實(shí)驗(yàn)三-聚丙烯酰胺凝膠電泳課件

實(shí)驗(yàn)三

血清蛋白質(zhì)

聚丙烯酰胺凝膠圓盤(pán)電泳

PolyAcrylamideGelElectrophoresis

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一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理。2.掌握聚丙烯酰胺凝膠圓盤(pán)電泳分離血清蛋白質(zhì)的方法。蛋白質(zhì)的分離蛋白質(zhì)是生物大分子化合物，具有膠體性質(zhì)、沉淀、變性和凝固等特點(diǎn)蛋白質(zhì)分離純化的方法主要有：鹽析、透析、超離心、電泳、離子交換層析、分子篩層析等方法。遷移率電場(chǎng)力F=EQ（E：電場(chǎng)強(qiáng)度，Q：電荷)阻力F=6πγηυ（γ：半徑，η：介質(zhì)粘度）υ/E表示單位電場(chǎng)強(qiáng)度時(shí)粒子運(yùn)動(dòng)的速度，稱(chēng)為遷移率，也稱(chēng)位泳動(dòng)度，以μ表示：μ=υ/E=Q/πγη

可見(jiàn)，離子的遷移率在一定條件下取決于粒子本身的性質(zhì)，即其所帶的電荷和形狀。不同的粒子有不同的遷移率，因此電泳一定時(shí)間就可分開(kāi)它們。樣品性質(zhì)

與分離樣品所帶電荷成正比，與樣品相對(duì)分子質(zhì)量成反比。電場(chǎng)強(qiáng)度

電壓越高，帶點(diǎn)粒子移動(dòng)越快。緩沖液的性質(zhì)

緩沖液的PH值距等電點(diǎn)越遠(yuǎn)指點(diǎn)所帶靜電荷越多，遷移速度越快；反之越慢。離子強(qiáng)度等于1/2∑cizi2支持介質(zhì)

理想電泳支持介質(zhì)應(yīng)是網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、不帶電荷、對(duì)被分離物質(zhì)無(wú)吸附作用的惰性材料。溫度

影響電泳分離效果的因素電泳的分類(lèi)1、根據(jù)固體支持物種類(lèi)的不同

紙質(zhì)電泳

醋酸纖維素薄膜電泳瓊脂糖凝膠電泳

聚丙烯酰胺凝膠電泳2、根據(jù)電泳裝置不同

薄膜電泳垂直板電泳平板電泳垂直圓盤(pán)電泳二、實(shí)驗(yàn)原理1.電泳的分類(lèi)按分離目的：分析電泳和制備電泳按電場(chǎng)強(qiáng)度：常壓電泳和高壓電泳按電泳媒介：自由電泳和區(qū)帶電泳區(qū)帶電泳（按支持介質(zhì)）：淀粉凝膠電泳濾紙電泳

醋酸纖維素薄膜電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳按支持介質(zhì)形式：水平式電泳、垂直電泳按緩沖液pH值：連續(xù)pH和不連續(xù)pH電泳聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。血清蛋白在聚丙烯酰胺凝膠電泳一般可分成12～25個(gè)組分。因此適用于不同相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)的分離，且分離效果好。根據(jù)有無(wú)濃縮效應(yīng)可分為：連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)，其中不連續(xù)系統(tǒng)因具有濃縮效應(yīng)，分離條帶清晰度及分辨率較佳應(yīng)用更為廣泛，本次試驗(yàn)應(yīng)用的為不連續(xù)系統(tǒng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳的優(yōu)點(diǎn)：凝膠透明，彈性、機(jī)械強(qiáng)度好；化學(xué)穩(wěn)定性高，幾乎無(wú)吸附和電滲作用；具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，起到分子篩作用。可以通過(guò)控制單體濃度或者單體與交聯(lián)劑的比例聚合制成不同大小孔徑的凝膠，使分子篩效應(yīng)與電荷效應(yīng)結(jié)合起來(lái)，具有極高的分辨率；樣品不易擴(kuò)散，能自動(dòng)濃縮成很薄的樣品層；所用的樣品量小，分離效果好。

3.基本原理本實(shí)驗(yàn)利用聚丙烯酰胺凝膠作電泳支持物。電荷數(shù)和分子大小不一的各種血清蛋白質(zhì)通過(guò)濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)而被精細(xì)地分離。由于具有以上三種效應(yīng)，所以此方法分離效果好，分辨率高，血清蛋白在紙上電泳僅能分成5～7個(gè)組分，而在聚丙烯酰胺凝膠盤(pán)狀電泳中可分出10～30個(gè)組分。1.樣品膠：PH為6.7

2.濃縮膠：是大孔膠，PH為6.7的TRIS-HC1（省略）

3.分離膠；是小孔膠，PH為8.9

4.電極緩沖液：是PH為9.0的硼酸-硼砂緩沖液圖1聚丙烯酰胺凝膠圓盤(pán)電泳示意圖(A為正面,B為剖面)分離機(jī)制（1）濃縮效應(yīng)——低電流壓縮效應(yīng)

無(wú)論哪種電泳，樣品加入后顆粒分散，不能從同一起點(diǎn)開(kāi)始電泳，要想得到良好的分離效果，電泳開(kāi)始前必須使樣品中各種成分同處于同一起跑線上，使顆粒同時(shí)開(kāi)始電泳。

因此采用低電流壓縮，使樣品在達(dá)到小孔徑的分離膠時(shí)，已被濃縮成幾個(gè)微米的很薄的一層。分離膠分離膠（2）電荷效應(yīng)：在均一電勢(shì)梯度和pH的分離膠中，由于各種蛋白質(zhì)分子的等電點(diǎn)不同，在同一pH的分離膠中所帶有效電荷不同，因而遷移率也就不同。根據(jù)電泳的基本原理，帶電荷越多，運(yùn)動(dòng)速率就越快，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的電泳分離，各種蛋白質(zhì)就按泳動(dòng)速率快慢順序排列成一個(gè)一個(gè)圓盤(pán)狀的蛋白質(zhì)區(qū)帶。電泳速度的大小：V

=QE6πR∝QRF=F′

電場(chǎng)力F=QE

摩擦力F′=6πRVQE=6πRV運(yùn)動(dòng)速度凝膠過(guò)濾層析中的分子篩效應(yīng)大分子移動(dòng)快，小分子移動(dòng)慢三、主要試劑與儀器：儀器：電泳儀，圓盤(pán)電泳槽電泳玻璃管（8×0.5cm）試劑：分離膠緩沖液，單體交聯(lián)劑

電極緩沖液，樣品稀釋液

固定液，染色液，脫色液

新鮮羊血清，保存液實(shí)驗(yàn)操作凝膠柱的準(zhǔn)備（凝膠溶液配制表見(jiàn)教材表4-4）取玻璃管，一段封口加入分離膠溶液(7cm)加入蒸餾水制備分離膠應(yīng)迅速為了使表面平整，與空氣隔絕靜置待凝膠聚合濃縮膠制備(1cm)吸取上表面蒸餾水待凝膠與水面的界面重新可辨切勿觸動(dòng)膠面參見(jiàn)分離膠加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速加入蒸餾水為了使表面平整，與空氣隔絕取玻璃管，一段封口加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速取玻璃管，一段封口加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速取玻璃管，一段封口加入蒸餾水為了使表面平整，與空氣隔絕加入分離膠溶液(7cm)制備分離膠應(yīng)迅速取玻璃管，一段封口四、操作步驟：1.凝膠柱的配制：

配膠-立柱-灌膠-水封-靜置-去水層（1）配膠——配制分離膠溶液。

分離膠緩沖液2.0mL

單體交聯(lián)劑4.34mL

蒸餾水13.48mL

催化劑0.2mL

加速劑0.05mL最后加

總體積20.07mL，丙烯酰胺濃度6.5%。（4）水封：立即用膠頭滴管沿凝膠管內(nèi)壁在已加的膠液上邊加入約3~5mm高的蒸餾水。須緩慢進(jìn)行，防止膠液面被破壞或水層與膠層的混合。（5）靜置：40min，使其充分聚膠。膠柱上端有一明顯折光界面，表示凝膠已完成。（6）去水層：聚膠后，用注射器小心吸去膠液上的水層，并用濾紙將殘存的水分吸干。注意不要破壞膠面的完整性。2．樣品液的制備：取血清0.05ml，加入樣品稀釋液0.95mL，內(nèi)含溴酚藍(lán)作為示蹤染料，混勻備用。3．電泳

裝柱-加液-加樣-封液-電泳（1）裝柱：選擇合適的凝膠管，去掉下端的封口膜，垂直插入上層電泳槽的橡膠塞孔中，留有適當(dāng)?shù)母叨龋ㄒ鼓z表面露出橡皮塞），若有沒(méi)插滿的孔要用實(shí)心的橡皮塞堵塞。每個(gè)孔都要塞緊，防止漏液。（2）加液：向下電泳槽加入適量的硼酸-硼砂緩沖溶液，沒(méi)過(guò)凝膠管的底部和電極，注意膠柱下方不要有氣泡。（3）加樣：用膠頭滴管吸取配好的樣品液，沿管壁緩慢加在凝膠柱上邊，加樣量以凝膠管內(nèi)樣品液高度2~3mm為宜。加樣槍不可插入過(guò)深，以免刺破凝膠，同時(shí)要緩慢、均勻，以免攪動(dòng)緩沖液引起樣品擴(kuò)散。（4）封液：用膠頭滴管吸取電極緩沖液，沿管壁慢慢加入凝膠管上方至加滿凝膠管，注意不要使緩沖液與樣品液混在一起。（5）然后向上電泳槽中加入電極緩沖液，使凝膠管的上端被緩沖液浸沒(méi)，隨后蓋上電泳槽的槽蓋。（6）電泳：將上層電泳槽的電極接電泳儀的負(fù)極，下槽接電泳儀的正極，接通電源。調(diào)節(jié)電流為lmA／管，5min后，樣品液被壓縮成一薄層，調(diào)節(jié)電流為3mA／管。待示蹤染料運(yùn)動(dòng)至凝膠管下端管口時(shí)(離管下口0.5cm)，切斷電源，結(jié)束電泳（時(shí)間約為30~50min）。4．剝膠：將上下電泳槽的緩沖液回收到試劑瓶中，取下凝膠管，以注射器吸取蒸餾水，用10cm長(zhǎng)針頭沿凝膠管壁插入膠柱與管壁之間，針頭切面朝向凝膠管壁，從負(fù)極端緊貼管壁，邊注水邊進(jìn)針，使膠柱與玻璃管松動(dòng)，最終使凝膠柱從玻管中緩慢滑出。必要時(shí)用洗耳球在一端輕輕加壓。(注入蒸餾水做潤(rùn)滑劑，針頭螺旋式前進(jìn)，緩緩剝離)5．固定：12.5%三氯醋酸溶液，10min。6．染色：考馬斯亮藍(lán)染液，60℃，10min。7．脫色：脫色液，60℃，10min，直至底色基本褪去，可清晰的觀察到10~20條蛋白質(zhì)區(qū)帶。五、結(jié)果與分析：

經(jīng)染色脫色后的膠柱，在日光下觀察，至少可看到10~20條蛋白質(zhì)著色區(qū)。從正極到負(fù)極依次為：白蛋白區(qū)、α1-球蛋白區(qū)、α2-球蛋白區(qū)、β-球蛋白區(qū)和γ-球蛋白區(qū)。

區(qū)帶觀察：1.排列順序

2.區(qū)帶寬窄

3.顏色深淺

前清蛋白

白蛋白2-球蛋白1-球蛋白-球蛋白-球蛋白5~8條3.5cm18.5%3~5條1.5cm8.8%6~12條2.5cm7.4%5~7條1.0cm3.11%2~3條0.5-0.8cm62.6%六、注意事項(xiàng)1.丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺都是神經(jīng)性毒劑，對(duì)皮膚有刺激作用、但在形成凝膠后則無(wú)毒，因此在形成凝膠之前應(yīng)盡量注意避免直接接觸。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺溶液應(yīng)裝在棕色瓶中，用前檢測(cè)pH值是否失效。失效液不能聚合。2.配膠的時(shí)候要按照表的順序加入，配好膠后應(yīng)盡快灌膠，不要形成氣泡，汽泡會(huì)影響電泳分離效果。3.剛灌注分離膠混合溶液后，應(yīng)立即在分離膠液面上加3~5mm高的水層，以阻隔空氣。膠液面上加水及吸水，還有加樣層時(shí)要特別