分辨率和質(zhì)量精度混雜，二者不同樣。有一個(gè)簡(jiǎn)單的類比，低分辨質(zhì)譜對(duì)照高分辨質(zhì)譜就近似于一般天平對(duì)照十萬(wàn)分之一天平，精細(xì)天平能夠劃分物質(zhì)質(zhì)量的細(xì)微差別，可是天平稱出的質(zhì)量正確與否，取決于天平在使用以前能否校訂。代謝組學(xué)研究中需要認(rèn)識(shí)的質(zhì)譜知識(shí)（二）上一篇介紹了以下質(zhì)譜的分辨率，高分辨率質(zhì)譜有劃分分子量細(xì)微差別的能力，可是測(cè)得的分子量準(zhǔn)確與否，則要看質(zhì)譜的質(zhì)量精度了。分辨率和質(zhì)量精度不同樣，高分辨質(zhì)譜也會(huì)有質(zhì)量偏差很大的狀況，那今日就來(lái)談一談質(zhì)量精度。什么是質(zhì)量精度？質(zhì)量精度指的是質(zhì)譜測(cè)得值和理論值之間的偏差。常以mDa或許ppm表示。舉個(gè)例子：C6H12O6理論精準(zhǔn)分子量為，假如測(cè)得分子量為，則偏差為或許即~~~~~~~~~~~~~~~~~~在液質(zhì)聯(lián)用中，化合物往常是以加合離子的形式出現(xiàn)，如[M+H]+，[M+Na]+等，以上不過(guò)舉例說(shuō)明。那么，怎樣保持較高的質(zhì)量精度呢？全部的高分辨質(zhì)譜在使用以前都需要對(duì)證譜儀進(jìn)行校訂，這個(gè)校訂其實(shí)就是校訂質(zhì)譜的質(zhì)量軸。就像我們使用十萬(wàn)分之一天平常用一個(gè)200克的砝碼對(duì)天平進(jìn)行校訂同樣，質(zhì)譜的校訂也是使用一系列已知分子量的物質(zhì)（覆蓋了從低到高的質(zhì)量范圍）對(duì)其進(jìn)行校訂。能夠接受的偏差往常為2ppm，校訂的頻次依實(shí)質(zhì)狀況而定，Q-TOF質(zhì)譜大部分一周校訂一次，Orbitrap質(zhì)譜校訂的頻次稍少一些。各大儀器廠商常用的校訂液以下：別的，幾乎全部的Q-TOF質(zhì)譜除了在檢測(cè)以行進(jìn)行質(zhì)量軸校訂外，在質(zhì)譜運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中還需要對(duì)證譜進(jìn)行及時(shí)校訂。在非目標(biāo)代謝組學(xué)中，代謝物的判定往常依靠精準(zhǔn)分子量，同位素散布等信息，儀器的數(shù)據(jù)辦理軟件往常能夠依據(jù)采集到的質(zhì)譜圖對(duì)其元素構(gòu)成進(jìn)行推斷，方便化合物的判定，推斷的前提就是質(zhì)量精度要高，在進(jìn)行推斷時(shí)往常需要輸入一個(gè)能夠接受的偏差范圍（如