淀粉酶活性測定實(shí)驗(yàn)報(bào)告

淀粉酶活性測定實(shí)驗(yàn)報(bào)告淀粉酶活性測定實(shí)驗(yàn)報(bào)告淀粉酶活性測定實(shí)驗(yàn)報(bào)告xxx公司淀粉酶活性測定實(shí)驗(yàn)報(bào)告文件編號(hào)：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計(jì)，管理制度班級(jí)：植物092姓名：徐煒佳學(xué)號(hào)：03淀粉酶活性的測定一、研究背景及目的酶是高效催化有機(jī)體新陳代謝各步反應(yīng)的活性蛋白，幾乎所有的生化反應(yīng)都離不開酶的催化，所以酶在生物體內(nèi)扮演著極其重要的角色，因此對酶的研究有著非常重要的意義。酶的活力是酶的重要參數(shù)，反映的是酶的催化能力，因此測定酶活力是研究酶的基礎(chǔ)。酶活力由酶活力單位表征，通過計(jì)算適宜條件下一定時(shí)間內(nèi)一定量的酶催化生成產(chǎn)物的量得到淀粉酶是水解淀粉的糖苷鍵的一類酶的總稱，按照其水解淀粉的作用方式，可分為α-淀粉酶和β-淀粉酶等。α-淀粉酶和β-淀粉酶是其中最主要的兩種，存在于禾谷類的種子中。β-淀粉酶存在于休眠的種子中，而α-淀粉酶是在種子萌發(fā)過程中形成的。α-淀粉酶活性是衡量小麥穗發(fā)芽的一個(gè)生理指標(biāo),α-淀粉酶活性低的品種抗穗發(fā)芽,反之則易穗發(fā)芽。目前,關(guān)于α-淀粉酶活性的測定方法很多種,活力單位的定義也各不相同,國內(nèi)外測定α-淀粉酶活性的方法常用的有凝膠擴(kuò)散法、3

,5-二硝基水楊酸比色法和降落值法

。這3

種方法所用的材料分別是新鮮種子、萌動(dòng)種子和面粉,獲得的α-淀粉酶活性應(yīng)該分別是延遲(內(nèi)源)α-淀粉酶、萌動(dòng)種子α-淀粉酶和后熟面粉的α-淀粉酶活性。測定方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)DNS靈敏、準(zhǔn)確、精確度高,適宜精確測量小樣品α-淀粉酶活性大小測定步驟較繁,不便分析大量樣品,測定范圍較窄凝膠擴(kuò)散法簡便、快速、省時(shí)、省力,消耗材料和藥品較少,不需要特殊儀器,測定范圍較寬邊界不清晰,靈敏度與準(zhǔn)確度較低,不適宜精確測量α-淀粉酶活性的大小降落值法快速、省時(shí)、重現(xiàn)性好、平行性好、消耗的藥品少,適宜于測量大量樣品消耗的材料多,間接測定α-淀粉酶活性大小本實(shí)驗(yàn)的目的在于掌握α-淀粉酶和β-淀粉酶的提取和測定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理萌發(fā)的種子中存在兩種淀粉酶，分別是α-淀粉酶和β-淀粉酶，β-淀粉酶不耐熱，在高溫下易鈍化，而α-淀粉酶不耐酸，在下則發(fā)生鈍化。本實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)利用β-淀粉酶不耐熱的特性，在高溫下（70℃）下處理使得β-淀粉酶鈍化而測定α-淀粉酶的酶活性。酶活性的測定是通過測定一定量的酶在一定時(shí)間內(nèi)催化得到的麥芽糖的量來實(shí)現(xiàn)的，淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可用3,5-二硝基水楊酸試劑測定，由于麥芽糖能將后者還原生成硝基氨基水楊酸的顯色基團(tuán)，將其顏色的深淺與糖的含量成正比，故可求出麥芽糖的含量。常用單位時(shí)間內(nèi)生成麥芽糖的毫克數(shù)表示淀粉酶活性的大小。然后利用同樣的原理測得兩種淀粉酶的總活性。實(shí)驗(yàn)中為了消除非酶促反應(yīng)引起的麥芽糖的生成帶來的誤差，每組實(shí)驗(yàn)都做了相應(yīng)的對照實(shí)驗(yàn)，在最終計(jì)算酶的活性時(shí)以測量組的值減去對照組的值加以校正。在實(shí)驗(yàn)中要嚴(yán)格控制溫度及時(shí)間，以減小誤差。并且在酶的作用過程中，四支測定管及空白管不要混淆。三、材料、試劑與儀器實(shí)驗(yàn)材料：萌發(fā)的小麥種子（芽長1厘米左右）儀器：722光柵分光光度計(jì)(編號(hào)990695)DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(編號(hào)L-304056)離心機(jī)(TDL-40B)容量瓶：50ml×1，100ml×1小臺(tái)秤研缽具塞刻度試管：15ml×6試管：8支移液器燒杯試劑：①1%淀粉溶液（稱取1克可溶性淀粉，加入80ml蒸餾水，加熱熔解，冷卻后定容至100ml）；②的檸檬緩沖液：A液（稱取檸檬酸克，溶解后定容至1L）B液（稱取檸檬酸鈉克，溶解后定容至1L）取A液、B液混勻即為檸檬酸緩沖液；③3，5-二硝基水楊酸溶液（稱取3，5-二硝基水楊酸克，溶于20ml1M氫氧化鈉中，加入50ml蒸餾水，再加入30克酒石酸鈉，待溶解后，用蒸餾水稀釋至100ml，蓋緊瓶蓋保存）；④麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（稱取克麥芽糖，溶于少量蒸餾水中，小心移入100ml容量瓶中定容）；⑤NaOH四、實(shí)驗(yàn)步驟1.酶液的制備稱取2克萌發(fā)的小麥種子與研缽中，加少量石英砂，研磨至勻漿，轉(zhuǎn)移到50ml容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，混勻后在室溫下放置，每隔數(shù)分鐘振蕩一次，提取15-20分鐘，于3500轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取上清液備用。2.α-淀粉酶活性的測定①取4支管，注明2支為對照管，另2支為測定管②于每管中各加酶提取液液1ml，在70℃恒溫水浴中（水浴溫度的變化不應(yīng)超過±℃）準(zhǔn)確加熱15min，在此期間β-淀粉酶③在試管中各加入1ml檸檬酸緩沖液④向兩支對照管中各加入4mlNaOH，以鈍化酶的活性⑤將測定管和對照管置于40℃（±℃）恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫15min再向各管分別加入40℃下預(yù)熱的淀粉溶液2ml，搖勻，立即放入40℃水浴中準(zhǔn)確保溫5min后取出，向兩支測定管3.兩種淀粉酶總活性的測定取上述酶液5ml于100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度（稀釋倍數(shù)視樣品酶活性大小而定，一般為20倍）?；旌暇鶆蚝?，取4支管，注明2支為對照管，另2支為測定管，各管加入1ml稀釋后的酶液及檸檬酸緩沖液1ml，以下步驟重復(fù)α-淀粉酶測定的第④及第⑤的操作。4.麥芽糖的測定⑴標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取15ml具塞試管7支，編號(hào)，分別加入麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml)0、、、、、、毫升，用蒸餾水補(bǔ)充至，搖勻后再加入3，5-二硝基水楊酸1ml，搖勻，沸水浴中準(zhǔn)確保溫5min，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至15ml，搖勻后用分光光度計(jì)于520nm波長下比色，記錄消光值，以消光值為縱坐標(biāo)，以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。⑵樣品的測定取15ml具塞試管8支，編號(hào)，分別加入步驟2和3中各管的溶液各1ml，再加入3，5-二硝基水楊酸1ml，搖勻，沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5min，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至15ml，搖勻后用分光光度計(jì)于520nm波長下比色，記錄消光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。五、數(shù)據(jù)整理及計(jì)算麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度mg/ml0OD520項(xiàng)目α(測)α(測)α(對)α(對)α+β(測)α+β(測)α+β(對)α+β(對)OD520平行組數(shù)據(jù)均值OD520樣品麥芽糖濃度mg/ml上表中前4行數(shù)據(jù)為實(shí)驗(yàn)的原始數(shù)據(jù)。以表中前兩行數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見下頁），計(jì)算上表中第4行數(shù)據(jù)（各樣品的OD值）均值，填入上第5行中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程，計(jì)算第5行OD值所對應(yīng)的麥芽糖濃度，填入最后一行，如上表。根據(jù)以上的數(shù)據(jù)整理的結(jié)果，結(jié)合以下公式計(jì)算兩種淀粉酶的活性：A——α-淀粉酶測定管中的麥芽糖濃度A’——α-淀粉酶對照管中的淀粉酶的濃度B——(α-+β-)淀粉酶總活性測定管中的麥芽糖濃度B’——(α-+β-)淀粉酶總活性對照管中的麥芽糖濃度計(jì)算結(jié)果如下：α-淀粉酶活性=（毫克麥芽糖?克-1鮮重?分鐘-1）(α-+β-)淀粉酶活性=（毫克麥芽糖?克-1鮮重?分鐘-1）β-淀粉酶活性=（毫克麥芽糖?克-1鮮重?分鐘-1）六、結(jié)果分析七、思考題1、酶活力測定實(shí)驗(yàn)的總體設(shè)計(jì)思路是什么實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵你認(rèn)為是什么為什么？

答：利用酶的專一性或酶活力的影響因素抑制除待測酶以外的其它酶活性，通過測酶促反應(yīng)的產(chǎn)率推算酶活力大小。關(guān)鍵在于抑制其它酶的活力而不影響測定酶，這樣可以減小或避免其它酶產(chǎn)物給測定結(jié)果帶來的誤差。2、本實(shí)驗(yàn)最易產(chǎn)生對結(jié)果有較大誤差影響的操作是哪些步驟為什么怎樣的操作策略可以盡量減少誤差答：①浸提步驟。70℃溫度或15min時(shí)間控制不嚴(yán)格不準(zhǔn)確則可能導(dǎo)致β淀粉酶未完全鈍化使測得活性偏大。應(yīng)嚴(yán)格控制溫度和時(shí)間。②70℃水浴后需要立即冰浴，否則β淀粉酶復(fù)性使測得α淀粉酶活性結(jié)果偏大。3、-淀粉酶活性測定時(shí)70℃答：由于-淀粉酶不耐熱，在70℃下處理一定時(shí)間可以鈍化，嚴(yán)格保溫15分鐘可以達(dá)到理想的鈍化效果，時(shí)間過長，-淀粉酶活性也會(huì)受到影響；時(shí)間不足，-淀粉酶鈍化不完全。保溫后立即驟冷是為了通過劇烈的溫變改變-淀粉酶的結(jié)構(gòu)以防止在隨后的反應(yīng)中復(fù)性，這樣就保證了在隨后的40℃溫浴的酶促反應(yīng)中4、檸檬酸緩沖液的作用？各管于40℃答：酶實(shí)驗(yàn)體系的pH值變化或變化過大，會(huì)使酶活性下降甚至完全失活。加入的緩沖液調(diào)至酶促反應(yīng)的最適pH，同時(shí)穩(wěn)定溶液的pH不至于在反應(yīng)過程中大幅波動(dòng)。40℃水浴準(zhǔn)確保溫15分鐘5、眾多測定淀粉酶活力的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中一般均采取鈍化-淀粉酶的活力而測-淀粉酶和測總酶活力的策略，為何不采取鈍化-淀粉酶活力去測-淀粉酶活力呢？這種設(shè)計(jì)思路說明什么答：β淀粉酶與α淀粉酶的催化特性是有差異的。β淀粉酶主要作用于直鏈淀粉的α-1，4-糖苷鍵，而且僅從淀粉分子外圍的非還原性末端開始，切斷至α-1,6-鍵的前面反應(yīng)就停止了；而α淀粉酶則無差別地作用于直鏈淀粉與支鏈淀粉的α-1，4-糖苷鍵，所以β淀粉酶需要α淀粉酶淀粉支鏈的α-1，4-糖苷鍵后才能完全體現(xiàn)其催化能力。此外我認(rèn)為在實(shí)驗(yàn)中溫度比酸度更易控制，鈍化α淀粉酶難度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于β淀粉酶，而且若提高酸度鈍化α淀粉酶，則回調(diào)最適pH時(shí)α淀粉酶也有可能由于復(fù)性恢復(fù)活力。這種設(shè)計(jì)思路說明在測定酶的比活力時(shí)要綜合考慮各種可能出現(xiàn)的酶的性質(zhì)以及它們之間的聯(lián)系，也要考慮到實(shí)驗(yàn)操作的可行性。6、本實(shí)驗(yàn)中所設(shè)置的對照管的作用它與比色法測定物質(zhì)含量實(shí)驗(yàn)中設(shè)置的空白管有何異同本實(shí)驗(yàn)可否用對照管調(diào)分光光度計(jì)的100%T為什么答：消除非酶促反應(yīng)（如淀粉酸性環(huán)境下加熱水解）和非測定時(shí)間內(nèi)的酶促反應(yīng)引起的麥芽糖的生成帶來的誤差。兩種都是為了消除非測定部分對光的吸收，空白組是為了消除溶液中溶劑等其它組分對光的吸收，而對照管是為了消除非測量所需反應(yīng)所得的多余溶質(zhì)對光的吸收。不可，因?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)曲線的確定是在空白的基礎(chǔ)上的，得到的是OD值與麥芽糖含量的關(guān)系7、我們所測定得到的總酶活力減去所測定得到的-淀粉酶活力是否就等于-淀粉酶活力為什么你的結(jié)論說明什么答：不等于。因?yàn)棣碌矸勖负挺恋矸勖缸饔糜讦?1,4糖苷鍵，但二者都不能水解支鏈的α-1，6-糖苷鍵，而我們所測定得到的總酶活力是二者在與R酶的共同作用下測得的酶活力，R酶能夠降解支鏈淀粉，斷裂α-1,6-糖苷鍵，從而增大了β淀粉酶和α淀粉酶可水解的底物濃度，使測得的總活力大于β淀粉酶和α淀粉酶單獨(dú)作用的酶活力之和。我的結(jié)論說明實(shí)驗(yàn)時(shí)要考慮各種酶協(xié)同作用的綜合因素七、參考文獻(xiàn)[1]生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室中國農(nóng)業(yè)大學(xué)自編教材[2]基礎(chǔ)生物化學(xué)趙武