中藥制劑分析之HPLC法

HPLC法HPLC法實驗條件的選擇HPLC法的定量分析方法特點適用范圍廣（80%有機化合物）分離性能好分析速度快靈敏度高色譜柱可反復(fù)使用流出組分容易收集HPLC實驗條件的選擇HPLC前處理色譜柱的選擇流動相的選擇洗脫方式的選擇檢測器的選擇HPLC前處理溶劑的純化流動相脫氣：除去流動相中的空氣方法：超聲波振蕩脫氣、惰性氣體鼓泡吹掃脫氣、抽真空、加熱脫氣、在線脫氣系統(tǒng)過濾 除去固體微粒；常用的濾頭：親水、親脂、兩用；0.45μm色譜純試劑重蒸水樣品的處理除去雜質(zhì)、純化樣品濃縮樣品或進行衍生化過濾/高速離心色譜柱的選擇根據(jù)被分離物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)、極性和溶解度用途：制備型、分析型色譜柱的分類硅膠柱動相。正相色譜法主要用于分離分析能溶于有機溶劑的極性及中等極性分子型物質(zhì)碳鏈。一般指C18、C8、苯基柱等，以甲醇、乙腈、水為流動相。反相色譜法適用于非極性及中等極性化合物目前用的最多的色譜柱是反相鍵合相色譜柱)S柱8（十八烷基鍵合相）鍵合相的優(yōu)點①使用過程不流失②化學(xué)性能穩(wěn)定，在PH2-8的溶液中不變質(zhì)③熱穩(wěn)定性好，一般在70℃以下穩(wěn)定④載樣量比硅膠約大一個數(shù)量級⑤適于作梯度洗脫流動相的選擇對流動相的基本要求①不與固定相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)②對樣品有適宜的溶解度k2～5最佳)1～10可用)k值太小，不利于分離；k值太大，可能使樣品在流動相中沉淀③必須與檢測器相適應(yīng)例如用紫外檢測器時避免末端吸收④粘度小容量因子y也稱為分配容量（ne、容量比（y，是在達到分配平衡后，組分在固定相中的量與流動相中的量之比。也稱為質(zhì)量分配系數(shù)。）流動相的選擇封尾的鍵合相還有一定的吸附作用。應(yīng)用最廣泛的色譜法反相鍵合相色譜流動相的選擇部分含水溶劑：水為基礎(chǔ)溶劑，再加入可與水互溶的有機極性調(diào)節(jié)劑（甲醇、乙腈、四氫呋喃）適用于分離中等極性、弱極性藥物常用甲醇－水、乙腈－水系統(tǒng)有機極性調(diào)節(jié)劑的性質(zhì)及其與水的比例對保留值和分離選擇性有影響緩沖溶液常用的緩沖液：三乙胺磷酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽溶液。適用于合物。PH不同、及所占比例不同會影響組分的保留值注意C18C185％，否則C18鏈的隨機卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定非水溶劑流動相為不含水系統(tǒng)。用于分離疏水性物質(zhì)。譜法。正相鍵合相色譜流動相的選擇流動相采用飽和烷烴（如正己烷）中加入極性較大的溶劑為極性調(diào)節(jié)劑（丙醚，通過調(diào)節(jié)極性調(diào)節(jié)劑的濃度來改變?nèi)軇姸?。反相離子對色譜流動相的選擇是極性較強的水系統(tǒng)混合溶劑0.003-0.01mol/L的離子對試劑離子對試劑的性質(zhì)、濃度、流動相的PH例都會影響組分的保留值和分離效果洗脫方式的選擇等度洗脫在一個分析周期內(nèi)流動相的組成保持恒定適合于組分?jǐn)?shù)目較少、性質(zhì)差別不大的樣品梯度洗脫在一個分析周期中，程序控制流動相的組成改變（H值等，使每個組分都在適宜的條件下獲得分離。適合于組分?jǐn)?shù)目較多、組分間k值相差較大（10-100倍）的復(fù)雜混合物梯度洗脫的特點優(yōu)點出，提高檢測靈敏度缺點常常會引起基線漂移，重現(xiàn)性較等度洗脫差梯度洗脫需注意內(nèi)容要注意溶劑的互溶性，不相混容的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相所用的溶劑純度要求更高，以保證好的重現(xiàn)性混合溶劑的粘度常隨組成而變化每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓10-30倍柱容積的初始流動相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動相達到完全平衡檢測器的選擇紫外檢測器（ultravioletdetector;UV)熒光檢測器（fluorophtometricdetector;FD)蒸發(fā)光散射檢測器（evaporativelightscatteringdetectorELSD)電化學(xué)檢測器（electrochemicaldetector；ECD)示差折光檢測器（differentialrefractiveindex6.化學(xué)發(fā)光檢測器（chemiluminescencedetector;CLD)7.質(zhì)譜檢測器(massspectrometrydetector;MSD)紫外檢測器（最普遍）優(yōu)點10-7～10-12g不破壞樣品，可用于制備對溫度及流動相波動不敏感，可用于梯度洗脫缺點只能檢測具有紫外吸收或衍生物具有紫外吸收的 物質(zhì)流動相的截止波長必須小于檢測波長1cmA＝1時的波長稱為截至波長水甲醇；乙腈：210nm;種類⑴可變波長紫外檢測器（UVD）配制最多⑵光電二極管陣列檢測器（photodiodearraydetectorPDAD光電二極管陣列檢測器特點可以快速掃描被測組分的的紫外可見吸收光譜。可以同時獲得樣品的色譜圖及每個組分的吸收光譜。特殊功能a、色譜峰的準(zhǔn)確定性 、峰純度檢、多通道檢測 、峰抑制e、寬譜帶檢測 、選擇最佳波長a、色譜峰的準(zhǔn)確定性先取得該峰的光譜圖,再與標(biāo)準(zhǔn)樣品的光譜圖進行比較,若兩個光譜完全重合,說明是同一種物質(zhì);若不重合,說明是不同種物質(zhì)。b、峰純度檢驗在色譜分析中,吸收比確定峰的純度收比的方法,又可使用比較光譜的方法。在峰的前沿、后沿和最大值處各取一點,,若三個光譜圖完全重合,說明是純峰(只含一種物質(zhì)若不完全重合,說明峰中含有雜質(zhì)。(對于任何在紫外-可見光區(qū)有吸收的純物質(zhì)在兩個選定波長下的吸收比為一常數(shù)，且與濃度無關(guān))d、峰抑制如果兩種化合物沒有完全分離,但它們的光譜圖有很大差別,合適的測量波長、參考波長和帶寬,使一種化合物被完全抑制熒光檢測器1.優(yōu)點靈敏度極高，比紫外檢測器高一個數(shù)量級良好的選擇性線性范圍較寬受外界條件影響較小只要選作流動相的溶劑不發(fā)熒光，熒光檢測器就能用于梯度洗脫高靈敏度和高選擇性，適于體內(nèi)藥物分析2.缺點只適于檢測能產(chǎn)生熒光或衍生物能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。應(yīng)用不如紫外檢測器廣流動相不能含有熒光物質(zhì)或使熒光熄滅的物質(zhì)應(yīng)用：氨基酸、多環(huán)芳烴、甾體化合物、酶蒸發(fā)光散射檢測器色譜柱后流出液（流動相+組分）先引入已通氣體（常用高純氮或空氣）的霧化器，流出物與通入的氣體形成均勻的微小液滴，經(jīng)過蒸發(fā)器（漂移管）樣品組分在蒸發(fā)器內(nèi)形成氣溶膠進入檢測室，用光電二級管檢測散射光強度，從而獲得組分的濃度信號。散射光強度的對數(shù)與組分質(zhì)量的對數(shù)成線性關(guān)系。優(yōu)點通用型檢測器。對各種物質(zhì)幾乎都有響應(yīng)靈敏度比示差折光檢測器高流動相系統(tǒng)溫度變化影響不敏感可進行梯度洗脫沒有流動相的紫外吸收干擾缺點分析范圍受樣品組分和流動相揮發(fā)性的限制是揮發(fā)性度應(yīng)盡可能低不能用含緩沖鹽的流動相緩沖溶液乙酸、三氟乙酸等是一種破壞型檢測器比紫外檢測器靈敏度低在中藥分析中的應(yīng)用收。紫外檢測器難于檢測。ELSD在某種程度彌補了這方面的不足用于糖類、氨基酸、甾體等化合物黃芪：黃芪甲苷，200.8nm末端紫外吸收電化學(xué)檢測器極譜檢測器庫侖檢測器 伏安檢測器 能氧化、還原的物安培檢測器檢測限達10-12g/ml，痕量組分分析示差折光檢測器特點：通用型檢測器對多數(shù)物質(zhì)的靈敏度低（約5g，不能用于痕量分析適合于糖類的檢測（10-8g/ml）受環(huán)境溫度、流動相組成等波動的影響大，不適合梯度洗脫化學(xué)發(fā)光檢測器高選擇性、高靈敏度的新型檢測器是分析微量脂質(zhì)、核酸、生物胺的最佳選擇質(zhì)譜檢測器HPLC-MS能提供的質(zhì)譜信息準(zhǔn)確的化合物分子量信息未知化合物碎片結(jié)構(gòu)信息一套完整的圖譜和多種掃描方式充分提供定性、定量和峰純度信息可用于無共價鍵、無功能團的化合物HPLC一、定量方法二、方法學(xué)建立（一）專屬性（二）線性關(guān)系考察（三）精密度試驗（四）準(zhǔn)確度試驗（五）穩(wěn)定性試驗（六）檢測靈敏度及檢測限的測定HPLC定量分析方法所包含的內(nèi)容？HPLC分析方法的步驟HPLC-ODSberberine①流動相中加