白細(xì)胞趨化實驗

白細(xì)胞趨化實驗第一頁，共17頁?；驹恚篒L-8是典型的CXC家族趨化因子，對嗜中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞有趨化作用。IL-8的趨化作用沒有種屬特異性，因此，可以用豚鼠嗜中性粒細(xì)胞代替人嗜中性粒細(xì)胞對其進(jìn)行活性檢測。第二頁，共17頁。趨化因子誘導(dǎo)的細(xì)胞移動方式有兩類：化學(xué)增活現(xiàn)象，指增強(qiáng)細(xì)胞的隨機(jī)運動，瓊脂糖小滴化學(xué)動力實驗是檢測這種活性的比較簡易，快速，重復(fù)性好的方法。趨化性，指誘導(dǎo)細(xì)胞向趨化因子化學(xué)濃度高的方向移動。瓊脂糖中的趨化實驗和微孔小室中的趨化實驗則是常用的測定細(xì)胞因子趨化活性的方法。第三頁，共17頁。微孔小室中的趨化實驗：微孔小室中的趨化實驗是根據(jù)靶細(xì)胞（單核巨噬細(xì)胞，中性粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞等）能夠趨化性主動遷移，穿過一定孔徑的濾膜而設(shè)計的。濾膜將小室分隔成上下兩部分。靶細(xì)胞在上面，趨化因子在下面，趨化因子通過濾膜形成梯度，細(xì)胞則沿著梯度穿過膜孔，黏附在膜的下面，計數(shù)濾膜下表面的細(xì)胞數(shù)即可測出趨化因子的趨化能力。第四頁，共17頁。第五頁，共17頁。趨化材料和趨化時間的選擇：趨化濾膜的材料和孔徑需根據(jù)靶細(xì)胞的大小選擇；中性粒細(xì)胞用3μm孔徑的PVPF聚碳酸膜（Polycarbonatemembranes）,趨化時間為30分鐘；單核細(xì)胞用8μm孔徑的PVPF聚碳酸膜，趨化時間為90分鐘；粘附力弱的淋巴細(xì)胞則用表面復(fù)以明膠或纖粘素的5μm或8μmPVPF聚碳酸膜，以免淋巴細(xì)胞穿過膜后落入下室，趨化時間為180分鐘。第六頁，共17頁。不同趨化因子濃度的確定：趨化因子特異活性非常高，某些趨化因子在較高濃度時促進(jìn)細(xì)胞趨化的作用反而降低，所以待測樣品常需連續(xù)5倍或10倍系列稀釋以獲得最適劑量的趨化結(jié)果。每次實驗都需設(shè)好對照，因為不同來源或活力靶細(xì)胞的趨化能力差異很大

第七頁，共17頁。趨化因子活性的表達(dá)方式有三種，其中最常用的是用趨化指數(shù)表示，趨化指數(shù)（chemotacticindex,CI）是指細(xì)胞遷移到待測樣品液的數(shù)目和遷移到對照液的數(shù)目的比值。第八頁，共17頁。試劑和材料：純化的IL-8注射器，離心管，移液器，Tip頭

0.17%D(+)-糖原/生理鹽水解剖器械（剪刀，鑷子，止血鉗）PBS,紅細(xì)胞裂解液趨化小室，趨化濾膜，細(xì)胞刮子Serum-freeRPMI1640計數(shù)板，玻璃片，顯微鏡，甲醇，Gimsa染色液紅細(xì)胞裂解液：

豚鼠中性粒細(xì)胞，0.17MTris/0.16MNH4Cl液體石蠟，將10ml0.17MTris加到90ml0.16M

NH4Cl中，調(diào)PH7.2第九頁，共17頁。實驗程序：一豚鼠嗜中性粒細(xì)胞的制備：1）取成年豚鼠1只，腹腔注射含0.17%糖原的生理鹽水，13小時后，用PBS緩沖液沖洗腹腔，收集腹腔液，1500rpm/min10min,棄上清。2）輕輕彈起沉淀，用3-5mlPH7.2的37℃預(yù)溫的（Tris-NH4CL）紅細(xì)胞溶解液，充分吹散，作用3-5分鐘，立即加入10-15mlserum-freeRPMI1640,吹打均勻，1500rpm/min5min,棄上清，再加入serum-freeRPMI1640,離洗兩次。得到豚鼠嗜中性粒細(xì)胞，純度可達(dá)97%以上。3）將純化后的嗜中性粒細(xì)胞溶在serum-freeRPMI1640中，細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5x105/ml，備用。第十頁，共17頁。第十一頁，共17頁。二．樣品的準(zhǔn)備：將純化的IL-8用PBS分別稀釋為1000ng/ml,100ng/ml,10ng/ml,1ng/ml,0.1ng/ml。同時用稀釋IL-8的PBS作陰性對照。（樣品加入小室前最好放入37℃培養(yǎng)箱中預(yù)溫，

以免加樣時出氣泡）。第十二頁，共17頁。234567IL-8(1μg)PBSPBSPBSPBSPBSPBS180μl180μl180μl180μl180μl100μl20μl20μl20μl20μl20μl20μl(棄去20μl)倍比稀釋(1:10)倍比稀釋(1:2)真核上清PBSPBSPBS200μl100μl100μl100μl100μl100μl100μl100μl（棄去100μl）（載體對照稀釋同上）第十三頁，共17頁。三．準(zhǔn)備底層小室，加樣：1）將趨化小室底層板放水平臺上，NP標(biāo)記位于右下方。2）將稀釋好后預(yù)溫的樣品加入孔中，使液面微微隆起，每孔27μl，（國產(chǎn)板每孔25μl），每個樣品3個復(fù)孔。為防止樣品過度蒸發(fā)，整個加樣過程應(yīng)不超過5分鐘。3）將適當(dāng)孔徑的濾膜取出，在濾膜的一角剪去1mm的小角，缺角對著NP標(biāo)記，分別用鑷子夾住濾膜兩端，水平下降，中間部位最先接觸小室液面，將膜平放在加完樣的底層板上。4）鋪上硅膠墊，裝上上層板，硅膠墊的缺角及上層板的NP標(biāo)記位于右下方。裝上螺絲，擰緊裝置。第十四頁，共17頁。四．加入細(xì)胞：1）將已稀釋好的細(xì)胞懸液加入上層小孔中，每孔50μl，加樣時微量加樣器Tip頭貼著小孔壁，Tip頭末端恰好位于濾膜稍上方，垂直快速加樣，避免孔底滯留氣泡，（注意這一步加樣過程中一定不要有氣泡形成）。2）檢查上層液體中是否有氣泡，一個比較簡便的方法是觀察小孔凸的反射光，如果小孔上方有一個異常大的凸液面，通常表明有滯留氣泡。解決的辦法是用Tip頭將孔中的液體吸干凈，重新加樣。五．孵育：將趨化小室放入37℃5%CO2孵箱中，孵育30分鐘。第十五頁，共17頁。六．取出濾膜，清洗，染色：

1)取出濾膜，擰下螺帽，將整個小室倒置，托著上層板的四角，將小室慢慢地水平放在紙巾上，卸下下層板。2)清洗，遷移細(xì)胞現(xiàn)位于濾膜朝上的一面，此面稱為細(xì)胞面，另一面為非細(xì)胞面，用鑷子夾起濾膜的一角，然后用大塑料夾夾住濾膜這一端距邊緣1mm的寬度，拎起濾膜，迅速用塑料夾夾住濾膜另一端。在盛有PBS緩沖液的平皿中沾濕非細(xì)胞面，注意細(xì)胞面不要接觸到PBS。3)在細(xì)胞刮上刮去非細(xì)胞面上的細(xì)胞，靠近大夾子處的濾膜先接觸細(xì)胞刮，在與細(xì)胞刮成30度角方向輕輕上拉，該過程重復(fù)兩次。4)固定，小心將濾膜浸入甲醇中，室溫3分鐘，將濾膜取出，用塑料夾夾住，自然干燥。5)染色，將固定后的濾膜