流式細胞檢測技術講座

關于流式細胞檢測技術講座第1頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五主要內容

流式細胞技術概念流式細胞技術原理流式實驗的設計流式細胞技術在臨床&科研上的應用第2頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五流式細胞技術概述

流式細胞技術的概念流式細胞技術的特點流式細胞儀的檢測范圍

BD公司流式細胞儀流式細胞儀的結構第3頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五什么是FCM？流式細胞術：利用流式細胞儀對處于快速流動的細胞或生物顆粒進行多參數(shù)、快速的定量分析及分選的技術激光技術+流體力學+光電測量技術+計算機技術+細胞熒光化學技術+單克隆抗體技術第4頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五FCM的特點測量速度快：最快可在1秒種內檢測上萬個細胞可進行多參數(shù)測量：可以對同一個細胞做有關物理、化學特性的多參數(shù)測量具有明顯的統(tǒng)計學意義：提供細胞群體的均值和分布情況高分辨率(CV<2%)、高靈敏度(熒光檢測靈敏度≤100MESF，前向角散射光檢測靈敏度(0.2～0.5um)既是細胞分析技術，又是精確的分選技術，分選純度可達99%以上第5頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五流式細胞儀的檢測范圍細胞結構細胞大小細胞顆粒度細胞表面面積核漿比例DNA含量與細胞周期RNA含量蛋白質含量細胞功能細胞表面/胞漿/核的特異性抗原細胞活性細胞內細胞因子酶活性激素結合位點細胞受體第6頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五BD公司流式細胞儀FACSCaliburLSRIIFACSCantoFACSCountFACSVantageFACSAria第7頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五流式細胞儀的結構光路：

1、激光光源及光束成形系統(tǒng)：

氬離子(488nm)

紅色氦氖激光(633nm)

2、光學系統(tǒng)：透鏡、濾光片、小孔液路——流動室及液流驅動系統(tǒng)（鞘流原理）信號檢測與分析：光電倍增管(PMT)、補償電路存儲、顯示、分析系統(tǒng)：計算機細胞分選系統(tǒng)

第8頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五流式細胞技術原理熒光發(fā)生機理及熒光光譜濾光片散射光信號的檢測熒光信號的檢測數(shù)據(jù)的儲存與分析第9頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五熒光及熒光發(fā)生機理簡介

熒光及熒光素：某些物質在特定波長范圍內的光線照射下，可發(fā)出波長比照射光波長長的光線——即熒光。受激發(fā)后能產(chǎn)生熒光的物質稱熒光物質或熒光素熒光發(fā)生機理：室溫下熒光素分子大部分處于“基態(tài)”，當熒光素在一定波長（激發(fā)波長）的光的照射下吸收光能后（經(jīng)染色后的細胞在激光束的照射下），熒光染料吸收能量能級躍遷，進入新的狀態(tài)，稱為“激發(fā)態(tài)”，處于激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，它可以通過在10-9～10-7秒的極短時間內以發(fā)射一定波長的光量子的方式釋放所吸收的能量從而返回到基態(tài)。這一過程稱為熒光發(fā)射，也就是發(fā)光。第10頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五熒光素的激發(fā)和發(fā)射光譜

任何發(fā)熒光的物質分子都具有這兩個特征光譜

激發(fā)光譜（Excitation，Ex）：

是指能特異性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內的光線，也稱為吸收光譜。吸收波峰（最大吸收波長）：Ex-Max

發(fā)射光譜（Emission，Em）：

是指某一波長激發(fā)光引起熒光素發(fā)射的一定波長范圍內的熒光發(fā)射波峰（最大發(fā)射波長）：Em-Max

熒光素的使用：

選擇正確的激光器確定所需熒光探測器（PMT）488nm520nm異硫氰酸熒光素（FITC）第11頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五LongpassShortpassBandpass460500540460500540475500525SP500LP500BP500/50光學系統(tǒng)：濾光片置于熒光探測器前，限定其接收的熒光的波長范圍第12頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五熒光光譜示意圖第13頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五第14頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五散射光信號FSCSensorLaserSSCSensor第15頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五散射光信號RightAngleLightDetector

CellComplexitySSCForwardLightDetector

CellSurfaceArea

FSCIncidentLightSource前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

反應細胞相對大小及其表面積

側向角散射光（SSC,SideScatter）

反應細胞顆粒度及細胞內細胞器的相對復雜性第16頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五外周全血細胞散射光雙參數(shù)點圖

（紅細胞溶解后）第17頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五第18頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五流式細胞儀的熒光檢測信號熒光信號使用熒光標記的單克隆抗體染色，做多色分析熒光信號的強弱，反映了細胞抗原的表達含量第19頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)存儲:LISTMODE

數(shù)據(jù)顯示:

直方圖(Histogram)

二維點圖(DotPlot)

等高線圖(ContourPlot)

密度圖(Density)

三維圖（3DPlot）等第20頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五數(shù)據(jù)分析直方圖分析第21頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五點圖分析數(shù)據(jù)分析第22頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五數(shù)據(jù)分析等高圖和密度圖分析第23頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五數(shù)據(jù)分析三維圖分析第24頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五第25頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五流式實驗設計原則常用熒光標記探針常用儀器熒光通道分布實驗對照、同型對照、補償對照熒光與抗體的搭配小結第26頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五常用的單克隆抗體熒光標記探針488nm激光激發(fā)：FITC（異硫氰酸熒光素）：熒光強度可受pH的影響，當pH降低時其熒光強度也隨之減弱PE（藻紅蛋白）PerCP（多甲藻葉綠素蛋白）：光量子產(chǎn)量并不太高，最好應用在檢測表達較高的抗原上PerCP-Cy5.5（葉綠素蛋白偶聯(lián)物）PE-Cy7（藻紅蛋白偶聯(lián)物）PE-Cy5（藻紅蛋白偶聯(lián)物，又稱Cy-Chrome）PE-TexasRed（藻紅蛋白-德州紅偶聯(lián)物，又稱ECD）633nm激光激發(fā)：APC（別藻青蛋白）APC-Cy7（別藻青蛋白偶聯(lián)物）第27頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五常用的核酸熒光標記探針PI（碘化丙啶）：可嵌入核酸（DNA、RNA）的雙螺旋堿基對中，主要用于對DNA染色，使用時需用RNase對細胞進行處理；不能透過活細胞膜對核酸染色，可用于鑒別活死細胞，對活細胞染色時需對細胞膜打孔，以便染料透過。488nm激光激發(fā)，發(fā)射光譜寬泛550～725nm，可與PE共用通道TO（噻唑橙）：可用于對網(wǎng)織紅細胞中的RNA進行檢測定量分析，TO的熒光強度與RNA含量由良好的線性關系，對細胞膜的通透性好，可直接對活細胞染色，488nm激發(fā)，可發(fā)射出530nm熒光，可與FITC共用通道第28頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五常用熒光素激發(fā)、發(fā)射、光源波長

以及適用機型第29頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五FACSCalibur光學濾片檢測器組（激光器）PMT位置帶通/長通透鏡適用染料488nm藍色激光FL1530/30FITCFL2585/42PE,PIFL3670LPPerCP,PerCP-Cy5.5PE-Cy7635nm紅色激光FL4661/16APC第30頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五FACSCanto光學濾片檢測器組（激光器）PMT位置帶通/長通透鏡適用染料八角形（488nm藍色激光）A780/60PE-Cy7B670LPPerCP-Cy5.5,PerCPC585/42PE,PID530/30FITC三角形（633nm紅色激光）A780/60APC-Cy7B660/20APC第31頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五FACSAria光學濾片檢測器排列（激光器）光電倍增管BP濾光片

可用染料八角形（488nm藍色激光）A780/60PE-Cy7B695/40PerCP-Cy5.5,PerCPC610/20PE-TexasRedD575/26PEE530/30FITC三角形（633nm紅色激光）A780/60APC-Cy7B660/20APC三角形（407nm紫色激光）A530/30AlexaFluor430B450/40CascadeBlue,PacificBlue,DAPI,Hoechst,AlexaFluor405第32頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五熒光染色對照陽性對照使用已知陽性樣本，幫助排除試劑的質量、濃度、特異性以及染色方法等因素陰性對照空白對照（自發(fā)熒光）自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細胞內部熒光分子經(jīng)光照發(fā)出的熒光。自發(fā)熒光信號為噪聲信號。一般說來，細胞成分中能產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子（核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強，如腫瘤細胞、粒細胞等；樣本死細胞比例越高，自發(fā)熒光越強。實驗樣本（自發(fā)熒光＋特異熒光＋非特異熒光）特異熒光，即抗體F(ab’)2段與細胞抗原特異結合上的熒光染料受光照發(fā)出的熒光非特異熒光，即抗體Fc段與細胞表面的Fc受體非特異結合上的熒光染料受光照發(fā)出的熒光同型對照（自發(fā)熒光＋非特異熒光）第33頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五同型對照同型對照（IsotypeControl）：與實驗染色的單克隆抗體特異性無關的免疫球蛋白亞型與染色的單克隆抗體①相同種屬來源②相同免疫球蛋白及亞型③相同熒光素標記④相同劑量和濃度⑤但由未免疫動物血清純化而來用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面的Fc受體而產(chǎn)生的背景染色例如，標記FITC的單克隆抗體為小鼠IgG1亞類抗體，標記PE的單克隆抗體為小鼠IgG2a亞類抗體，同型對照應用相同濃度和劑量的未免疫小鼠血清的純化IgG1（γ1）和IgG2a（γ2a），并分別標記FITC和PE第34頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五熒光染色補償對照的設置補償對照（雙色或多色分析時）熒光補償（compensation）是指在流式細胞多色分析中，糾正熒光素發(fā)射光譜重疊（spectraloverlap）的過程，即從一個被檢測的熒光信號中去除任何其他的干擾熒光信號將單種熒光素標記的單克隆抗體分別進行單色熒光染色

※幾色分析就需要制備幾個補償對照管設置補償?shù)幕静襟E：①上同型對照管，調節(jié)PMT電壓，使陰性細胞群體處于雙熒光散點圖的左下角101道以內；②分別上單陽補償管，依次調節(jié)相鄰熒光的補償設置，直至陽性和陰性細胞群處于最合適的位置第35頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五雙色熒光補償?shù)?6頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五雙色熒光補償?shù)?7頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五雙色熒光補償?shù)?8頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五雙色熒光補償?shù)?9頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五實驗設計實例分析類型管功能

加入的抗體單色分析1Isotypeγ1-FITC2Sample1,2……A-FITC雙色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PE2Compensation1A-FITCγ2a-PE3Compensation2γ1-FITCB-PE4Sample1,2……A-FITCB-PE三色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-PerCP2Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-PerCP3Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-PerCP4Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-PerCP5Sample1,2……A-FITCB-PEC-PerCP四色分析1Isotypeγ1-FITCγ2a-PEγ1-PerCPγ1-APC2Compensation1A-FITCγ2a-PEγ1-PerCPγ1-APC3Compensation2γ1-FITCB-PEγ1-PerCPγ1-APC4Compensation3γ1-FITCγ2a-PEC-PerCPγ1-APC5Compensation4γ1-FITCγ2a-PEγ1-PerCPD-APC6Sample1,2……A-FITCB-PEC-PerCPD-APCNo.AntibodyIsotypeMouseanti-human未免疫Mouse血清純化而來1A-FITC（γ1）γ1-FITC2B-PE（γ2a）γ2a-PE3C-PerCP（γ1）γ1-PerCP4D-APC（γ1）γ1-APC第40頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五熒光抗體組合的選擇用不同顏色的熒光素標記不同種類的單克隆抗體，可以在一個細胞上同時分析多種抗原分子，但并非各種熒光抗體均可以自由地組合在一起，在確定組合選擇之前，還必須考慮到一些影響因素流式細胞儀的類型及熒光光譜選擇適當強度的光源作為熒光物質的激發(fā)光源，并選擇適合于被檢熒光物質選擇性吸收的光譜濾光片接收熒光了解不同抗體的細胞反應譜，以及染色模式根據(jù)不同的實驗目的選擇抗體。因為相同CD編號的抗體可能識別不同的抗原決定簇。如CD45RA表達在幼稚/靜止T淋巴細胞，而CD45RO表達在記憶/活化T淋巴細胞。胞膜和胞內染色：通常，先胞膜染色，固定，膜通透和胞內染色，最后是DNA染色。第41頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五熒光抗體組合的選擇3.抗體結合熒光素的熒光強度

每一種熒光素的相對熒光強度都不一樣。一個特定抗體，能否區(qū)分陰性與陽性結果，即有較好的S/N比值，取決于該抗體用何種熒光素標記。熒光素相對強度也與儀器有關，這是由于不同儀器使用的激光和濾光片組合不同，因此造成了熒光強度的差別。下面列出了一般情況下，不同熒光素的相對強度的大小順序，某些個別的單克隆抗體的熒光標記情況會有所不同。

APC>PE>PerCP-Cy5.5>FITC>PerCP

4.抗原密度

高表達的抗原幾乎可以用任何熒光素標記的抗體檢測，而較低表達的抗原（如細胞因子）則需要用較高S/N比值的熒光素（如PE和APC）標記的抗體檢測，從而達到有效區(qū)分陽性細胞群和陰性細胞的目的。如血小板活化檢測試劑：

PAC-1-FITC/CD62P-PE/CD61-PerCP第42頁，共46頁，2022年，5月20日，5點56分，星期五熒光抗體組合的選擇5.熒光光譜之間的重疊在多色分析中，雖然可以通過熒光補償消除熒光光譜重疊的影響，但使用熒光探針的種類越多，補償?shù)膹碗s程度增加，因此選擇光譜重疊越少的組合越好6.自發(fā)熒光每個細胞群體的自發(fā)熒光水平都不同，自發(fā)熒光在高波長范圍里（>600nm）迅速降低。因此檢測自發(fā)熒光水平高的細胞時，使用發(fā)射光波長較長的熒光染料（如APC），可得到較好的S/N比7.熒光素濃度、配伍不當、試劑的質量均導致假陰性