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現(xiàn)代藥學(xué)生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)現(xiàn)代藥學(xué)生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)基因克隆基因表達(dá)重組蛋白純化鑒定基因克隆與重組子構(gòu)建基因表達(dá)與重組蛋白純化多克隆抗體制備與鑒定基因克隆基因表達(dá)重組蛋白純化基因克隆與重組子構(gòu)建基因表達(dá)與重第一部分
基因克隆與重組子構(gòu)建參照《藥學(xué)分子生物學(xué)》第八章第一部分
基因克隆與重組子構(gòu)建參照《藥學(xué)分子生物學(xué)》第八基因克隆與重組子構(gòu)建路線圖pET-28aEGFPpEGFPpEGFP菌株培養(yǎng)提取質(zhì)粒經(jīng)酶切獲得EGFPpET-28a菌株培養(yǎng)提取質(zhì)粒雙酶切pET-28aEGFP提取質(zhì)粒、鑒定擴(kuò)大培養(yǎng)PCR鑒定連接、轉(zhuǎn)化DH5a2022/10/304中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝基因克隆與重組子構(gòu)建路線圖pET-28aEGFPpEGFPp高壓滅菌法高壓滅菌法滅菌
概念滅菌系指培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備或其他目標(biāo)物中所有微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞及其芽胞(或孢子)殺滅或去除,從而達(dá)到無(wú)菌的過(guò)程;消毒是指殺滅病原微生物和其他有害微生物,并不要求清除或殺滅所有微生物(如芽胞等);滅菌法是指預(yù)先用物理方法,徹底消滅掉接觸物品上所附帶的微生物;消毒法常指應(yīng)用化學(xué)方法來(lái)消滅微生物。2022/10/306中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝滅菌
概念2022/10/226中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝滅菌法滅菌法所用的物理方法:器械和應(yīng)用物品可用高溫來(lái)滅菌。電離輻射主要用于藥物如抗生素、激素、類(lèi)固醇、維生素等,以及塑料注射器和縫線等的滅菌。紫外線可以殺滅懸浮在空氣中、水中和附于物體表面的細(xì)菌、真菌、支原體和病毒等。但它不能射入食物和衣料、被服等紡織物,故一般常用于室內(nèi)空氣的滅菌。2022/10/307中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝滅菌法滅菌法所用的物理方法:2022/10/227中山大學(xué)藥高壓蒸汽滅菌法的注意事項(xiàng)無(wú)菌包不宜過(guò)大,不宜過(guò)緊;液體要保證有透氣孔存在;布類(lèi)物品應(yīng)放在金屬類(lèi)物品上;高壓蒸汽滅菌效果的監(jiān)測(cè):
第一種是工藝監(jiān)測(cè):根據(jù)安裝在滅菌器上的量器(壓力表、溫度表、計(jì)時(shí)表)指示滅菌設(shè)備工作正常與否。
第二種是化學(xué)指示監(jiān)測(cè),3M壓力滅菌指示膠帶:此膠帶上印有斜形白色指示線條圖案。在121℃經(jīng)20分鐘,130℃經(jīng)4分鐘后,膠帶變色(條紋圖案即顯現(xiàn)黑色斜條)。2022/10/308中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝高壓蒸汽滅菌法的注意事項(xiàng)無(wú)菌包不宜過(guò)大,不宜過(guò)緊;2022/基因工程菌基因工程菌用基因工程的方法,使外源基因得到高效表達(dá)的菌類(lèi)細(xì)胞株系一般稱(chēng)為“工程菌”。工程菌是采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)加工出來(lái)的新型微生物,具有多功能、高效和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)如:大多數(shù)大腸桿菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶,用于保護(hù)宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶所切割。Dam甲基化酶可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基Dcm甲基化酶在CCA/TGC序列的第一個(gè)胞嘧啶C-5位置上引入甲基2022/10/3010中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝用基因工程的方法,使外源基因得到高效表達(dá)的菌類(lèi)細(xì)胞株系一般稱(chēng)DH5α是世界上最常用的生物工程菌株之一,特別是在克隆的應(yīng)用,其主要特征為:endA1突變:使endA(限制性?xún)?nèi)切酶)無(wú)
酶活性,有利于質(zhì)粒的穩(wěn)定。(lacZ)M15突變:其表達(dá)產(chǎn)物與pUC載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)α互補(bǔ),可用于藍(lán)白斑篩選。recA突變:
限制DNA重組,使導(dǎo)入的DNA穩(wěn)定。2022/10/3011中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝DH5α是世界上最常用的生物工程菌株之一,特別是在克隆的應(yīng)用α互補(bǔ)lacZ基因的突變體M15質(zhì)粒(缺失氨基酸殘基11到41)是沒(méi)有野生型lacZ基因產(chǎn)物那種分解X-gal能力的。但如果在M15突變體的抽取物中加入β-半乳糖苷酶的第3至第92氨基酸殘基的肽段(α肽)則能恢復(fù)M15分解X-gal,而顯示藍(lán)色的能力。這樣一種基因內(nèi)互補(bǔ)現(xiàn)象稱(chēng)做α互補(bǔ)(α-complementation)。白色克隆為陽(yáng)性重組克隆,藍(lán)色的為載體自連的克隆2022/10/30中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝12α互補(bǔ)lacZ基因的突變體M15質(zhì)粒(缺失氨基酸殘基11到4BL21(DE3)菌株適合于重組蛋白表達(dá)的常用菌株基因組中整合有l(wèi)噬菌體T7噬菌體RNA聚合酶基因位于λ噬菌體DE3區(qū),表達(dá)受控于lacUV5啟動(dòng)子的用于以T7RNA聚合酶為表達(dá)系統(tǒng)的高效外源基因的蛋白表達(dá)宿主。2022/10/3013中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝BL21(DE3)菌株適合于重組蛋白表達(dá)的常用菌株2022/基因工程用載體基因工程用載體載體(vector,vehicle)的本意就是媒介體,基因工程上的載體是能將分離或合成的基因?qū)爰?xì)胞的DNA分子?;蚬こ讨杏腥N主要類(lèi)型的載體∶質(zhì)粒DNA、病毒DNA、科斯質(zhì)粒。2022/10/3015中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝載體(vector,vehicle)的本意就是媒介體,基載體必須具備的幾個(gè)性能分子較小,可攜帶比較大的DNA片段。能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。要有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn),但每一種限制酶又要最少的切割位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn)multiplecloningsites,MCS)。有適合的標(biāo)記,易于選擇。有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá),并且盡可能是高效的表達(dá)。從安全角度考慮,要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移,僅限于在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。2022/10/3016中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝載體必須具備的幾個(gè)性能分子較小,可攜帶比較大的DNA片段。載體的分類(lèi)根據(jù)功能克隆載體:
克隆一個(gè)基因或DNA片斷表達(dá)載體:
用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)整合載體:
把一個(gè)基因插入到染色體組中2022/10/3017中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝載體的分類(lèi)根據(jù)功能2022/10/2217中山大學(xué)藥學(xué)院根據(jù)來(lái)源:
質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體真核細(xì)胞表達(dá)載體其中質(zhì)粒DNA是最常用的載體,但運(yùn)載能力低,柯斯質(zhì)粒是質(zhì)粒和λ噬菌體DNA的結(jié)合體,運(yùn)載能力最高。在這三種類(lèi)型的基礎(chǔ)上,根據(jù)不同的目的,出現(xiàn)了各種類(lèi)型的改造載體。2022/10/3018中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝根據(jù)來(lái)源:2022/10/2218中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝質(zhì)粒(plasmid)是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。大小約為數(shù)千堿基對(duì)。常有1~3個(gè)抗藥性基因。2022/10/3019中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝質(zhì)粒(plasmid)是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DN質(zhì)粒載體克隆的質(zhì)粒載體允許外源的DNA插入,儲(chǔ)存。主要用于DNA水平上的操作基因表達(dá)的質(zhì)粒載體允許外源DNA的插入、儲(chǔ)存和表達(dá)。含有啟動(dòng)子2022/10/3020中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝質(zhì)粒載體克隆的質(zhì)粒載體允許外源的DNA插入,儲(chǔ)存?;虮磉_(dá)的作為載體的質(zhì)粒都含有三種共同的組分:復(fù)制基因(replicator,Ori)選擇性記號(hào)(Amp,Kana)克隆位點(diǎn)(MCS)2022/10/3021中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝作為載體的質(zhì)粒都含有三種共同的組分:2022/10/2221大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-28a大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pET-28a是原核基因表達(dá)質(zhì)粒具有卡那霉素抗性基因LacI基因序列LacZ序列T7聚合酶啟動(dòng)子His6標(biāo)簽2022/10/3023中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝是原核基因表達(dá)質(zhì)粒2022/10/2223中山大學(xué)藥學(xué)院2022/10/3024中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝2022/10/2224中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP/N3真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP/N32022/10/3026中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝2022/10/2226中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝實(shí)驗(yàn)內(nèi)容上午高壓滅菌1000、200ul槍頭各1盒,1.5、0.5mlEP管各一盒,玻璃試管10個(gè)(分兩包)用報(bào)紙或布包好高壓滅菌;配制緩沖液配制50×TAE1000ml(1組),各組配制LB液體培養(yǎng)基200ml0.1MTris-HCl(pH8.5)100ml(2組)。各組取其1ml+9ml水(10mMTris-HCl)SOC培養(yǎng)液100ml(3組)Kana(4組)下午制備LB平板制備空白LB板2塊kana抗性LB平板4塊菌種接種培養(yǎng)pEGFP-N3菌種:接種于5mlLB培養(yǎng)液×2管pET-28a菌種:接種于5mlLB培養(yǎng)液×2管2022/10/3027中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝實(shí)驗(yàn)內(nèi)容上午高壓滅菌下午制備LB平板2022/10/2227現(xiàn)代藥學(xué)生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)現(xiàn)代藥學(xué)生物技術(shù)綜合大實(shí)驗(yàn)基因克隆基因表達(dá)重組蛋白純化鑒定基因克隆與重組子構(gòu)建基因表達(dá)與重組蛋白純化多克隆抗體制備與鑒定基因克隆基因表達(dá)重組蛋白純化基因克隆與重組子構(gòu)建基因表達(dá)與重第一部分
基因克隆與重組子構(gòu)建參照《藥學(xué)分子生物學(xué)》第八章第一部分
基因克隆與重組子構(gòu)建參照《藥學(xué)分子生物學(xué)》第八基因克隆與重組子構(gòu)建路線圖pET-28aEGFPpEGFPpEGFP菌株培養(yǎng)提取質(zhì)粒經(jīng)酶切獲得EGFPpET-28a菌株培養(yǎng)提取質(zhì)粒雙酶切pET-28aEGFP提取質(zhì)粒、鑒定擴(kuò)大培養(yǎng)PCR鑒定連接、轉(zhuǎn)化DH5a2022/10/3031中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝基因克隆與重組子構(gòu)建路線圖pET-28aEGFPpEGFPp高壓滅菌法高壓滅菌法滅菌
概念滅菌系指培養(yǎng)基、發(fā)酵設(shè)備或其他目標(biāo)物中所有微生物的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞及其芽胞(或孢子)殺滅或去除,從而達(dá)到無(wú)菌的過(guò)程;消毒是指殺滅病原微生物和其他有害微生物,并不要求清除或殺滅所有微生物(如芽胞等);滅菌法是指預(yù)先用物理方法,徹底消滅掉接觸物品上所附帶的微生物;消毒法常指應(yīng)用化學(xué)方法來(lái)消滅微生物。2022/10/3033中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝滅菌
概念2022/10/226中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝滅菌法滅菌法所用的物理方法:器械和應(yīng)用物品可用高溫來(lái)滅菌。電離輻射主要用于藥物如抗生素、激素、類(lèi)固醇、維生素等,以及塑料注射器和縫線等的滅菌。紫外線可以殺滅懸浮在空氣中、水中和附于物體表面的細(xì)菌、真菌、支原體和病毒等。但它不能射入食物和衣料、被服等紡織物,故一般常用于室內(nèi)空氣的滅菌。2022/10/3034中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝滅菌法滅菌法所用的物理方法:2022/10/227中山大學(xué)藥高壓蒸汽滅菌法的注意事項(xiàng)無(wú)菌包不宜過(guò)大,不宜過(guò)緊;液體要保證有透氣孔存在;布類(lèi)物品應(yīng)放在金屬類(lèi)物品上;高壓蒸汽滅菌效果的監(jiān)測(cè):
第一種是工藝監(jiān)測(cè):根據(jù)安裝在滅菌器上的量器(壓力表、溫度表、計(jì)時(shí)表)指示滅菌設(shè)備工作正常與否。
第二種是化學(xué)指示監(jiān)測(cè),3M壓力滅菌指示膠帶:此膠帶上印有斜形白色指示線條圖案。在121℃經(jīng)20分鐘,130℃經(jīng)4分鐘后,膠帶變色(條紋圖案即顯現(xiàn)黑色斜條)。2022/10/3035中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝高壓蒸汽滅菌法的注意事項(xiàng)無(wú)菌包不宜過(guò)大,不宜過(guò)緊;2022/基因工程菌基因工程菌用基因工程的方法,使外源基因得到高效表達(dá)的菌類(lèi)細(xì)胞株系一般稱(chēng)為“工程菌”。工程菌是采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)加工出來(lái)的新型微生物,具有多功能、高效和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)如:大多數(shù)大腸桿菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶,用于保護(hù)宿主DNA不被相應(yīng)的限制酶所切割。Dam甲基化酶可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基Dcm甲基化酶在CCA/TGC序列的第一個(gè)胞嘧啶C-5位置上引入甲基2022/10/3037中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝用基因工程的方法,使外源基因得到高效表達(dá)的菌類(lèi)細(xì)胞株系一般稱(chēng)DH5α是世界上最常用的生物工程菌株之一,特別是在克隆的應(yīng)用,其主要特征為:endA1突變:使endA(限制性?xún)?nèi)切酶)無(wú)
酶活性,有利于質(zhì)粒的穩(wěn)定。(lacZ)M15突變:其表達(dá)產(chǎn)物與pUC載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)α互補(bǔ),可用于藍(lán)白斑篩選。recA突變:
限制DNA重組,使導(dǎo)入的DNA穩(wěn)定。2022/10/3038中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝DH5α是世界上最常用的生物工程菌株之一,特別是在克隆的應(yīng)用α互補(bǔ)lacZ基因的突變體M15質(zhì)粒(缺失氨基酸殘基11到41)是沒(méi)有野生型lacZ基因產(chǎn)物那種分解X-gal能力的。但如果在M15突變體的抽取物中加入β-半乳糖苷酶的第3至第92氨基酸殘基的肽段(α肽)則能恢復(fù)M15分解X-gal,而顯示藍(lán)色的能力。這樣一種基因內(nèi)互補(bǔ)現(xiàn)象稱(chēng)做α互補(bǔ)(α-complementation)。白色克隆為陽(yáng)性重組克隆,藍(lán)色的為載體自連的克隆2022/10/30中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝39α互補(bǔ)lacZ基因的突變體M15質(zhì)粒(缺失氨基酸殘基11到4BL21(DE3)菌株適合于重組蛋白表達(dá)的常用菌株基因組中整合有l(wèi)噬菌體T7噬菌體RNA聚合酶基因位于λ噬菌體DE3區(qū),表達(dá)受控于lacUV5啟動(dòng)子的用于以T7RNA聚合酶為表達(dá)系統(tǒng)的高效外源基因的蛋白表達(dá)宿主。2022/10/3040中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝BL21(DE3)菌株適合于重組蛋白表達(dá)的常用菌株2022/基因工程用載體基因工程用載體載體(vector,vehicle)的本意就是媒介體,基因工程上的載體是能將分離或合成的基因?qū)爰?xì)胞的DNA分子?;蚬こ讨杏腥N主要類(lèi)型的載體∶質(zhì)粒DNA、病毒DNA、科斯質(zhì)粒。2022/10/3042中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝載體(vector,vehicle)的本意就是媒介體,基載體必須具備的幾個(gè)性能分子較小,可攜帶比較大的DNA片段。能獨(dú)立于染色體而進(jìn)行自主復(fù)制并且是高效的復(fù)制。要有盡可能多種限制酶的切割位點(diǎn),但每一種限制酶又要最少的切割位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn)multiplecloningsites,MCS)。有適合的標(biāo)記,易于選擇。有時(shí)還要求載體要能啟動(dòng)外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄及表達(dá),并且盡可能是高效的表達(dá)。從安全角度考慮,要求載體不能隨便轉(zhuǎn)移,僅限于在某些實(shí)驗(yàn)室內(nèi)特殊菌種內(nèi)才可復(fù)制等等。2022/10/3043中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝載體必須具備的幾個(gè)性能分子較小,可攜帶比較大的DNA片段。載體的分類(lèi)根據(jù)功能克隆載體:
克隆一個(gè)基因或DNA片斷表達(dá)載體:
用于一個(gè)基因的蛋白表達(dá)整合載體:
把一個(gè)基因插入到染色體組中2022/10/3044中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝載體的分類(lèi)根據(jù)功能2022/10/2217中山大學(xué)藥學(xué)院根據(jù)來(lái)源:
質(zhì)粒載體噬菌體載體柯斯質(zhì)粒載體真核細(xì)胞表達(dá)載體其中質(zhì)粒DNA是最常用的載體,但運(yùn)載能力低,柯斯質(zhì)粒是質(zhì)粒和λ噬菌體DNA的結(jié)合體,運(yùn)載能力最高。在這三種類(lèi)型的基礎(chǔ)上,根據(jù)不同的目的,出現(xiàn)了各種類(lèi)型的改造載體。2022/10/3045中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝根據(jù)來(lái)源:2022/10/2218中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝質(zhì)粒(plasmid)是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子。大小約為數(shù)千堿基對(duì)。常有1~3個(gè)抗藥性基因。2022/10/3046中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝質(zhì)粒(plasmid)是存在于細(xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DN質(zhì)粒載體克隆的質(zhì)粒載體允許外源的DNA插入,儲(chǔ)存。主要用于DNA水平上的操作基因表達(dá)的質(zhì)粒載體允許外源DNA的插入、儲(chǔ)存和表達(dá)。含有啟動(dòng)子2022/10/3047中山大學(xué)藥學(xué)院王紅勝質(zhì)粒載體克隆的質(zhì)粒載體允許外源的DNA插入,儲(chǔ)存。基因表達(dá)的作為載體的質(zhì)粒都含有三種共同的組分:復(fù)制基因(replicator,
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