牛奶中酪蛋白的提取與分析

牛奶中酪蛋白的提取與分析牛奶中酪蛋白的提取與分析牛奶中酪蛋白的提取與分析xxx公司牛奶中酪蛋白的提取與分析文件編號(hào)：文件日期：修訂次數(shù)：第1.0次更改批準(zhǔn)審核制定方案設(shè)計(jì)，管理制度實(shí)驗(yàn)題目：牛奶中酪蛋白的提取與分析實(shí)驗(yàn)材料：牛奶小組成員：實(shí)驗(yàn)時(shí)間：一：實(shí)驗(yàn)題目：牛奶中酪蛋白的提取與分析二：報(bào)告撰寫者小組成員實(shí)驗(yàn)儀器溫度計(jì)、布氏漏斗（*）、pH試紙（*）、抽濾瓶（*）水浴鍋、燒杯、量筒、表面皿（*）、電子天平（*）、2個(gè)1000ml的容量瓶（*）、2張醋酸纖維薄膜（2cm×8cm厚度120nm）成品（*）、培養(yǎng)皿9—10cm（*）、毛細(xì)管（*）、尺子、鉛筆、單面刀片（*）、鑷子、普通濾紙（*）、電泳槽、玻璃板8cm×12cm（*）、752型分光光度計(jì)（*）、細(xì)布（*）、、、的移液管、試管、試管架、實(shí)驗(yàn)材料牛奶（蒙牛特侖蘇和伊利金典）實(shí)驗(yàn)試劑特侖蘇400ml、金典200ml、巴比妥（*）、巴比妥鈉（*）、氨基黑10B（*）、50ml甲醇AR（*）、100ml冰醋酸AR（*）、95%的乙醇250ml（*)、95%的乙醚100ml（*）、L的乙酸100ml（*）、L的乙酸鈉100ml（*）、25g氫氧化鈉固體（*）標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白、15mg五水硫酸銅（*）、60mg酒石酸鉀鈉（*）所需試劑配制方法：乙醇乙醚混合液的配制：配制乙醇乙醚1:1的混合液10ml95%的乙醇配制乙醇乙醚1:1的混合液10ml95%的乙醚乙醇鈉緩沖液的配制：配制的乙酸鈉緩沖液（l）L的乙酸51ml配制的乙酸鈉緩沖液（l）L的乙酸鈉49ml巴比妥鈉緩沖液的配制：配制巴比妥鈉緩沖液（,./L）,將上述二者混合后定容于1000ml巴比妥配制巴比妥鈉緩沖液（,./L）,將上述二者混合后定容于1000ml巴比妥鈉染色液的配制：+40ml蒸餾水，混勻既得染色液氨基黑10B+40ml蒸餾水，混勻既得染色液50ml甲醇AR10ml冰醋酸AR漂洗液的配制：45ml95%乙醇AR混勻得染色液5ml冰醋酸AR混勻得染色液蒸餾水混勻得透明液透明液的配制：混勻得透明液25ml的冰醋酸AR75ml的無(wú)水乙醇ARL氫氧化鈉溶液的配制：16g的氫氧化鈉固體定容至1000ml10%氫氧化鈉溶液的配制：5g的氫氧化鈉固體定容至50ml溶于5ml蒸餾水，在攪拌情況下，加入10%氫氧化鈉溶液溶于5ml蒸餾水，在攪拌情況下，加入10%氫氧化鈉溶液3ml，用蒸餾水稀釋到10ml，用棕色瓶避光保存15mg五水硫酸銅60mg酒石酸鉀鈉標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液A的配制（10mg/ml）：用L氫氧化鈉溶液配制10ml從特侖蘇和金典中提取的酪蛋白樣品液1、2的配制（2-9mg/ml）：用L氫氧化鈉溶液配制10ml標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液B的配制（1500μg/ml）：用L氫氧化鈉溶液配制從特侖蘇和金典中提取的酪蛋白樣品液3、4的配制（50-1500μg/ml）：用L氫氧化鈉溶液配制七、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆諒呐Ｄ讨刑崛±业鞍椎姆椒私獾鞍踪|(zhì)分離純化的基本辦法學(xué)習(xí)電泳的基本原理及掌握醋酸纖維素薄膜電泳分離酪蛋白的具體操作掌握雙縮脲法和紫外吸收法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理及操作方法并比較兩種方法熟悉分光光度計(jì)的原理和操作比較特侖蘇與金典中的酪蛋白含量八、實(shí)驗(yàn)原理酪蛋白在其等電點(diǎn)時(shí)靜電荷為零，同種電荷的相互排斥作用消失，溶解度很低，利用這一性質(zhì)，將牛乳調(diào)節(jié)到，酪蛋白就可以從牛乳中分離出來(lái)。酪蛋白不溶解于乙醇，這個(gè)性質(zhì)被用來(lái)從酪蛋白中除去脂類雜質(zhì)。酪蛋白并不是單一的一種蛋白質(zhì)，而是多種性質(zhì)類似的蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱。其一般由αs—，β—，γ—，κ—4種類型組成。它們各自的等電點(diǎn)（pI）具有一定的差異，本實(shí)驗(yàn)將酪蛋白溶液點(diǎn)樣于用(高于酪蛋白各型等電點(diǎn))緩沖液浸泡過(guò)的醋酸纖維膜上，并在該緩沖液體系中進(jìn)行電泳，使酪蛋白分子上帶上不同量的負(fù)電荷，在電泳過(guò)程中酪蛋白分子由負(fù)極向正極移動(dòng)，同時(shí)酪蛋白各類型分子的相對(duì)分子量也不同，因此在電泳過(guò)程中其遷移率也不同，從而把酪蛋白的各種類型分離開(kāi)來(lái)。酪蛋白各組分的含量、等電點(diǎn)及大小蛋白質(zhì)名稱含量（%）等電點(diǎn)相對(duì)分子質(zhì)量沉降系數(shù)αs—酪蛋白45~5523000β—酪蛋白25~3524000γ—酪蛋白8~1519000κ—酪蛋白3~7~21000雙縮脲在堿性溶液中能與二價(jià)銅離子產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物，該反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中因含有兩個(gè)以上的肽鍵，因此也能發(fā)生雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)在堿性溶液中與二價(jià)銅離子產(chǎn)生紫紅色絡(luò)合物，其顏色的深淺在一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)的含量稱正比，與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及相對(duì)分子質(zhì)量無(wú)關(guān)。故可用雙縮脲反應(yīng)來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，測(cè)定范圍為ml蛋白質(zhì)。由于蛋白質(zhì)分子中含有的酪氨酸、色氨酸等殘基中具有共軛雙鍵，使得蛋白質(zhì)在280nm處具有最大吸收值，且其光吸收值與濃度在一定范圍內(nèi)成正比，因此，該法可用作蛋白質(zhì)定量測(cè)定。該法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)具有簡(jiǎn)單、靈敏、快速、不消耗樣品、不受低濃度鹽干擾等優(yōu)點(diǎn)，但該法準(zhǔn)確度較差，特別是如果樣品中含有嘧啶、嘌呤等吸收紫外光的物質(zhì)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾，這時(shí)，就需要通過(guò)紫外吸收差來(lái)求蛋白質(zhì)濃度，但也存在著一定的誤差。九、實(shí)驗(yàn)步驟酪蛋白的提取酪蛋白的等電點(diǎn)沉淀做六組平行試驗(yàn)，每組分別：將100ml的牛奶放到500ml的燒杯中，加入40度左右的乙酸鈉緩沖液，直到pH達(dá)左右，用pH試紙調(diào)試。將上述懸濁液冷卻至室溫，然后放置5min，用細(xì)布過(guò)濾，收集沉淀。除去脂類雜質(zhì)將上述沉淀用少量水洗數(shù)次，然后懸浮于30ml95%的乙醇中。將此懸浮液傾入布氏漏斗中，抽濾除去乙醇溶液，再倒入乙醇—乙醚混合液總洗滌沉淀兩次，最后再乙醚洗滌沉淀兩次，抽干。將沉淀從布氏漏斗中移去。在表面皿上攤開(kāi)以除去乙醚，干燥后得到的即為酪蛋白。準(zhǔn)確稱重。（二）酪蛋白的分離與分析醋酸纖維薄膜的準(zhǔn)備（2張）將醋酸纖維薄膜緩緩進(jìn)入盛有巴比妥鈉緩沖液的器皿中，全部潤(rùn)濕10-30min，至膜上無(wú)白點(diǎn)存在。樣品處理分別取出從特侖蘇和金典中制備的酪蛋白，加L的NAOH溶解，備用。儀器和薄膜的準(zhǔn)備電泳裝置的準(zhǔn)備：用四層干凈的濾紙作濾紙橋，將其用緩沖液潤(rùn)濕，鋪墊在電泳槽支架上，電泳槽內(nèi)加入巴比妥鈉緩沖液至刻度線處，并使兩槽中的緩沖液保持在同一液面。注意濾紙橋的底邊必須進(jìn)入緩沖液中，并將電極儀連接好。用鑷子將浸泡好的醋酸纖維薄膜從緩沖液輕輕取出，注意用鑷子夾在薄膜的一邊角處，將無(wú)光澤面朝上，平放在干凈濾紙上，其上再放一層濾紙，用手輕壓，以吸取薄膜上多余的緩沖液。點(diǎn)樣取出濕潤(rùn)的醋酸纖維素薄膜，夾在兩層濾紙間吸取多余的緩沖液，無(wú)光澤面向上，在距離薄膜一端處，用鉛筆輕輕畫一直線。用玻璃棒粘取酪蛋白樣品液，涂于蓋玻片邊緣處，將蓋玻片截面與薄膜無(wú)光澤面（涂有醋酸纖維素）畫線處垂直接觸，輕輕3-5s，是樣品滲入膜內(nèi)，然后輕輕提起蓋玻片，點(diǎn)樣完畢。放膜揭開(kāi)電泳槽蓋子，把薄膜兩端平貼在濾紙橋上，放膜時(shí)需特別注意：點(diǎn)樣面朝上（與濾紙直接接觸形成電流閉合環(huán)路），點(diǎn)樣端放于電泳槽負(fù)極端（酪蛋白已帶上負(fù)電荷，電泳時(shí)從負(fù)極向正極移動(dòng)）。把膜放好拉直后立即蓋上電泳槽蓋子，以防膜邊干。電泳打開(kāi)電泳儀電泳開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至90-110V，電流，電泳時(shí)間45-60min。在電泳過(guò)程中，應(yīng)該注意控制電壓和電流強(qiáng)度，以防過(guò)高或者過(guò)低，并保持電泳的連續(xù)性。染色與漂洗脫色電泳關(guān)閉后，關(guān)閉電源，用鑷子立即取出薄膜，直接浸泡在染色液中染色3-5min，取出后用漂洗液漂洗數(shù)次，每次約10min，直至背景藍(lán)色脫盡。然后用蒸餾水清洗一下，用濾紙吸去膜上多余的水分，用電吹風(fēng)的冷風(fēng)將薄膜吹干。透明將吹干后的薄膜進(jìn)入透明液中15s左右，立即用鑷子取出，平放在干凈的玻璃板上，輕輕趕去氣泡，鋪平膜，用電吹風(fēng)冷風(fēng)將膜吹干，即得到一張透明的電泳區(qū)帶圖譜。定量將漂洗干凈的薄膜用濾紙吸干后剪下各蛋白質(zhì)區(qū)帶，分別浸泡于盛有L的NAOH溶液中，37度保溫5-10min，待色澤全部被浸出后，將溶液在590nm波長(zhǎng)下比色。分部測(cè)出各蛋白質(zhì)部分的吸光度，和它們的總吸光度。（三）牛奶中酪蛋白含量的測(cè)定——雙縮脲法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取21支干燥干凈試管編號(hào)（每個(gè)編號(hào)3支平行試管），按下表加入各試劑123456710mg/ml標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液A/ml0蒸餾水/ml0雙縮脲試劑/ml蛋白質(zhì)含量/ml010A540將各試管混勻后，在室溫下放置30min，每次均以1號(hào)試管調(diào)零測(cè)定各管在540nm波長(zhǎng)下的吸光度。取3組測(cè)定的平均值，以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算二次線性回歸方程。樣品測(cè)定及分析——特侖蘇取三支試管，分別吸取酪蛋白樣品液1，然后加入雙縮脲試劑，室溫下放置30min。以1號(hào)試管調(diào)零測(cè)定540nm波長(zhǎng)下樣品液的吸光度。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線或代入二次線性回歸方程求出樣品液中蛋白質(zhì)的含量。樣品測(cè)定及分析——金典取三支試管，分別吸取酪蛋白樣品液2，然后加入雙縮脲試劑，室溫下放置30min。以1號(hào)試管調(diào)零測(cè)定540nm波長(zhǎng)下樣品液的吸光度。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線或代入二次線性回歸方程求出樣品液中蛋白質(zhì)的含量。牛奶中酪蛋白含量的測(cè)定——紫外吸收法15、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液B用L氫氧化鈉溶液分別配制成一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液：50,100,200,400,600,800,1000,1500μg/ml。以L氫氧化鈉溶液作為對(duì)照調(diào)零，選用光程1cm的石英比色杯，在280nm波長(zhǎng)處測(cè)定上述各標(biāo)準(zhǔn)溶液的光吸收值，以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪出蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算二次線性回歸方程。樣品測(cè)定及分析——特侖蘇取一定的酪蛋白樣品液3，以L氫氧化鈉溶液作為對(duì)照調(diào)零，選用光程1cm的石英比色杯，在280nm波長(zhǎng)處測(cè)定酪蛋白樣品液的光吸收值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線或代入二次線性回歸方程，然后求出樣品液中蛋白質(zhì)的含量。樣品測(cè)定及分析——金典取一定的酪蛋白樣品液4，以L氫氧化鈉溶液作為對(duì)照調(diào)零，選用光程1cm的石英比色杯，在280nm波長(zhǎng)處測(cè)定酪蛋白樣品液的光吸收值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線或代入二次線性回歸方程，然后求出樣品液中蛋白質(zhì)的含量。十、實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果1、提取的酪蛋白為白色粉末狀，中夾雜黃色塊狀物體。其產(chǎn)率的計(jì)算公式為