精選文檔大腸埃希氏菌O157研究進展

大腸埃希氏菌O157：H7檢測方法研究進展摘要：大腸埃希氏菌O157∶H7是腸出血性大腸桿菌的主要病原血清型,可引起腹瀉、出血性腸炎,極易繼發(fā)溶血性尿毒綜合癥和血栓性血小板減少性紫癜兩種嚴重的并發(fā)癥,死亡率高，因此快速準確地檢測這種病原菌對預防和控制由其引起腹瀉有著十分重要的作用。本文介紹了大腸埃希氏菌O157∶H7實驗室檢測方法的研究進展，主要包括微生物學檢驗方法中的細菌分離培養(yǎng)和快速酶觸反應法、免疫學檢測法、ISO-GRID檢測系統(tǒng)、免疫捕獲LAMP法、PCR法、DNA探針技術等分子生物學方法。關鍵詞：大腸埃希氏菌O157∶H7、檢測方法、研究進展大腸埃希氏菌（E.Coli簡稱大腸桿菌）于1885年由德國科學家T。Escherich從健康嬰兒糞便中分離并命名[1]。根據毒力基因、致病性、致病機理、臨床癥狀、流行病學特點和血清分型等，國際上將致瀉性大腸埃希氏菌分為6類，即：腸致病性大腸埃希氏菌（EPEC）、腸產腸毒素大腸埃希氏菌（ETEC）、腸侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）、腸出血性大腸埃希氏菌（EHEC）和腸集聚性大腸埃希氏菌（EAEC）以及近來發(fā)現的腸產志賀樣毒素且具有侵襲力的大腸埃希氏菌（ESIES）[2;3;4]。大腸桿菌O157∶H7是腸出血性大腸桿菌的主要病原血清型,可引起腹瀉、出血性腸炎,極易繼發(fā)溶血性尿毒綜合癥和血栓性血小板減少性紫癜兩種嚴重的并發(fā)癥,死亡率高[5]。于1982年在美國被首次發(fā)現，此后在世界各地散發(fā)或地方流行，1996年在日本大阪地區(qū)發(fā)生流行，患者逾萬，死亡11人，1999—2000年在中國江蘇、安徽等地發(fā)生了多起食源性感染O157:H7事件，導致l77人死亡[6;7]。世界衛(wèi)生組織已將O157:H7列為新的食源性病原菌。一、大腸埃希氏菌O157:H7病原學特點EHECO157:H7屬于腸桿菌科埃希氏菌屬，具有一般大腸桿菌的形態(tài)特征的同時又有區(qū)別于一般大腸桿菌的特征[8]：為革蘭氏陰性、無芽孢直桿菌，大多數菌株以周生鞭毛運動；在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上為光滑型菌落，有光澤，濕潤，灰白色；最適生長溫度為33-42℃，37℃繁殖迅速，44-45℃生長不良，45.5℃停止生長；不耐熱，在75℃一分鐘即可被殺滅；對氯敏感，在有效氯含量0.4ppm以上的水體中難以存活；具有較強的耐酸性，pH2.5-3.0，37℃可耐受5小時；溫度低于5℃的環(huán)境中生存，在-20℃可存活9個月；可產生大量的Vero毒素（VT），也稱作類志賀氏毒素（SLT），是EHEC的主要致病因子，SLT抗力很高，經80℃處理30min仍具有活性；發(fā)酵多種碳水化合物，但不發(fā)酵或遲緩發(fā)酵山梨醇，也不能產生葡萄糖酸苷酶。大腸埃希氏菌O157:H7流行特點和臨床癥狀特點2.1流行特點O157：H7的感染和暴發(fā)流行多發(fā)生在發(fā)達國家,但我國近年來多數省市已有該菌的檢出和感染病例報告,局部暴發(fā)流行和散發(fā)病例時有發(fā)生。目前該菌的感染無論在發(fā)達國家還是發(fā)展中國家,都受到廣泛關注。1.季節(jié)性：，主要發(fā)生在夏秋兩季，春冬季發(fā)病相對較少，7月到8月為發(fā)病高峰期，此外，雨季也是感染的易發(fā)季節(jié)。2.地區(qū)分布：多發(fā)生于發(fā)達國家，主要以散發(fā)性為主。3.易感人群：兒童5-9歲、老人50-59歲明顯高于其它年齡組，最小3個月，最大85歲。4.宿主：是一種動物源性傳染病，奶牛，尤其是放牧的小牛是其主要儲存宿主，從腹瀉患者、畜禽糞便、市售肉類以及豬、鴿、雞、鴨等動物中也有分離到O157:H7的報道[9]。5.傳播途徑：以食源性傳播為主，水源性傳播和接觸傳播也是重要的傳播途徑。牛肉、生奶、雞肉及其制品，蔬菜、水果及制品等均可引起污染，其中牛肉是最主要的傳播載體。6.感染力：O157:H7具有較強的感染力，一般大腸桿菌需要100萬個活菌才可引起發(fā)病，而O157:H7只需100到200個活菌即可突破胃酸屏障，引發(fā)感染。2.2臨床癥狀牛：是O157:H7的主要攜帶者，但成年牛一般不會發(fā)病，只有犢牛才會出現腹瀉癥狀。豬：感染O157:H7后可導致水腫病，以頭部，腸系膜和胃壁漿液性水腫為主要特征，且常伴有共濟失調，麻痹或驚厥等神經癥狀，發(fā)病率較低但死亡率很高。人：易感O157:H7，大多急性發(fā)病，常突然發(fā)生劇烈腹痛和非血性腹瀉，數天后出現血性腹瀉，低熱或不發(fā)熱。表現為水樣便、粘液便或膿血便，在有的病例中，取得的糞便樣品甚至是“只有血沒有糞渣”，可見出血性腹瀉的程度[7]。三、大腸埃希氏菌O157：H7的檢驗方法大腸埃希氏菌O157:H7感染已成為全球性的公共衛(wèi)生和食品安全問題，對其進行快速、特異的檢測對于該病的早期診斷及疫情有效控制至關重要。生物技術的發(fā)展為EHECO157:H7的實驗室診斷提供了許多有效的手段和方法。3.1微生物檢驗方法3.1.1細菌分離培養(yǎng)該方法是大腸埃希氏菌O157：H7常見的診斷方法，為分離培養(yǎng)+生化試驗鑒定+血清試驗分型，首先是細菌分離培養(yǎng)：可以用顯色培養(yǎng)基對O157:H7進行初篩，目前常規(guī)使用山梨醇麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（SMAC）對菌株進行分離和篩選，在正常條件下，EHECO157:H7不能發(fā)酵山梨醇，在SMAC瓊脂上呈現為無色或者灰色菌落，而其他大腸桿菌則呈紅色菌落[10]。經初步分離培養(yǎng)后進一步通過血清學實驗進行鑒定，目前常用的血清學診斷方法有玻片凝集試驗、乳膠凝集試驗和ELISA法等。檢測方法不需特殊儀器，簡單易行，費用低，但所需時間長（一般需7d左右），檢測周期長并易受人為因素干擾。有報道EHECO157：H7與枸櫞酸桿菌、EIEC與志賀菌中的某些血清型出現抗原交叉反應較為多見[11]，所以大腸埃希氏菌O157的鑒定需要分離培養(yǎng)+生化試驗鑒定+血清試驗分型綜合分析[12]。3.1.2快速酶觸反應顯色培養(yǎng)基法快速酶觸反應是根據細菌在其生長繁殖過程中可合成和釋放某些特異性的酶，按酶的特性，選用相應的底物和指示劑，將它們配制在相關的培養(yǎng)基中。根據細菌反應后出現的明顯的顏色變化，確定待分離的可疑菌株，反應的測定結果有助于細菌的快速診斷。這種技術將傳統(tǒng)的細菌分離與生化反應有機的結合起來，并使得檢測結果直觀，成為今后微生物檢測發(fā)展的一個重要發(fā)展方向[13]。3.2免疫學檢測方法免疫血清學檢測技術是利用抗原和抗體之間的特異性反應，通過檢測標記在反應物上的示蹤物，對抗原或抗體進行定性或定量測定的快速檢測技術。根據標記物的不同，應用于大腸埃希氏菌O157檢測中的方法主要有：酶聯免疫吸附分析法、熒光免疫測定技術、免疫膠體金標記技術、免疫磁珠分離技術、蛋白芯片檢測技術及斑點金免疫滲濾法等[14;15;16]。雖然免疫學檢測技術具有快速、可批量操作、特異性強、敏感度高、檢測重復性好等優(yōu)點，但由于抗原抗體存在交叉反應，使檢測的結果可能出現假陽性，因而只能對樣品進行初檢。3.3ISO－GRID檢測系統(tǒng)ISO－GRID檢測系統(tǒng)是一種基于疏水性網膜（HGMF）的過濾系統(tǒng)。該系統(tǒng)通過使用這種含有1600個小方格的濾膜，來對微生物進行檢測或計數。此方法快速簡便，重復性好，而且，除大腸桿菌O157﹕H7外，還適用于沙門氏菌、酵母、霉菌、大腸菌群及大腸桿菌的檢測和計數。3.4PCR法PCR技術原理為提高DNA探針的敏感性，可先將靶DNA序列擴增，增加DNA數量，使其達到足夠的檢測量，若反應以動力學為基礎，則能定量分析。應用于大腸埃希氏菌O157檢測中的PCR方法主要有：免疫捕獲PCR法、熒光定量PCR技術、復合PCR方法[17]等。免疫捕獲PCR法：根據特異性抗體與病原菌菌體抗原特異性結合的免疫學原理,將特異性抗體包被于磁珠或PCR管壁上,富集或捕獲菌懸液和標本中的病原菌,再進行PCR反應,即可檢測目標病原菌[18]。即應用免疫磁珠捕獲法和抗體包被微量PCR管免疫捕獲法富集標本中的E.coliO157∶H7,再以PCR法快速檢測O157抗原編碼基因,以期更為快速且高靈敏度[19]。熒光定量PCR技術：其特異性好,靈敏度高,檢測速度快,自動化程度高高等特點,已被廣泛應用于微生物學檢測中[20;21]。3.5DNA探針技術DNA探針技術是最新發(fā)展起來的一項特異、靈敏、快速的檢測方法，但因有一定比例的假陽性反應，故所有陽性結果必須用標準的培養(yǎng)方法加以確證，原理用特異性的DNA探針進行E.coliO157:H7核糖體RNA（rRNA）的檢測。待檢樣品經前增菌、選擇性增菌和后增菌后，溶解細菌。加入標記好的E.coliO157:H7異性的DNA探針用于液相雜交。如果待檢樣品中存有E.coliO157:H7的rRNA，熒光素標記的檢測探針和多聚脫氧腺嘌呤核苷酸(polydA)末端捕獲探針將與目標rRNA序列進行雜交。然后把包被有多聚脫氧胸腺嘧啶核苷酸(polydT)(固相)的測桿插入雜交溶液。PolydA和poldT之間進行堿基配對，便于探針捕獲：目標雜種核酸分子結合在固體載體上，未接合的探針被沖洗掉。測桿被培養(yǎng)在辣根過氧化物酶-抗熒光素接合劑中。接合劑與存在于雜交檢測探針上的熒光素標記物結合，未結合的劑被沖掉。并將測桿培養(yǎng)于酶底物-色原溶液中，辣根過氧化物酶與酶底物反應，將色原轉變?yōu)樗{色化合物。一旦遇酸反應便停止，色原的顏色變?yōu)辄S色。在450nm處測量吸收值，吸收值大于臨界則表明在待檢的樣品中存有E.coliO157:H7。3.6免疫捕獲LAMP法免疫捕獲LAMP法是基于免疫學方法與分子生物學方法相結合的一種病原菌快速檢測的方法。免疫捕獲可作為檢測實際樣品的預處理過程，根據特異性抗體與病原菌菌體抗原特異性結合的免疫學原理，將特異性抗體包被于酶標板上，捕獲菌懸液和標本中的病原菌，有效去除了食品樣品中抑制LAMP擴增的干擾成分，再進行LAMP反應，即可檢測目標病原菌。與傳統(tǒng)單一的LAMP檢測相比，金婷婷等人采用的酶標板免疫捕獲待測菌的方法，既大大縮短了增菌時間，又提高了檢測結果的準確性和穩(wěn)定性[22-26]。除以上介紹的方法之外，其它一些檢測方法有噬菌體分型、脈沖場電（PFGE）、限制片段長度多態(tài)性（RFLP）和擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）分析、生物傳感器法[8]、溶解曲線分析方法細胞毒性試驗[27;28]等也應用在大腸埃希氏菌O157:H7的檢測中。雖然傳統(tǒng)檢測方法費時費力，但仍然是目前檢測的金標準，而隨著研究的不斷深入，檢測方法的改進和提高，相信在不久的將來會實現快速、特異、準確、靈敏、大規(guī)模的檢測致瀉性大腸埃希氏菌，對快速有效的實施針對治療，及時救治生命，預防食物中毒，保障公眾健康具有重大意義。參考文獻［1］楊上池.病原性大腸桿菌O157.海港衛(wèi)生檢疫雜志1997;3;14［2］時全,黃新明,李朝陽,等.致瀉大腸埃希菌感染在腹瀉病中地位的研究[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2005,15(1):51.［3］丁業(yè)榮,時全,李朝陽,等.致瀉大腸埃希菌在水源水中的分布與腹瀉病關系的研究［J］.中國人獸共患病雜志,2005,21(11):9681.［4］秦小玄,朱朝敏.致瀉性大腸埃希氏菌的流行及耐藥現狀[J].兒科藥學雜志,2008,14(2):61～64.[5]王燕,謝貴林,杜琳.大腸桿菌O157:H7感染流行概況[J].微生物學免疫學進展,2008,36(1):51-58[6]李洪衛(wèi),景懷琦,逄波,等.徐州市2000年腸出血性大腸埃希菌O157:H7感染性腹瀉的調查[J].中華流行病學雜志,2004,23(2):119-122.[7]倪大新,汪華,顧玲,等.江蘇省1999年大腸埃希菌O157:H7宿主動物帶菌情況調查[J].中華流行病學雜志,2002,21(2):102-104.[8]孟祥升,辛崇興,邵晞.腸出血性大腸桿菌O157:H7研究進展[J].中國動物檢疫,2011,28(11):69-72[9]潘玲.腸出血性大腸桿菌（EHEC）O157:H7的研究近況[J].中國動物檢疫，1996，13（6）：37-38.[10]禤雄標,陳澤祥,謝永平,等.豬源大腸桿菌O157:H7廣西分離株的鑒定[J].中國動物檢疫,2010,27(3):52-53.[11]劉桂榮,劉園,嚴寒秋.弗枸櫞酸桿菌與EHECO157:H7的抗原交叉反應及生化鑒別的實驗[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2005,15(7):875.[12]GB/T4789.36-2008食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸埃希氏菌O157:H7/NM檢驗[S][13]賴衛(wèi)華,馮貽澤,白熙安克羅澤道森.大腸桿菌O157:H7快速培養(yǎng)的初步研究[J].食品科學,2009,30(7):145-147[14]劉紅亮,李克生,陳學忠,等.大腸桿菌O157LPS單克隆抗體的制備及ELISA檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學,2011,41(12):1260-1265；[15]葛萃萃,鐘青萍,張旺,等.雙抗夾心ELISA檢測食品中大腸桿菌O157:H7方法研究[J].食品科學,2007,28(1):171-175）[16]唐倩倩,王劍平,葉尊忠.免疫磁分離技術在大腸桿菌O157:H7檢測中的應用[J].光譜學與光譜分析,2009,29(10):2614-2618[17]趙志晶,劉秀梅.食品樣品中大腸桿菌O157:H7復合PCR檢測方法的研究[J].衛(wèi)生究,2004,33(6):717-718[18]XuanxianPeng,WenLuo,JianyingZhang,etc.RapiddetectionofShigellaspeciesinenvironmentalsewagebyanimmunocapturePCRwithuniversalprimers.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2002,May,:2580-2583.[19]牛建軍,黃建煒,李莉,等.免疫捕獲PCR法快速檢測大腸埃希氏菌O157:H7的研究[J].中國人獸共患病雜志,2004,20(10):897-900[20]王濤,劉凱,王艷,等.應用免疫磁珠分離法及熒光定量PCR技術快速檢測腸出血性大腸埃希菌O157:H7[J].中國人獸共患病學報,2011,27(4):291-293[21]KarenC,KenJ,StephenD.MultiplexReal-TimePCRmethodtoidentifyShigatoxingenesstx1,stx2andEscherichiacoliOl57:H7/H-serotype[J].ApplEnvironMicrobiol,2003,69(10):6327-6334.[22]金婷婷,馬福金,袁耀武.免疫捕獲LAMP快速檢測E.coliO157:H7的研究[23]劉道亮,胡連霞,趙占民,等.改良環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測肉類中的大腸桿菌O157:H7[J].微生物學通報,2011,38(3):430-435；[24]ChayapaTechathuvanan,FrancesAnnDraughon,DorisHelenD’Souza.Loop-MediatedIsothermalAmplification(LAMP)fortheRapidandS