備課素材：?jiǎn)慰寺】贵w的制備過程-高二下學(xué)期生物人教版（2019）選擇性必修3

單克隆抗體的制備過程單克隆抗體就是從免疫的小鼠脾臟細(xì)胞中獲取B淋巴細(xì)胞，在誘導(dǎo)劑的作用下與骨髓瘤細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞，并通過體內(nèi)培養(yǎng)或體外培養(yǎng)生產(chǎn)得到的。這種抗體與普通血清抗體相比較，具有特異強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)。在單克隆抗體的制備過程中，除了運(yùn)用動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)，還運(yùn)用動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選和培養(yǎng)。單克隆抗體技術(shù)是1975年英國(guó)科學(xué)家Milstein和Kohler所發(fā)明，并獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。骨髓瘤細(xì)胞與免疫的動(dòng)物脾細(xì)胞融合，形成能分泌針對(duì)該抗原的均質(zhì)的高特異性的抗體——單克隆抗體，這種技術(shù)通稱為雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)的基礎(chǔ)是細(xì)胞融合技術(shù)。單克隆抗體技術(shù)的流程為：脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在聚乙二醇(PEG)作用下發(fā)生細(xì)胞融合；加入HAT選擇培養(yǎng)基(含H、A和T)后，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因其從頭合成途徑被氨基蝶呤阻斷，而又缺乏HGPRT不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA，從而死亡；未融合的脾細(xì)胞難以在體外培養(yǎng)而死亡；融合細(xì)胞因從脾細(xì)胞獲得HGPRT，故可在HAT選擇培養(yǎng)基中存活和增殖。第一步：親本細(xì)胞的準(zhǔn)備致敏B淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備：目的抗原免疫小鼠一般選用健康8周齡的純系BALB/C小鼠作免疫動(dòng)物。免疫用的目的抗原是各種病毒、細(xì)菌、癌細(xì)胞等。采用腹腔和皮下注射，每隔3－4天注射一次，連續(xù)3－4周后，檢查抗體滴度效價(jià)（免疫學(xué)上的定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)）。如符合要求，再由尾靜脈作最后一次加強(qiáng)免疫，4－5天后，取脾臟分離B淋巴細(xì)胞備用。從脾臟細(xì)胞中高效分離單個(gè)抗原特異性B淋巴細(xì)胞的方法：利用以生物標(biāo)記的非B細(xì)胞淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物抗體對(duì)脾臟細(xì)胞進(jìn)行負(fù)篩選（對(duì)不需要的脾臟細(xì)胞殺死），再利用親和素磁珠與磁性分離原理去除非B細(xì)胞，以提高脾臟細(xì)胞中B淋巴細(xì)胞相對(duì)豐度；利用熒光標(biāo)記的IgM多克隆抗體和預(yù)標(biāo)記篩選用抗原，對(duì)前面得到的脾臟細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步負(fù)篩選，以流式細(xì)胞技術(shù)去表面不表達(dá)IgG分子的B細(xì)胞，保留與預(yù)標(biāo)記篩選抗原結(jié)合的目標(biāo)淋巴細(xì)胞；利用熒光染料7-AAD進(jìn)行分選，去除死細(xì)胞；用流式細(xì)胞儀，進(jìn)行單細(xì)胞的篩選，得到目標(biāo)淋巴細(xì)胞。骨髓瘤細(xì)胞的制備：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)盡可能用與B淋巴細(xì)胞來源相同的種系，而且必須具有代謝缺陷特征（次黃嘌呤磷酸核苷激酶缺陷HGPRT－或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷TK－）。另外，還要優(yōu)化骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)條件，使其克隆形成率達(dá)到80%以上。第二步：細(xì)胞融合按一定比例（大多5：1）將B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞混合，并加入聚乙二醇（PEG）誘融劑誘導(dǎo)細(xì)胞融合。第三步：雜交瘤細(xì)胞融的篩選細(xì)胞融合后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到HAT培養(yǎng)液中，接種到96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)1－2周后，未融合的B淋巴細(xì)胞及其同核體，未融合的骨髓瘤細(xì)胞及其同核體相繼死亡，雜交瘤細(xì)胞存活并形成細(xì)胞集落。第四步：可分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞的篩選對(duì)每個(gè)含有雜交瘤細(xì)胞集落生長(zhǎng)孔中的上清液進(jìn)行抗體檢測(cè)，篩選出能夠穩(wěn)定分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞。常用的檢測(cè)抗體的方法有放射免疫測(cè)定、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和免疫熒光測(cè)定等。主要以免疫源為靶抗原，以雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)孔內(nèi)上清液為一抗，以放射性核素、酶或熒光素標(biāo)記的兔/羊抗原IgG為二抗，利用放射性核素測(cè)定、底物顯色或在熒光顯微鏡觀察熒光顆粒，判斷上清液是否含有相應(yīng)的抗體（如圖）。第五步：雜交瘤細(xì)胞的克隆培養(yǎng)篩選出的上清液為陽(yáng)性的生長(zhǎng)孔內(nèi)通常會(huì)含有2個(gè)以上的雜交瘤細(xì)胞集落。有的集落可能不分泌抗體，或分泌的不是所需抗體。必須用克隆培養(yǎng)法讓它們分離開。最常用的克隆培養(yǎng)法是有限稀釋法和軟瓊脂培養(yǎng)法。前者是將稀釋到一定密度的細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中，盡可能每個(gè)孔中只有一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)。后者是利用軟瓊脂的半固體性質(zhì)，使單個(gè)的雜交瘤細(xì)胞在相對(duì)固定的位置上增殖形成細(xì)胞克隆。第六步：?jiǎn)慰寺】贵w的純化和生產(chǎn)一種方法是體外培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，然后收集上清液，通過離子交換、凝膠過濾或親和層析等方法純化得到單克隆抗體；另一種方法是將雜交瘤細(xì)胞接種到同系小鼠腹腔生長(zhǎng)，然后抽取腹水，經(jīng)離子交換、凝膠過濾或親和層析等方法純化得到單克隆抗體。例、（2020年全國(guó)卷1）為研制抗病毒A的單克隆抗體，某同學(xué)以小鼠甲為實(shí)驗(yàn)材料設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn)流程?；卮鹣铝袉栴}：（1）上述實(shí)驗(yàn)前必須給小鼠甲注射病毒A，該處理的目的是

。（2）寫出以小鼠甲的脾臟為材料制備單細(xì)胞懸液的主要實(shí)驗(yàn)步驟:

。（3）為了得到能產(chǎn)生抗病毒A的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，需要進(jìn)行篩選。圖中篩選1所采用的培養(yǎng)基屬于

，使用該培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果是

。圖中篩選2含多次篩選，篩選所依據(jù)的基本原理是

。（4）若要使能產(chǎn)生抗病毒A的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞大量增殖，可采用的方法有

（答出2點(diǎn)即可）。答案：（1）誘導(dǎo)小鼠甲產(chǎn)生能夠分泌抗病毒A抗體的B淋巴細(xì)胞

（2）取小鼠甲脾臟剪碎，用胰蛋白酶處理使其分散成單個(gè)細(xì)胞，加入培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液

（3）選擇培養(yǎng)基

只有雜交瘤細(xì)胞能夠生存

抗原與抗體的反應(yīng)具有特異性

（4）將雜交瘤細(xì)胞注射到小鼠腹腔內(nèi)增殖；將雜交瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)

解析：由圖可知，篩選1指用選擇培養(yǎng)基篩選出雜交瘤細(xì)胞，篩選2指進(jìn)行克隆化培養(yǎng)和專一抗體檢測(cè)，篩選出能產(chǎn)生特定抗體的雜交瘤細(xì)胞。

（1）實(shí)驗(yàn)前給小鼠甲注射病毒A，是為了誘導(dǎo)小鼠甲產(chǎn)生能夠分泌抗病毒A抗體的B淋巴細(xì)胞。

（2）取小鼠的脾臟，剪碎組織，用胰蛋白酶（或膠原蛋白酶）處理獲得單個(gè)細(xì)胞，加入培養(yǎng)液可以制成單細(xì)胞懸液。

（3）圖中篩選1需要用到選擇培養(yǎng)基，只有雜交瘤細(xì)胞可以存活。篩選2