流式細胞儀的應(yīng)用

關(guān)于流式細胞儀的應(yīng)用第1頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五流式細胞術(shù)在基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用細胞活力的檢測細胞周期分析細胞凋亡分析多藥耐藥基因研究（MDR）RNA測定、DNA測定細胞內(nèi)離子的測定及pH值測定第2頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五流式細胞術(shù)的臨床應(yīng)用白血病免疫分型HLA-B27:強直性脊柱炎淋巴細胞亞群造血干細胞計數(shù)：造血干細胞移植網(wǎng)織紅細胞PNH診斷（CD55、CD59）血小板活化試驗第3頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五

guavaeasyCyte?8HT微毛細管細胞分析儀

廠家：Millipore

獲獎理由：突破性的微毛細管技術(shù)，無需鞘液，樣品體積少，廢液更少，讓細胞分析變得更簡單、快捷、易于操控4第4頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五Guava多種分析GuavaViaCount活細胞絕對計數(shù)√

GuavaCellCycle細胞周期分析√GuavaExpressCellSurfaceAntigenDetection細胞表面蛋白檢測√GuavaRapidQuant小鼠及人的IgG定量√細胞凋亡√

GuavaNexinAnnexinV結(jié)合√

GuavaCaspase3/7√

GuavaCaspase8√

GuavaMultiCaspase√

GuavaTUNEL√

GuavaMitoPotential線粒體膜電位√

細胞示蹤√

GuavaCellToxicity細胞毒性：NK，CMC，ADCC√

GuavaCellPaint靶細胞監(jiān)測√

GuavaCellGrowth細胞增殖：原代細胞√

第5頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五第6頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五細胞活力的檢測在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力。第7頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五第8頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五第9頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五DeadCellDiscriminationCellsshouldnotbefixed/permeabilizedpriortorunningontheflowcytometer.Cellsareincubatedonicefor1-5minutesinPIatafinalconcentrationof2ug/ml.第10頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五細胞周期分析

第11頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五第12頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五在細胞周期內(nèi)DNA含量各時期發(fā)生周期性變化，通過熒光探針對細胞進行相對DNA含量測定，可分析細胞周期各時期相對的百分比，了解細胞群體的倍體性和增殖能力。DNA含量常和某種細胞周期相關(guān)蛋白同時檢測，來分析細胞處于某一特定周期階段。惡變腫瘤細胞一般多出現(xiàn)異倍體，DNA含量分析對腫瘤的診斷預(yù)后有很高的價值,尤其對細胞毒性藥物的研究很有價值。第13頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五G2MG0G1s02004006008001000G0G1sG2MDNAcontentCount2N4NG0期細胞被認為是不參與增殖周期循環(huán)的一群細胞，即為靜止細胞，其細胞DNA含量為較恒定的2N值，G1期細胞與G0期細胞DNA值相同，均為二倍體DNA含量，當細胞進入S期后，DNA含量逐漸增加，當細胞DNA倍增結(jié)束，進入G2期，最終進入M期，在M期分裂為兩個子細胞之前，G2和M期細胞的DNA含量均為恒定的4N值，即為四倍體細胞群。第14頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五G0-G1SG2-MFluorescenceIntensity#ofEventsAtypicalDNAHistogramofcellproliferation第15頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五樣品制備

1000rpm5分鐘收集2X106個細胞PBS漂洗兩次70%酒精4度固定過夜收集固定的細胞PBS漂洗0.5mlPBS懸浮細胞2.5μl10μg/μlRNaseA37度消化1小時過300目細胞篩50μl0.1mg/mlPI（含1%Triton)1000rpm5分鐘離心兩次混勻，室溫靜止5分鐘上機第16頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五經(jīng)RNA酶處理前后的比較RNA也是核酸，也會被PI染色，為避免干擾,染色前需用RNAse降解RNA。這樣PI只染DNA，能精確以熒光強度反映DNA的含量。第17頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五結(jié)果解讀G0/G1期細胞占總的61.2%，峰位于橫座標的45.76G2/M期占13.07，峰位于橫座標的91.43S期占25.73G2/G1為2.0（即G2期為4倍體細胞，而G1期為2倍體細胞，比值為2）峰的變異系數(shù)為4.54%（好）細胞碎片為0.48%，細胞聚集體有0.06%?？偟募毎麛?shù)（儀器檢測到的）為17525個，在細胞周期中分析的細胞數(shù)為17431個（即排除了碎片及聚集體后）CV是變異系數(shù)。一般CV越小，峰形越好，越尖銳。能控制在5%左右是比較好的結(jié)果，一般小于10%就可以認可了。

第18頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五應(yīng)用DNA含量測定鑒定細胞凋亡如果有凋亡，在G0/G1期前面有個凋亡峰(也稱sub-G0期)在凋亡細胞中，用PI染色，通過流式檢測DNA含量，可以發(fā)現(xiàn)一種亞群的細胞，其染色熒光強度下降。這是由于隨著調(diào)亡的進行，核酸內(nèi)切酶活化，隨后一部分DNA泄漏出去，造成細胞內(nèi)DNA含量下降造成的。第19頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五FlowCytometryofApoptoticCellsPI-Fluorescence#EventsApoptoticcellsNormalG0/G1cells第20頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五缺乏IL-3誘導(dǎo)的細胞凋亡第21頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五第22頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五在DNA直方圖上區(qū)分凋亡峰和細胞碎片峰上圖為細胞碎片峰，在二倍體G0/1峰之前呈左高右低的拋物線（藍色）上圖為細胞凋亡峰，在二倍體G0/1峰之前呈對稱分布的拋物線（藍色）第23頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五流式細胞術(shù)在生殖醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用精子細胞和精子為單倍體細胞1C;次級精母細胞為二倍體細胞2C;初級精母細胞和處于G2M期的精原細胞4C第24頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五細胞凋亡分析

第25頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五細胞凋亡特點：染色質(zhì)的濃縮,核膜及細胞膜的內(nèi)陷,接著核碎裂成分離的片段,凋亡小體(apoptosisbody)的出現(xiàn)。在流式細胞儀上，對于光散射特性觀察凋亡細胞的改變：由于細胞的固縮，體積變小，F(xiàn)SC會變小，而細胞碎片及顆粒增多，SSC也會改變。第26頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五在細胞凋亡過程中細胞形態(tài)學(xué)的變化第27頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五早早期凋亡的檢測---capase3早期凋亡Annexin-V-FITC/PI雙染法早期凋亡線粒體細胞膜電位的檢測晚期凋亡----“TUNEL”法晚晚期凋亡-----DNA含量分析法第28頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五第29頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五caspase-3Caspase家族在介導(dǎo)細胞凋亡的過程中起著非常重要的作用，其中caspase-3為關(guān)鍵的執(zhí)行分子，它在凋亡信號傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中，在凋亡的早期階段，它被激活，活化的Caspase-3由兩個大亞基（17KD）和兩個小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物，最終導(dǎo)致細胞凋亡。但在細胞凋亡的晚期和死亡細胞，caspase-3的活性明顯下降。第30頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五MassivesubstratecleavageApoptosisSignalingReceptorCamptothecinFasLFADDPro-caspase–8MitochondrialActivecaspase–8?StaurosporineDNAdamageActiveBid+Pro-caspase–9+Apaf-1+CytcActivecaspase–9Activecaspase–3(6,7)Z–VADZ–VADMitochondriaFasPro-caspase–3(6,7)Z–VADDEATH第31頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五FlowCytometricAnalysisofApoptosis

inJurkatTCellsRelativeCellNumberActiveCaspase-3–FITC00.5124IncubationwithCamptothecin喜樹堿(hr)第32頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五早早期凋亡的檢測capase3早期凋亡Annexin-V-FITC/PI雙染法早期凋亡線粒體細胞膜電位的檢測晚期凋亡----“TUNEL”法晚晚期凋亡-----DNA含量分析法第33頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五Annexin-V-FITC/PI雙染法正常細胞膜磷脂的分布是不對稱的，膜內(nèi)表面含有帶負電的磷脂（如磷脂酰絲氨酸，PS），而膜外表面含有占絕大多數(shù)的中性磷脂。在細胞凋亡早期，細胞表面發(fā)生變化，細胞膜內(nèi)部的PS遷移到細胞外層表面。AnnexinV是一種對Ca2+依賴，對PS有高度親和力的磷脂結(jié)合蛋白，可作為探針識別細胞膜表面是否有PS，從而識別凋亡細胞。第34頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五AnnexinVAssay第35頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻染色體局部凝聚第36頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五Annexin-V-FITC/PI雙染法由于壞死細胞也可能在細胞膜表面出現(xiàn)磷脂酰絲氨酸，又在細胞凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其初期。細胞膜有損傷的細胞DNA可被PI著染而產(chǎn)生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產(chǎn)生。因此，在細胞凋亡的早期PI不會著染而沒有紅色熒光信號，正?；罴毎c此相似。在流式細胞術(shù)雙參數(shù)散點圖上左下象限顯示活細胞，為（AnnexinV-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為AnnexinV+/PI+；而右下象限為凋亡細胞，顯現(xiàn)AnnexinV+/PI-。第37頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五第38頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五AnnexinVAssay

區(qū)分死亡與凋亡第39頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五AnnexinV-PIAnalysisCamptothecin:喜樹堿，抗腫瘤藥物第40頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五第41頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五實驗步驟1.離心收集懸浮細胞，微量離心機轉(zhuǎn)速2000RPM，離心時間5min，棄培養(yǎng)基。2.

用冷PBS洗滌細胞兩次。3.用400ul1XBindingBuffer懸浮細胞，濃度大約為1X106cells/ml。4.在細胞懸浮液中加入5ulAnnexinV-FITC，輕輕混勻后于2-8°C避光條件下孵育15分鐘。5.加入10ulPI后輕輕混勻，于2-8°C避光條件下孵育5分鐘。6.

在1小時內(nèi)用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。第42頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五早早期凋亡的檢測capase3

早期凋亡Annexin-V-FITC/PI雙染法早期凋亡線粒體細胞膜電位的檢測晚期凋亡----“TUNEL”法晚晚期凋亡-----DNA含量分析法第43頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五原理細胞凋亡與壞死在形態(tài)特征上有明顯的區(qū)別，根據(jù)細胞凋亡和壞死的形態(tài)特點，一般認為在細胞壞死早期就會出現(xiàn)細胞膜通透性及線粒體跨膜電位的改變，而在細胞凋亡時這些改變的發(fā)生則要晚。一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。

第44頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五凱基細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）

（JC-1ApoptosisDetectionKit）采用一種陽離子脂質(zhì)熒光染料JC-1作為檢測線粒體跨膜電位指示劑。JC-1有單體和多聚體兩種存在狀態(tài)，在低濃度時以單體的形式存在，高濃度時以多聚體形式存在，兩者的發(fā)射光譜不同，單體在流式細胞儀綠色（FL-1）通道檢測出綠色熒光，多聚體在流式細胞儀紅色（FL-2）通道檢測出紅色熒光。JC-1可透過正常細胞膜以單體狀態(tài)聚集胞內(nèi)，正常健康線粒體的膜電位（△y）具有極性，JC-1依賴于△y的極性被迅速攝入線粒體內(nèi)，并因濃度增高而在線粒體內(nèi)形成多聚體，發(fā)射紅色熒光。而細胞發(fā)生凋亡時，線粒體跨膜電位被去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，紅光強度減弱，以單體的形式存在于胞質(zhì)內(nèi)發(fā)綠色熒光。根椐這一特征檢測線粒體膜電位的變化。第45頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五

凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)P388細胞凋亡，利用凱基細胞凋亡線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）進行檢測，通過流式細胞儀分析分析結(jié)果。正常細胞{FL-1亮,FL-2亮;R1}，凋亡細胞{FL-1亮,FL-2暗;R2}R1R2R3R4R1R2R3R4第46頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五早早期凋亡的檢測capase3

早期凋亡Annexin-V-FITC/PI雙染法早期凋亡線粒體細胞膜電位的檢測晚期凋亡----“TUNEL”法晚晚期凋亡-----DNA含量分析法第47頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五原理細胞凋亡時，核酸內(nèi)切酶活化，雙鏈DNA會出現(xiàn)許多不對稱的斷裂點，即產(chǎn)生一系列3'-OH的末端。外源性熒光標記的脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltranferase,TdT）能夠催化外源性熒光素或酶標記的dUTP連接到DNA的3'-OH末端，用流式細胞術(shù)檢測。第48頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五

BrdUrdIncorporationBrdU作為一種胸腺嘧啶核苷的類似物像胸腺嘧啶核苷一樣可摻入到細胞合成的DNA中。當細胞處于DNA合成期而同時又有BrdU存在時,就會有BrdU摻入新合成的DNA中，只要細胞不消亡，這種BrdU就在胞核的DNA中長期存留。摻入到DNA的BrdU可通過抗BrdU單克隆抗體顯示。該方法能對細胞周期進行迅速而穩(wěn)定的測量,而且標記BrdU的細胞只要不受到紫外線照射，對細胞本身沒有功能損害。該技術(shù)可應(yīng)用到跟蹤檢測移植細胞的存活、分化和功能狀態(tài)。（5-Bromo-2-deoxyUridine,5-溴脫氧尿嘧啶核苷)第49頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五Br-dUTPBr-dUTP比生物素/熒光素標記的脫氧核苷酸磷酸鹽復(fù)合物、地高辛更容易摻入到凋亡細胞的DNA中。因為Br-dUTP有很強的摻入能力，所以在用熒光素標記的抗BrdU單克隆抗體來檢測時，會得到更好的流式細胞信號。未凋亡的細胞因為沒有暴露的3’未端，所以不會被檢測。第50頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五TUNELAssay第51頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五TUNELAssay第52頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五早早期凋亡的檢測capase3早期凋亡Annexin-V-FITC/PI雙染法早期凋亡線粒體細胞膜電位的檢測晚期凋亡----“TUNEL”法晚晚期凋亡-----DNA含量分析法第53頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五細胞凋亡時，細胞核，細胞器及細胞膜成分，細胞形態(tài)均發(fā)生了改變。由于核的改變造成各種熒光染料對凋亡細胞的DNA可染性發(fā)生改變。其原理為在凋亡過程中，細胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降解，分解成小的片段，在標本制備中的固定處理時，細胞膜的完整性被破壞，使細胞內(nèi)降解的DNA片段從細胞內(nèi)流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。第54頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五第55頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五細胞凋亡相關(guān)基因蛋白的流式細胞術(shù)檢測

（1）Fas/FasL(Fas配體)：Fas抗原與Fas配體的交聯(lián)是淋巴細胞誘導(dǎo)靶細胞凋亡的必需途徑，它們的異常與免疫相關(guān)疾病、腫瘤、移植排斥、病毒性肝炎、腎小球腎炎等多種疾病高度相關(guān)。（2）p53：p53是細胞周期中的‘檢查點’分子，其控制著細胞在DNA損傷無法修復(fù)時啟動細胞的‘自殺’進程。p53的缺失或突變已被證明是多種腫瘤（如：乳腺癌、胃腸道腫瘤及肝細胞癌等）發(fā)生的重要原因。其表達高低是腫瘤診斷和預(yù)后的重要指標。（3）Bcl-2：Bcl-2是細胞凋亡的抑制蛋白，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療等有著密切關(guān)系。其表達上調(diào)是腫瘤診斷的指標和預(yù)后的參考。第56頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五第57頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五多藥耐藥(multidrugresistance,MDR)是由一種藥物誘發(fā)而同時對其它多種結(jié)構(gòu)和作用機制完全不同的抗癌藥物產(chǎn)生的交叉耐藥，既對廣泛的結(jié)構(gòu)和功能不相同的抗腫瘤藥物產(chǎn)生的耐藥，導(dǎo)致某些聯(lián)合化療方案失敗。腫瘤多藥耐藥性(multidrugresistanceMDR)檢測第58頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五P170糖蛋白MDR基因編碼的產(chǎn)物P糖蛋白是分子量約為170Kda的胞膜蛋白。P糖蛋白具有一種能量依耐的跨膜藥物外輸泵功能，當腫瘤細胞與抗癌藥物接觸時，脂溶性藥物濃度梯度進入細胞，而P糖蛋白則結(jié)合藥物分子，同時其ATP結(jié)合位點連上ATP，ATP水解后釋放能量將藥物從胞內(nèi)泵出胞外，藥物在胞內(nèi)濃度不斷下降，其細胞毒作用因而減弱甚至喪失，出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。第59頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五腫瘤細胞ATPP170糖蛋白抗癌藥物第60頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五用流式細胞術(shù)檢測人腫瘤組織細胞多藥耐藥基因表達產(chǎn)物P170

【摘要】：為研究檢測人腫瘤組織細胞多藥耐藥基因表達產(chǎn)物，采用間接標記法，用鼠抗人Ｐ１７０單克隆抗體，二抗為ＦＩＴＣ標記兔抗鼠Ｉｇ，應(yīng)用流式細胞儀檢測了２９例新鮮實體腫瘤組織和一株多藥耐藥的Ｋ５６２細胞株。結(jié)果顯示：１８例腫瘤細胞表達Ｐ１７０，其陽性率為６２.１％，１１例未檢出表達，其陰性率為３７．９％；９９．９％Ｋ５６２細胞表達Ｐ１７０。在１８例Ｐ１７０陽性表達的樣本中，有１６例陽性表達百分比低于３０％；只有２例高于３０％。提示大多數(shù)腫瘤組織細胞表達Ｐ１７０陽性率高，但表達Ｐ１７０腫瘤細胞表達百分比低。檢測腫瘤組織的Ｐ１７０表達能為臨床治療提供一個可靠的參考指標。第61頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五

Fluo-3-Am為一新型的高度特異性Ca2+熒光指示劑，可以靈敏地反映細胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化，F(xiàn)luo-3-Am進入細胞后經(jīng)非特異性酯酶脫去Am酯，成為脂溶的Fluo-3留在細胞內(nèi)，當Fluo-3與細胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后，其熒光強度是Fluo-3本身的40倍以上，當用480nm波長激發(fā)時，其熒光強度與游離鈣離子濃度成正比。

細胞內(nèi)Ca2+濃度測定第62頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五檢測淋巴細胞引起的細胞毒作用細胞毒性淋巴細胞（包括細胞毒性T細胞CTL和自然殺傷細胞NKC）能釋放包含穿孔素蛋白和顆粒酶的顆?；蛲ㄟ^Fas-Fas連接作用于靶細胞，引起靶細胞內(nèi)Caspase酶激增，導(dǎo)致細胞死亡包括凋亡。具有重大研究和應(yīng)用價值。流式細胞術(shù)測定細胞毒作用(FCC)，利用Caspase專一性熒光底物測定受害細胞的細胞毒作用強度。準確簡便迅速。第63頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五DNA、RNA的測定第64頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五臨床研究淋巴細胞亞群測定造血干細胞研究腫瘤相關(guān)基因表達研究血小板分析白血病和淋巴瘤免疫分型HLA-B27分析PNH診斷第65頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五淋巴細胞亞群測定淋巴細胞擔負著免疫的主要功能。淋巴細胞亞群的測定有助于了解機體免疫狀況及一些疾病的監(jiān)測。臨床經(jīng)常測定的淋巴細胞亞群包括T淋巴細胞

(CD3+),T輔助細胞

(CD3+CD4+),T抑制細胞(CD3+CD8+),B淋巴細胞(CD19+或CD20+)，NK細胞

(CD3-CD56+)等。第66頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五(1)首先用CD3來區(qū)分全部T細胞。CD3/CD4雙陽性的細胞為真正的輔助/誘導(dǎo)性T細胞。這些細胞主要是HIV病毒感染對象。在HIV感染后，隨著疾病的發(fā)展出現(xiàn)免疫抑制后，這群細胞會明顯減少；在臨床中，對HIV的監(jiān)測主要依靠檢測這群細胞的數(shù)量.(2)CD3-/CD4+細胞群體是由單核細胞組成的。這些細胞相對于CD4+和T細胞來說弱表達CD4，在光散射參數(shù)的位置分布也較廣。CD3/CD4抗體組合能完全將CD4陽性輔助/誘導(dǎo)性T細胞與CD4陽性的單核細胞區(qū)分開來。因為CD4+T細胞能與單核細胞完全分離，故在光散射坐標上設(shè)淋巴細胞“門”時，“門”可設(shè)得大一些，即使包含了單核細胞或其他細胞都不會影響檢測值。第67頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五細胞表型的檢測淋巴20-25%:T:70%,B:20%,NK:10%;單核2-6%粒細胞:40-60%第68頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五淋巴細胞亞群分析淋巴細胞是免疫系統(tǒng)中執(zhí)行免疫功能的重要細胞，各種白細胞分化抗原（CD）分子廣泛分布在T細胞、B細胞、自然殺傷細胞等免疫細胞。免疫細胞表面標志改變與細胞的活化和功能的改變有著密切關(guān)系，不同類型免疫細胞間的比例也對機體免疫功能具有重要的影響，而這些變化與臨床疾病的病理變化密切相關(guān)。第69頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五PeripheralWhiteBloodCellsCD45+GranulocytesMonocytesEosinophilsBasophilsNeutrophilsLymphocytesTBNKTHelperTCytotoxicCD3+CD4+CD3+CD8+CD3+CD3-CD19+HLA-DR+CD3-CD16+CD56+Monocytes第70頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五AdhesionMetabolic第71頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五第72頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五第73頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五T淋巴細胞T淋巴細胞檢測淋巴細胞第74頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五1、Th細胞：CD3+CD4+CD8-T細胞，能輔助B細胞分化成熟,產(chǎn)生抗體,參與促進細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。（一）淋巴細胞及其亞群分析第75頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五2、Tc細胞：

CD3+CD4-CD8+T細胞，能特異性直接殺傷靶細胞，所有表達MHCI類分子的靶細胞。抗腫瘤免疫，抗病毒感染，移植排斥反應(yīng)和自身免疫疾病中均起了重要作用。第76頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五B細胞膜表面免疫球蛋白（Smlg）。表達CD19、

CD20、CD21、CD22分子。B細胞也是免疫系統(tǒng)重要的免疫細胞，主要功能是介導(dǎo)體液免疫。(二）B淋巴細胞及其亞群第77頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五NK細胞為一組大顆粒的淋巴細胞，標志CD16,CD56,CD2、CD11a/CD18.CD3-CD16+CD56+淋巴細胞定為NK細胞。主要功能是參與細胞免疫，在腫瘤免疫抗病毒感染中均起重要作用。（三）NK細胞分析第78頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五淋巴細胞亞群檢測的臨床意義

總T和總B及其亞群的意義總T和總B可以用來判斷某些免疫缺陷和自身免疫性疾病。對CD4＋和CD8＋T細胞的測定有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)的監(jiān)測。

CD4/CD8的意義評價自身免疫失調(diào)、免疫失調(diào)或免疫缺陷病病人的免疫狀態(tài)，（自身免疫病比值升高，病毒感染、腫瘤、再障比值降低）。

NK細胞的意義

NK（7-40%）細胞能夠介導(dǎo)對某些腫瘤細胞和病毒感染細胞的細胞毒性作用。第79頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五HIVANDAIDS第80頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五細胞內(nèi)因子的檢測第81頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五Th1/Th2細胞第82頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五PMA（佛波脂）+Ionomycin（依諾霉素）刺激4-6hr流式細胞細胞因子分析圖第83頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五

腫瘤相關(guān)基因的表達第84頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五P53/Bcl-2第85頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五P53控制著在DNA損失無法修復(fù)時啟動的“自殺”進程。P53的缺失或突變已被證明是多種腫瘤發(fā)生的重要原因。它表達的高低是腫瘤診斷及預(yù)后的重要指標。Bcl-2是細胞凋亡的抑制蛋白，其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和治療等有著密切的關(guān)系。表達上調(diào)是腫瘤診斷的指標和預(yù)后的參考。nm23與多種腫瘤的轉(zhuǎn)移及預(yù)后相關(guān)。第86頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五造血干祖細胞檢測CD34+造血干/祖細胞的檢測。主要用于干細胞移植及基因治療方面的檢測。第87頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五上圖中紅色群體是經(jīng)過多參數(shù)設(shè)門后精確設(shè)定的CD34陽性細胞群體，綠色部分是進行定量計數(shù)的標準微球。第88頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五血小板的測定第89頁，共99頁，2022年，5月20日，9點59分，星期五白血病和淋巴瘤免疫分型

正常白細胞在其分化過程中，隨著系列的不同、成熟階段的差異，會在細胞膜表面表達不同的分化抗原。白血病細胞則在癌變的過程中，喪失了正常細胞的系列專一性和分化階段規(guī)律性，在本質(zhì)上有別于正常骨髓細胞。應(yīng)用此特點可進行免疫表型分析，以鑒別各種白血病和淋巴瘤，輔助臨床診斷、評估療效和預(yù)后。