浙大考研生物化學(xué)課件基因工程

實(shí)驗(yàn)要求上課時(shí)間與紀(jì)律:8:40-16:40實(shí)驗(yàn)室內(nèi)禁止飲食、勿高聲談話、隨意走動(dòng)課前預(yù)習(xí)、課中認(rèn)真操作、課后的實(shí)驗(yàn)報(bào)告妥善保管好每組的實(shí)驗(yàn)器具。實(shí)驗(yàn)操作要求人人動(dòng)手。值日制度每一組實(shí)驗(yàn)器具微量移液器（lmk200微升、20微升）槍盒（三類）裝有小離心管的飯盒、鐐子離心管架冰盒浮漂旋渦振蕩器使用對(duì)應(yīng)的吸頭（槍頭）、確認(rèn)樣品的加入。公用儀器離心機(jī)旋渦振蕩器恒溫水浴培養(yǎng)箱冰箱電泳裝置低溫高速離心機(jī)水浴鍋Gaiam微波爐搖床Gaiam微波爐搖床1

紫外透射儀PC%超凈臺(tái)超凈臺(tái)《基因工程實(shí)驗(yàn)》課程建設(shè).編寫一本實(shí)用性較強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)講義。.建立一個(gè)切實(shí)可行的基因克隆的實(shí)驗(yàn)體系。.精心制作了PPT實(shí)驗(yàn)教學(xué)多媒體。1、講義內(nèi)容基因文庫(kù)的構(gòu)建靶基因的獲得載體質(zhì)粒的制備擴(kuò)增質(zhì)粒的構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與誘導(dǎo)表達(dá)工程菌的培養(yǎng)與目標(biāo)產(chǎn)物分離2、實(shí)驗(yàn)體系細(xì)菌染マ體的提取獲取目的基因(引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增)

構(gòu)建擴(kuò)增質(zhì)粒(鹹切!連接、轉(zhuǎn)化、篩選)

構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒(爾切、3接、轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定)目的基因的誘導(dǎo)表達(dá),基因產(chǎn)物分離、純化以幾丁成的的基因克隆為主線的連續(xù)系列實(shí)驗(yàn),毎ー個(gè)實(shí)驗(yàn)緊密銜接.基因工程(Geneticengineering)綜合采用了生物化學(xué)、遺傳學(xué)和微生物學(xué)等的現(xiàn)代技術(shù),在體外試管內(nèi)對(duì)大分子DNA進(jìn)行剪切加工,再與不同親本DNA分子重新組合(recombination),并把它引入受體細(xì)胞中去,通過復(fù)制(replication)、轉(zhuǎn)錄(transcription)、翻譯(translation)以及表達(dá)(expression),使生物獲得新的遺傳性狀。3、實(shí)驗(yàn)教學(xué)多媒體?在丁鳴老師、邵愛萍老師、周紅軍老師等共同協(xié)作下,跟蹤拍攝了實(shí)驗(yàn)全過程,精心制作完成了《基因工程實(shí)驗(yàn)》多媒體,為老師的上課以及學(xué)生對(duì)課程的理解提供了方便。?在此對(duì)給予我們大力支持的各位老師表示深深的謝意!實(shí)驗(yàn)計(jì)劃表培養(yǎng)マ角實(shí)驗(yàn)說イ 培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子:細(xì)菌染色體DNA提取凝膠電泳確認(rèn) pBSKST)H5a pET28c(+>DH5a核酸含最與純度測(cè)定 pBSKS(hi.VDII5a第二日——レ4 i PCR擴(kuò)增反應(yīng) 質(zhì)粒提取pBSKS、質(zhì)粒梶取:pET28c(十)凝膠電泳確認(rèn) 質(zhì)粒的電泳 及pBSKS*ChiAPCR產(chǎn)物的提純質(zhì)粒電電泳iECRだ物與pBSKS的幽切過夜 pBSKS-ChiA及pET28c(+啲歯切pBSKヌー中,泳 pl打:!':c.6電泳第四日 k i PCR產(chǎn)物電泳、割膠 pBSKSQiiA電泳、割膠PGR?也及pBSKS的切純化 cluAftf切及pET28c的切純化?PCR與pBSKS的連接 ChiA與pET28a+)的連接第五日ーDH10B與BL2】培第五日ー感受態(tài)細(xì)胞的制備倒平板(LB，Amp,LB/Kan)轉(zhuǎn)化(DH10B)涂平板(LB/Amp)轉(zhuǎn)化(DH10B)涂平板(LB/Amp)培養(yǎng)涂平板(LB/Kaii)培養(yǎng)...-I^TG+X-gal挑選菌落(抗生物抗性、藍(lán)白篩選)CLB/Kai)SouthernbloUuig(電泳、凝膠處埋轉(zhuǎn)膜過夜)條色體DNA挑選菌落(抗生物抗性、藍(lán)白篩選)CLB/Kai)SouthernbloUuig(電泳、凝膠處埋轉(zhuǎn)膜過夜)菌株的培養(yǎng)(LBzAmp)ssj-p I j 梶取質(zhì)粒(重組ス部分樣品保留提取質(zhì)粒的電泳質(zhì)粒囲切及電泳確認(rèn)重組子▼際的タ烘，作理F■pBSKSC'hiApETChiApETChiA/BI/H培養(yǎng)第八日 ー丄 Z\fcj T 誘導(dǎo)寰達(dá)探針標(biāo)記電泳樣品的制各 雜交酸酸鉉沉淀第九日 | 制膠(SDS) 洗膜、顯色SD&PAGE電泳、奧色、脫色第十日一總結(jié)、實(shí)驗(yàn)報(bào)告上交、考試預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果1）染色體DNA提取PCR產(chǎn)物3）質(zhì)粒提取4）質(zhì)粒的繭切5）割膠、提純6）感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)化（效率）7）藍(lán)白斑篩選8）擴(kuò)增、表達(dá)質(zhì)粒提取及駒切情況9）southernblotting10）基因的表達(dá)實(shí)驗(yàn)考核?平時(shí)的實(shí)驗(yàn)操作40分?公共實(shí)驗(yàn)參與10分?實(shí)驗(yàn)結(jié)果10分?實(shí)驗(yàn)報(bào)告?25分?考試15分1、基因組DNA的制備?本實(shí)驗(yàn)系列多媒體是在丁鳴老師、邵愛萍

老師、周紅軍老師的大力協(xié)作下完成的,

對(duì)他們的辛勤付出表示深深的謝意!實(shí)驗(yàn)?zāi)康?制備高質(zhì)量的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增的模板以及用做southernblotting分析。實(shí)驗(yàn)原理:（P15）提DNA:細(xì)胞裂解、RNA與蛋白質(zhì)的降解與去除、酒精沉淀DNA。防止DNA降解:機(jī)械、蛋白酶、化學(xué)（酸）實(shí)驗(yàn)操作|I,取1.5ml的培養(yǎng)液,12000rpm離心2分鐘。.沉淀添加560111的TE,充分懸浮。.加入30111的10%SDS和6可的lOmgml的蛋白酶K,混勻,于37c保溫1小時(shí)。.加入100111的5moi/LNaCl,充分混勻。.加80WCTAB/NaCl液,混勻,在65c條件下保溫10min〇.加入フ50n氯仿/異戊醇,混勻,12000rpm離心5min〇.取上清加入750貝苯酚/氯仿/異戊醇,混勻,室溫12000rpm離心5min<.取上清加入450g異丙酥,輕輕混勻直到DNA沉淀下來（室溫lOmin），4"C、8000rpm離心10min,棄取上清?.用1ml70%酒精洗滌,4C、12000rpm離心5min。.棄去上清液,沉淀在室溫條件下倒置干燥10/5min用100川的TE緩沖液溶解DNA。.加2u1的lOmgmIRNascA酶,37c水浴20min除去RNAo.取5ul樣品進(jìn)行電泳,樣品貯存在4ヒ冰箱中。2、DNA的電泳1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?（p41）學(xué)習(xí)與掌握進(jìn)行DNA電泳的方法,利用電泳檢測(cè)DNA純度、含量以及分子量,還可以分離不同大小DNA片段。2、實(shí)驗(yàn)原理?:電泳概念及種類影響電泳遷移的因素影響電泳遷移的主要因素DNA的大小DNA的構(gòu)象?瓊脂糖濃度?緩沖液

分而不同大小DNA片段的

合適瓊脂糖凝膠濃度瓊脂糖含(%)DNA片段的有效分離范圍(kb)0.35-600.51-300.61-200.708-121.00.5-101.20.4-61.50.2-42.00.1-3緩沖液TAE：乙酸鹽緩沖液TBE：硼酸鹽緩沖液TPE：磷酸鹽緩沖液實(shí)驗(yàn)操作■.稱取0.7克的agarose瓊脂糖,加入100ml0.5XTBE,在微波爐上加熱,使瓊脂糖熔化。.等凝膠溫度降至大約55c以下時(shí),加入5"的0.5mg/L漢化乙錠(EB)?.將移膠板放入膠室中,并將梳子垂直安插在移膠板上方,將凝膠倒入膠室中。.等凝膠完全凝固后(約30分鐘),將梳子輕輕拔出..將凝膠體放入加有0.5XTBE電泳緩沖液的電泳槽中,并且使電泳緩沖液髙出凝膠。

.取2m6X上樣緩沖液與5jdPCR產(chǎn)物混勻后,加到凝膠孔中,.加入如3Ji1的marker..蓋好電泳槽蓋子.選擇適當(dāng)?shù)碾娪倦妷?100V)以及電泳方向,開始電泳。.前面色素接近膠的先端,切斷電流,停止電泳,打開槽蓋?.取出樣品,在紫外燈下觀察,攝像.DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量 入DNA//7z>7dIIIMarker23.1kb2.3?0.562.0?0.563ヽPCR擴(kuò)增目的基因1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?（p39）利用PCR擴(kuò)增的方法獲取用于表達(dá)的目的基因以及Southern雜交的探針2、實(shí)驗(yàn)原理?:模板、引物、底物在體外進(jìn)行DNA的擴(kuò)增預(yù)變性(92-95エ2-PCR的般過程:變性(92-95工30,)(25-35)復(fù)性延伸總延伸變性(92-95工30,)(25-35)復(fù)性延伸總延伸?0-?0,C,30?)(72ヒ30劃，) (72?C,7m)經(jīng)過30次的循環(huán),擴(kuò)增的DNA片段可達(dá)100萬(wàn)倍以上.樣品DNA預(yù)變性雙鏈DNA解鏈,94*C5min引物與單鏈模板DNA結(jié)合

30-60X：,30秒ー1min雙鏈DNA解鏈雙鏈DNA解鏈94C、0.5-1min聚合酶合成新鏈65-75*0.2-5min延伸反應(yīng)完成?引物設(shè)計(jì)FP,RP(forwardprimer,reverseprimer)SP.AP(senseprimer,antisenseprimer)?循環(huán)參數(shù):①變性(denaturation)②退火(annealing)③延伸(extension)④循環(huán)次數(shù)(cycle)引物幾丁質(zhì)酶基因的兩端序列為:5'-CAGTTATGCGCAAATTTAATAAA AGCGCCGGCGTTCAATAATCG-3'上游引物:5,-GCGGATCCCAGTTATGCGCAAATT-3,(BamHI) 24baseGC=50%下游引物:5'-GCGAA(rCTTGATIATTGAACGCCGG-3'(，加dill) 25baseGC=50.5%

PCRが懵伍1■■■■2BBSss反應(yīng)體系PCRが懵伍1■■■■2BBSssddl1,0模版DNA上游引物(l()Nmol/L)下游引物(而mol/L)dNTPmixture(1Ommol/L)10倍X緩沖液+MgCl,Taq甑72.5pl5pl(100-200ng)*15pl72.5pl5pl(100-200ng)*15pl5pl3pl(各20nmol)10pl0.5pl(2.5U)實(shí)驗(yàn)操作dNTPmixture(1dNTPmixture(1Ommol/L)10倍 ICI2Taq的10|il0.5|il(2.5U)總體枳1001111.取ー個(gè)0.2mleppendorf管.ddH2O模板DNA上游引物(10|imol/L)下游引物(10|imol/L)添加以下各種成分反應(yīng)液72.5卩15ul(10<)-200ng)*15ul5|ilI3|il(各2Qnmol).稍作惠心.將反應(yīng)管放入PCR儀中..設(shè)定反應(yīng)程序: ■94c條件下使模板DNA預(yù)變反5min。變性 94c Imin退火 55c Itnin| 30cycles延伸 72c 2.5miノ最后在フ2c條件進(jìn)行延伸7-10min。c保溫4.取5|11反應(yīng)液用0.7%瓊脂融凝膠進(jìn)行電泳,鑒定PCR產(chǎn)物是否存在以及大小。4、PCR產(chǎn)物的純化實(shí)驗(yàn)操作(p43).電泳確認(rèn)后將PCR產(chǎn)物移至1.5ml新的cppcndorflf中。.加入200WTエ緩沖液,加入300m酚/氯仿/異戊醇,混勻,室溫,12000rpm離心5分鐘。?.取上層水液添加1/10體積(約30可)的3moi/L的NaAc(pH5.2)和2.5倍體積(約O.75mD的冰冷無水乙醇。.-20C冰箱中放置30min以上。.4cヽ12000rpm離心5min。.棄上清,添加1ml的冰冷70%乙醇。4C、12000rpm離心5min。.棄去上清,室溫干燥,30WTE液溶解沉淀。5、質(zhì)粒的提取1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?（p61） ■學(xué)習(xí)與掌握最常用的質(zhì)粒DNA的提取方法2、實(shí)驗(yàn)原理?:堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變形與復(fù)性的差異而達(dá)到分離的目的。

ImHIIT74“91“JIfcoO109l(DrillXho\Si/l/M/mllMalfi1106l(C/il)KimiIIIFcoRVfMRIP$tlSiriI命何HI$”1x”iNonF“l(fā)$"H83fxiStcl8KHlIpET28c(+)8KHlIT7promottrprwiar?6?348lモ錢「i Jx―z ヽAU：CKC*TCCCGCGJUATTMTACGKTCKT*TAGCCUArrGTCA?CUaTUCMnCCCCTCTAGJUATAlTTTTGnTUCTTTMuIuIcA,皿 IT.. J^tLy?.LTMIj-TATACCA!CCWACCAac7Tutc7rUTc7u7cAGCACCCCCCTttTCCCaWGGCAGCCA：AT；Q；-AC；A!UCTGGrC4KACCAa"?iCtyUfUrW.yiitMuH.tM.sx.tSefStrCiyLtvio^roAr^CtySerM.pietAiaSe/RttThrCtyCiwCiftfiin—&5??區(qū)5B!エし"I儡加］“T1ATCWrCGCttAfCCUarTCGAKTCCCTCCKAAttTT^GGCCKACTCtAaA：CACCACCACC?CACTGAU!CCCaTKr<iCUACCCCPCT?如E"*'*?"，華bp，GIMMGlwl?uA，y，9GlAJUeC.tClyArgrhrAr8i“rMrMrM，“，ot?uA/954rGiyCytCMMTCCCUrtCCAATTCUCCTCCCTCCKuanCCttCCGC.ACTCCAaiCCACCMCACCACCACTCAUrCttCCTCCTAMAAACCCC乂わ4(?)5”r $<ハ。IAREH?A101qlZIw，??"t*，*，*，メ府UteiXlfctUATTCUCCTCC6T(UCAACCTrGCGGCCaMTCGAaACCACCKCACCACCKT6AUTCCCCCTGCTAACAMGCcFp€T-2^(H??“udlSM,elIMr81"，加 メrw?-$?，S?rThrThrThrThrTl?rthrCiu|??“dMauThrtWe41181 T7MnalorUMCCOiCGACTrttCTCCTCCCKCGCTGAGCAATAKrAaAJAMCCCTTGCCaCTCTAAACGCSKTTGAUCGTTTTTTCT7Miwutorprw?r?6833M實(shí)驗(yàn)操作.取1.5ml培養(yǎng)液在4C、12000rpm離心2min,奔去上清液,收集菌體..加入loom的溶液I,使菌體充分懸浮,室溫條件下靜置5min。.加入200可新配置的溶液11.溫和上下顛倒2-3回,冰浴條件下靜置5min。.加入150川的溶液山,上下顛倒混勻數(shù)次,冰浴條件下瀕置5min。.4c條件下12000rpm離心lOmin。.取上清,加入等體積（400ul）的酚/氯仿/異戊醇,充分混勻,室溫條件下12000rpm離心5min。.吸取上層水相,加入1/10體積量（約40jd）3moLL的pH5.2NaAc,再加入2.5倍體積（約1ml）的預(yù)冷的無水?乙醇。8,放入ー20c冰箱中靜止30min?然后在4c條件下12000rpm離心15min。.棄去上清液,加入1ml預(yù)冷的70%乙醇,在4c條件下12000rpm離心5min,洗滌沉淀?.棄上清液,沉淀物自然干燥后,加入40WTE緩沖液溶解沉淀（pET質(zhì)粒用25TE溶解）。.加入2m的lOmg/ml的RNaseA繭,37c保溫20-30min..取5m的質(zhì)粒電泳?6、酶切反應(yīng)1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?（p70）將目的基因與我體DNA用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切甜進(jìn)行處理,用于DNA的體外重組。2、實(shí)驗(yàn)原理?:?限制性內(nèi)切酶:命名與寫法?緩沖液限制性內(nèi)切酶Hpai

5,Hpai

5,圓理］囚囚四3,

丁??畫斑忡，

CUTEcoRI5恒^)000??3'?0①囚回回5,HindW

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CUT3㈣國(guó)?(甑晦5,

CUTPsAEnzymeRttognitionSequence*1MicroorganitmAlulAG|C*TArthnobatterhuesBamHIGJGATbCBacillusamyMiqucfattmiHGCCNNNNN|NGGCBacillusglobtguHniA|GATCTBacillutglobtgnEcoRIGjAATTCEitheruhiataliRY13EcoRIIJCU《，GGfwhrruhiocoilR24S“RVGAeT^ATC上“*Edto J62IHG74HurllRGCGC|YHarmophtluiacgyptiuiflarlllGG|C*CHatmophtlutacgyptiuiHlndlllA,|AGCTTilafmaphiluitnftuenzae%HfallC|C*GGHacmaphtluiparainflumzacMsplCe|CGGMoraxtllaspeciesPulCTGCA,1GProvidrnclouuartllIMPvtdlCAGJUTGPrvicutvul^artsSallG^TCGACSlfvptomycciafbuiGToqlT，CGA?Thrrmuiaquaticu%XholQTCGAGXanthomanathokiccla*Thcrccojcnitionsequencei?abbrrvtatedm>thatonlyone'trend,rexiinf5*toJ*,togivenThecleavage?ite1?reprv?cnte<ibyanarrow(J)andthemodifiedbase,wherettteknown.“indicatedbyanastemk(A*toN*-methylad<nineandCai?%meihylcyto?ine)R.Y.andNrrpmentapunnenucleotide,apyrimidinenucleotide,andanynucleo<Mlc.respectivelyiScwarrRobert*.RJandMacclis.D..REBASE-therrsincitonenzymedatabax.http/Avwwneb?mVr*ba*rIー種限制除只能識(shí)別ー種特定的核甘酸序列,并在特定的切割點(diǎn)上將DNA分子切斷.目前已發(fā)現(xiàn)的限制前有200多種.

酶切反應(yīng)（甲）.在0.5mlcppcndorf管中加入下列成分,（定容40H1）A：A：PCR產(chǎn)物ddlkO2WPCR30ul(5jig)10X緩沖液4glHindIII2glBarnHI2mB:質(zhì)粒DNA：ddIl2O 2|ilpBSSK(0.5*g,曲30gl10X通用緩沖液4mHindIII(lOU/fil)2glBamHI(lOU/gl) 2山.混勻,少許離心一下。.在37ヒ條件下反應(yīng)24小時(shí)以上,或酶切過夜。.取5m醉切B進(jìn)行凝膠電泳,預(yù)檢.（乙）1.在eppendor階中加入下列成分（定容40卩1）は:pBSSKChiA：B:質(zhì)粒DNA：ddlLO2MlddHjO2|11質(zhì)粒（5四）30/1pET28c(+)(0.5/g/g30pl10X緩沖液4ulrI0X通用緩沖液4卩1HmdIII2MlHindIII(lOU/gl)2mBaniWI2卩1|BaniHI(lOU/gl)2gl.混勻,少許離心一下。.在37c條件下反應(yīng)2-4小時(shí)以上,或酌切過夜。.取5川駒切"進(jìn)行凝膠電泳,預(yù)檢。7、電泳、割膠、純化DNA1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?（p75） ■將所需要的DNA片段進(jìn)行回收,純化。2、實(shí)驗(yàn)原理:

MarkerPCR酶切MarkerpBSKSChiA酶切實(shí)驗(yàn)操作2.長(zhǎng)波長(zhǎng)uv照射下,判定DNA位置,用手術(shù)刀割下含有要回收DNA,放入1.5ml的離心管中?.按每lOOmg膠加400jdSolutionSN,65c水浴5min,中途混勻,直至膠完全融化。按每100mg膠,加SolutionBlOOge混勻。.將3s柱放入2ml收集管中,融化的膠溶液轉(zhuǎn)移到3s柱中,開蓋,室溫放置2min。室溫10000rpm離心Imin..取下3s柱,倒掉廢液,將3s柱放入同一收集管 ?中，加600111WashSolution室溫10000rpm痛心Imin〇.重復(fù)4.取出3s柱,倒掉收集管中的廢液,將3s柱放入同ー個(gè)收集管中,室溫10000rpm離心2分鐘。.將3s柱放入新春心管中,在柱的膜中央加30卩1預(yù)熱的TE,室溫放置2min.10000rpm離心Imin,離心管中液體為回收DNA片段。ー20c保存8、DNA片段的體外連接1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?（p78） ■將來自不同生物的DNA片段在體外進(jìn)行連接,以構(gòu)建新的重組DNA。2、實(shí)驗(yàn)原理:連接緩沖液的量實(shí)驗(yàn)操作（甲）.在離心管中加入以下樣品:TOC\o"1-5"\h\zPCR產(chǎn)物 6ulpBSSK酶切 2.10X連接緩沖液T4DNA連接酶 lul.混勻后,離心將液體全部甩到管底..16ヒ條件下保溫過夜。.-20*C備用（乙）1,在髙心管中加入以下樣品:TOC\o"1-5"\h\zChiA基因片段 3mpET28c（+）磨切 5m10X連接緩沖液 1貝T4DNA連接酶 lul混勻后,離心將液體全部甩到管底。16c條件下保溫過夜。-20ヒ備用9、重組DNA的轉(zhuǎn)化1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?(p81)CaCL制備感受態(tài)細(xì)胞,用于重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)2、實(shí)驗(yàn)原理:親緣關(guān)系、菌體的年齡、環(huán)境因子(CaCl2ヽcAMP)感受態(tài)細(xì)胞的制備.接種DH10B于LB培養(yǎng)基中37c振蕩培養(yǎng)過夜。.接100W培養(yǎng)液于5ml的LB液體培養(yǎng)基中,37c條件下振蕩培養(yǎng)2-2.5小時(shí)左右,OD600達(dá)0.4。.將1.5ml培養(yǎng)液移至cppcndorf管中、冰浴20min。.4で條件下,4000rpm離心5min,棄去上清液。.添加0.75ml預(yù)冷的CaC12溶液，用槍輕輕吹打..冰浴30分鐘后,4c條件下,4000rpm離心5min,棄去上清液。.細(xì)胞沉淀用100川預(yù)冷的CaC12溶液懸浮。.冰浴放置，答用。轉(zhuǎn)化取一管100貝的感受態(tài)細(xì)胞,加入質(zhì)粒與目的基因的連接產(chǎn)物5W,輕輕用槍吹打均勻,冰浴20min42C、保溫90秒鐘,迅速放入冰中,冰浴5min。添加1ml的LB培養(yǎng)基.37c振蕩培養(yǎng)1小時(shí).3000rpm離心5分鐘,棄去1ml上清,余下0.1ml用槍吹勻,吸至含有抗生素的LB培養(yǎng)基平板上,另添加20/120mgm1X-gal和40貝的100mmol/LIPTG,均勻涂布。37c倒置培養(yǎng)8-12小時(shí)。10、陽(yáng)性克隆的篩選1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?（p87）學(xué)習(xí)與掌握陽(yáng)性克隆的篩選方法,了解抗藥性篩選和a-互補(bǔ)蹄選的原理。學(xué)習(xí)電泳法篩選鑒定重組質(zhì)粒的方法。2、實(shí)驗(yàn)原理?:抗生素蘭白篩選 提偵粒高切電泳核酸雜交或PCRGE轉(zhuǎn)化子（不含質(zhì)粒）非重組子（含空載我體）c載體受損重組子〈 期望重組子（含目的基因）重組子ー非期望重組子a互補(bǔ)篩選法（顯色模型篩選法）pBSSKpUC(/acZ,)DH10BJM109(/acZMl5)a互補(bǔ)篩選法（顯色模型篩選法）pBSSKpUC(/acZ,)DH10BJM109(/acZMl5)b?ct?n?lcell(JMIO9)ノ\7I厶?レ+人4(丫J■—tt.藍(lán)白篩選實(shí)驗(yàn)操作.選取白色單向,接入5ml含抗生素的LB培養(yǎng)基中,37c振蕩培養(yǎng)過夜。.取1.5菌液抽提質(zhì)粒,部分菌液4c保存.質(zhì)粒抽提后,最后溶解于40jil的TE中。4,質(zhì)粒電泳構(gòu)建的擴(kuò)增質(zhì)粒（甲）、立ヨ曾、立ヨ曾3L*、質(zhì)是擴(kuò)26匕此勺j一Lヌ可標(biāo)質(zhì)抽提質(zhì)粒的酶切鑒定5.對(duì)初步確定有外源基因進(jìn)入的質(zhì)粒用

限制性內(nèi)切酶進(jìn)行切割、鑒定。TOC\o"1-5"\h\z重組質(zhì)粒DNA 10glddH2O 6H10X通用緩沖液 2MBamHI 0.5gl〃加dlH 0,5^16.37ヒ保溫0.5-1小時(shí)7I電泳

擴(kuò)增質(zhì)粒的酶切（甲）Marker1Marker1、2、5、6是需要的擴(kuò)增質(zhì)粒M123 56PCRpBSKS2#擴(kuò)增質(zhì)粒的確定（甲）——PCR法

構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒（乙）1#2#3#4#MpET28c(+)表達(dá)質(zhì)粒的胸切（乙）M：DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量1#表達(dá)質(zhì)粒/菌切2#表達(dá)質(zhì)粒/酶切酶切pET28c（+）酶切PCR產(chǎn)物discofobsortentp?perraOioectivtlylabeledDMAproo?raOioectivtlylabeledDMAproo?INCUBATEWITHPROK

ANOWASH

coloniescontaining

plttmidof

mterettEXPOSSPAP￡RTOヽPHOTOGRAPHICFILHPeindiiiivdthcoloniesofbacteriacontainingrecombinantplasmidsOoundtoPEELPAPERFPEELPAPERF師MDISHTOWOWCEREPIICAOFCaONIESIYS￡BACTERIAANDD€NAT麻MAWITHALKALI-r

positionofdesired

coloniesdetected與

autondiogrophy、外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?(pl()8)學(xué)習(xí)和掌握外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)方法,為SDS分析做準(zhǔn)備。2、實(shí)驗(yàn)原理:實(shí)驗(yàn)操作.將含有pET28c重組子的BL21菌落接種于2ml含卡那霉素(SORg/ml)的LB培養(yǎng)基中,37C振蕩培養(yǎng)過夜。.分別取150可培養(yǎng)液于5ml含卡那毒素(SOpgml)的LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)2小時(shí)左右,至OD600達(dá)0.5左右。.取出1.0ml樣品作為IPTG誘導(dǎo)前的樣品。.其余樣品中添加12m的lOOm'lIPTG繼續(xù)培養(yǎng)。.分別在1、2,3,4、5小時(shí)后取出1.0ml樣品作為IPTG誘導(dǎo)后的樣品。.IPTG誘導(dǎo)前與誘導(dǎo)后的樣品12000rpm離心2min。.回收菌體沉淀..菌體沉淀樣品中加入30WpH7.4的PBS緩沖液和10皿的4XSDSloadingbuffer,在旋渦混合器上劇烈震蕩Imin,使歯體完全溶菌。.將樣品在100C沸水浴中保溫5min,立即放入冰浴中冷卻..12000rpm離心Imin,回收上清1L樣品直接進(jìn)行SDS分析或在ー20c冰箱中保藏。12、SDS、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?（pill）利用SDS電泳檢測(cè)表達(dá)蛋白,確定蛋白質(zhì)的分子量。并掌握其原理與方法.2、實(shí)驗(yàn)原理:（一）電泳膠的準(zhǔn)備與電泳制膠板的安裝,要求密封,以免膠液泄漏.配置適量（如7.5ml）的10%濃度的分離股TOC\o"1-5"\h\zH2O 4.0ml30%膠母液 2.5ml分離般緩沖液(pl?8)09ml10%SDS 75pl10%APS 60PlTEMED 5pl3,將分離膠加入制膠槽中,注意應(yīng)髓著邊緣緩慢加入,千萬(wàn)別進(jìn)氣泡?凝膠液加至約距前玻璃板頂端15cm或距梳子齒約0.5cm處.4,在分恵膠溶液上覆蓋ー層篁蒸水封膠,使凝酸表面變得平整,靜放大約30min便凝膠聚合.除去上面的水層,用紙巾吸盡殘留的液體?配置5%濃縮膠30%膠毋液 0.5ml濃縮膠緩沖液(pH6.7) 0.37mlTOC\o"1-5"\h\zHK) 21ml10%SDS 25/1IO%APS 253TEMED 5pl迅速將配置好的濃爆膠添加到分離膠上面,并將儘子插入凝膠內(nèi),血至梳子齒的底部與前玻璃板的頂端平齊（小心避免混入氣泡）.凝膠聚合后輕輕拔出推子.在上下電泳槽中添加I/電極緩沖液.在電泳槽的泳道中分別添加標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)與樣品.接通電源,起始電流20mA,起始電壓80V.電泳大致需要23小時(shí)?恃漫酚范前沿到達(dá)電泳槽底部時(shí),切斷電源,從電極上拔掉電被插頭,取出玻璃板?（二）染色與脫色.電泳先后,帶上手套,小心從制膠板上將栽膠剝下,棄去濃縮膠.在右下角切去小片作為定位標(biāo)記..用清水洗膠,將分離股放入集色液中緩慢搖動(dòng),染色2CU30分鐘..取出用水漂洗后，將膠放入脫色液中進(jìn)行擴(kuò)散脫色,11到背景藻色褪淡,見到條帶,大約換35次脫色液即可?.確定外源基因表達(dá)的蛋白是在上清液中,還是在菌體胞內(nèi)..電泳遷移率的計(jì)算:.計(jì)芽樣品蛋白質(zhì)的分子量.13、Southernblotting實(shí)驗(yàn)?zāi)康?p95).通過Southern雜交,檢測(cè)重組DNA分子中插入的外源DNA片段是否是原供體菌株中的一個(gè)基因片段,同時(shí)可以檢測(cè)基因片段在基因組的不同酶切條件下的分子量大小。.學(xué)習(xí)與掌握Southern印跡雜交技術(shù)。實(shí)驗(yàn)原理1.DNAsamplescutwithrestrictionenzymesareloadedonagarosegelforelectrophocesislane1：RadioactivesizemarkersLane2:DNAcutwithrestrictionenzymeAUne3:DNAwithrestrictionenzymeB,GelelectrophoresisDNAisdenaturedGelisplacedonspongewickPapertowelsDNA*b?ndingfilter3.DNA-bindingfilter,papertowelsandweightareplacedongd;buHerpassesupwardthroughspongebycapillaryactiontransferringDNAfragmentstofilter1.DNAsamplescutwithrestrictionenzymesareloadedonagarosegelforelectrophocesislane1：RadioactivesizemarkersLane2:DNAcutwithrestrictionenzymeAUne3:DNAwithrestrictionenzymeB,GelelectrophoresisDNAisdenaturedGelisplacedonspongewickPapertowelsDNA*b?ndingfilter3.DNA-bindingfilter,papertowelsandweightareplacedongd;buHerpassesupwardthroughspongebycapillaryactiontransferringDNAfragmentstofilter2.DNAisseparatedby