中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)及及學(xué)院

中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子生物學(xué)研究中心教案授課科目:醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)

授課內(nèi)容:基因治療授課對象：臨床醫(yī)學(xué)七年制、八年制授課時(shí)數(shù)：4學(xué)時(shí)

授課教師：

授課地點(diǎn)：湘雅醫(yī)學(xué)院新教學(xué)區(qū)授課時(shí)間：授課教材：醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)（21世紀(jì)高等院校教材），胡維新主編，北京：科學(xué)出版社，2007年2月，第一版；醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)（衛(wèi)生部8年制規(guī)劃教材），馮作化主編，北京：人民衛(wèi)生出版社，2005，第一版一．目的要求掌握：基因治療的概念、基本策略、常用載體；治療基因的受控表達(dá)原理與方法。熟悉：基因轉(zhuǎn)移的基本技術(shù)；基因干預(yù)的基本策略；基因治療的應(yīng)用研究。了解：基因轉(zhuǎn)移的靶細(xì)胞;基因治療的前景與問題；人類生殖細(xì)胞基因治療研究的倫理學(xué)問題。二．講授重點(diǎn)：基因治療的策略：如基因置換、基因添加、基因干預(yù)、自殺基因治療、免疫基因治療等；體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的方法。三．講授難點(diǎn)：不同類型的疾病應(yīng)采用不同的治療策略；基因干預(yù)方法與原理；治療基因的受控表達(dá)原理與方法。四、教學(xué)方法：多媒體教學(xué)五、教具：多媒體課件六、講授內(nèi)容：何謂HumanGeneTherapy基因治療是現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)與醫(yī)學(xué)科學(xué)交叉滲透而形成的一個(gè)全新治療領(lǐng)域。DNA重組、基因轉(zhuǎn)移、基因克隆和表達(dá)等技術(shù)的迅猛發(fā)展，為基因治療的飛速發(fā)展奠定了基礎(chǔ)?；蛑委煼诸愺w細(xì)胞(somaticcell)基因治療只限于某一體細(xì)胞的基因的改變只限于某個(gè)體的當(dāng)代生殖細(xì)胞(germline)基因治療對缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正當(dāng)代及子代第一節(jié)基因治療的策略1．基因治療的概念定義：將目的基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)，成為宿主細(xì)胞遺傳物質(zhì)的一部分，目的基因表達(dá)產(chǎn)物對疾病起治療作用。不同的基因治療策略是以不同的形式利用基因產(chǎn)生治療效應(yīng)，因而適用于不同疾病的治療。2．基因置換（genereplacement）定義：指將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞，通過定位重組，以導(dǎo)入的正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因。又稱基因矯正（genecorrection）。目的：糾正缺陷基因，將缺陷基因的異常序列進(jìn)行矯正，對缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，不涉及基因組的其他任何改變。基因置換的必要條件：對導(dǎo)入的基因及其產(chǎn)物有詳盡的了解；外來基因能有效地導(dǎo)入靶細(xì)胞；導(dǎo)入基因能在靶細(xì)胞中長期穩(wěn)定存在；導(dǎo)入基因能有適度水平的表達(dá)；基因?qū)氲姆椒八幂d體對宿主細(xì)胞安全無害?；蛲粗亟M技術(shù)（homologousrecombination)又稱為基因打靶(genetargeting），其實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合的條件:轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體具有與染色體上的DNA相同的序列。這樣，帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點(diǎn)進(jìn)行部分基因序列的交換。要實(shí)現(xiàn)基因置換，需要采用同源重組使相應(yīng)的正?；蚨ㄏ?qū)胧荏w細(xì)胞的基因缺陷部位。定向?qū)氲陌l(fā)生率約1/100萬，采用胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)的方法，這種同源重組的檢出率最高可達(dá)1/10?？紤]到正常體細(xì)胞的生命周期，以及克隆篩選等實(shí)驗(yàn)給細(xì)胞生長帶來的一系列問題尚未解決．因此用同源重組修復(fù)異?；虻姆椒ㄟM(jìn)行遺傳病的基因治療只能作為遠(yuǎn)期目標(biāo)。3．基因添加基因添加或稱基因增補(bǔ)（geneaugmentation）:通過導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。類型:針對特定的缺陷基因?qū)肫湎鄳?yīng)的正常基因，使導(dǎo)入的正?；蛘系交蚪M中，而細(xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過導(dǎo)入正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的功能；向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。基因添加與基因置換一樣，也必須具備上面提到的5個(gè)必要條件。4．基因干預(yù)基因干預(yù)（geneinterference）:采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過破壞某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)而使之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。此類基因治療的靶基因往往是過度表達(dá)的癌基因或者是病毒的基因。較常用的方法是采用反義核酸、核酶或者干擾RNA技術(shù)等抑制基因的表達(dá)。5．自殺基因治療惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。原理:將“自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”效應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。圖示：自殺基因的作用機(jī)制（約2分鐘）（一）自殺基因系統(tǒng)TK/GCV：單純皰疹病毒（herpssimplexvirus,HSV）Ⅰ型胸苷激酶（thymidinekinase,tk）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無毒的核苷類似物丙氧鳥苷（ganciclovir,GCV）轉(zhuǎn)變成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，或作為DNA鏈延伸的終止子阻止DNA合成，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。CD/5-FC：大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosinedeaminase,CD）基因，在細(xì)胞內(nèi)將無毒性5-氟胞嘧啶（5-FC）轉(zhuǎn)變成毒性產(chǎn)物5-氟尿嘧啶（5-FU）。（二）旁觀者效應(yīng)概念:“自殺基因”治療不僅使轉(zhuǎn)導(dǎo)了“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰的未轉(zhuǎn)導(dǎo)“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞也被殺死。遠(yuǎn)距離旁觀者效應(yīng)：近年來又有人觀察到該效應(yīng)也影響到遠(yuǎn)處的腫瘤細(xì)胞，使其消除或停止生長，即遠(yuǎn)距離旁觀者效應(yīng)。腫瘤細(xì)胞的消除有賴于旁觀者效應(yīng)，即轉(zhuǎn)導(dǎo)自殺基因可以影響沒有被轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞。旁觀者效應(yīng)明顯地增強(qiáng)了自殺基因?qū)δ[瘤的殺傷作用，在相當(dāng)程度上彌補(bǔ)了基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低的問題。旁觀者效應(yīng)的機(jī)制細(xì)胞縫隙連接；細(xì)胞凋亡與吞噬；免疫炎癥反應(yīng)；抗腫瘤血管生成等。6．基因免疫治療通過將抗癌免疫增強(qiáng)細(xì)胞因子或MHC基因?qū)肽[瘤組織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應(yīng)。（1）基因修飾腫瘤細(xì)胞“疫苗”療法。（2）基因修飾TIL的過繼免疫療法。（3）免疫增強(qiáng)基因療法。（4）原位修飾腫瘤免疫原性的基因療法。第二節(jié)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)圖示基因治療的兩種途徑。exvivo(經(jīng)活體)，即將靶細(xì)胞在體外導(dǎo)入外源基因及體外增殖、篩選、藥物處理或其他操作后，再輸回患者體內(nèi)。invivo(活體內(nèi))，即將無復(fù)制能力的、含外源基因的重組病毒直接應(yīng)用于患者體內(nèi)，此外還包括將脂質(zhì)體包埋或裸露DNA直接注射到試驗(yàn)者體內(nèi)等方法。1．病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（生物學(xué)方法）病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有72%的臨床實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和71%的病例使用了病毒載體，而其中用得最多的是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(retrovirusvector,RV)。（一）逆轉(zhuǎn)錄病毒載體逆轉(zhuǎn)錄病毒是一種RNA病毒，其感染顆粒是由包裝蛋白包裝的兩條RNA鏈組成，兩條RNA鏈5ˊ端經(jīng)氫鍵連接。包膜上的突起由外膜糖蛋白和穿膜蛋白組成。病毒包膜上有型、亞屬特異性抗原決定簇，由外膜蛋白基因(env)編碼；在病毒核心內(nèi)有屬特異性抗原，由屬核心蛋白基因(gag)編碼。當(dāng)逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，即由逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄成環(huán)狀雙鏈DNA分子，并隨機(jī)整合至宿主細(xì)胞基因組，稱為前病毒(provirus)，然后再轉(zhuǎn)錄成RNA，并合成包裝蛋白，將轉(zhuǎn)錄的RNA基因組包裝后分泌至細(xì)胞外，完成一個(gè)完全的生活周期。圖示逆轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)及生活周期逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：（1）兩端各有一長末端重復(fù)序列LTR；（2）LTR由U3、R和U5三部分組成：在U3內(nèi)有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子；U3和U5兩端分別有病毒整合序列(IS)；在R內(nèi)還有poly(A)加尾信號(hào)。（3）病毒有三個(gè)結(jié)構(gòu)基因：gag基因，編碼核心蛋白和屬特異性抗原；pol基因，編碼逆轉(zhuǎn)錄酶；env基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)；（4）5ˊ端LTR下游有一段病毒包裝所必需的序列ψ及剪接供體位點(diǎn)(SD)和剪接受體位點(diǎn)(SA)；（5）含有負(fù)鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(diǎn)(PBS)和正鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(diǎn)(PPT)。圖示逆轉(zhuǎn)錄病毒感染及復(fù)制過程。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組，它由兩部分組成：(1)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體：保留病毒顆粒的包裝信號(hào)ψ，而缺失病毒顆粒包裝蛋白基因；它可以克隆并表達(dá)外源的治療基因，但不能自我包裝成有增殖能力的病毒顆粒。另一部分為包裝細(xì)胞，它由另一種缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒（即帶有全套病毒顆粒包裝蛋白基因，卻缺失包裝信號(hào)ψ的逆轉(zhuǎn)錄病毒）感染構(gòu)建而成，該細(xì)胞株能合成包裝蛋白，用于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝，但本身卻不能包裝成輔助病毒顆粒。將上述兩部分結(jié)合使用，即可產(chǎn)生攜帶治療基因，而只有一次感染能力的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒。圖示逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)的組成。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn)：①逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜上由env編碼的糖蛋白能夠被許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的特異性受體所識(shí)別，從而使逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入靶細(xì)胞。②逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、env和pol的缺失不影響其他部分的活性。③前病毒可以高效整合至靶細(xì)胞基因組中，有利于外源基因在靶細(xì)胞中的永久表達(dá)。④包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）以芽生的方式分泌至輔助細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點(diǎn)：隨機(jī)整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險(xiǎn)；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納7kb以下的外源基因。（二）腺病毒(adenovirus，AV)載體腺病毒是一種大分子(36kb)雙鏈無包膜DNA病毒。它通過受體介導(dǎo)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，后被腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。腺病毒是人類呼吸道感染的病原體，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)，其宿主細(xì)胞范圍廣泛，可感染分裂和非分裂終末分化細(xì)胞如神經(jīng)元等。圖示腺病毒結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及感染過程。腺病毒的優(yōu)點(diǎn)：基因?qū)胄矢?，對人類安全；宿主范圍廣；基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞分裂無關(guān)；重組腺病毒可通過口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；腺病毒載體容量較大，可插入kb外源基因腺病毒載體缺點(diǎn)：1）不能整合到靶細(xì)胞的基因組DNA中。分裂增殖快的細(xì)胞，導(dǎo)入的重組病毒載體，隨分裂而丟失的機(jī)會(huì)增多，表達(dá)時(shí)間相對較短。2）宿主的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腺病毒載體表達(dá)短暫的關(guān)鍵性因素之一。3）有兩個(gè)環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒：腺病毒產(chǎn)生過程中與293輔助細(xì)胞內(nèi)E1區(qū)序列發(fā)生同源重組；腺病毒載體與被治療的患者體內(nèi)已感染的野生型腺病毒，甚至乳頭瘤病毒、巨細(xì)胞病毒發(fā)生重組。4）靶向性差。（三）腺病毒相關(guān)病毒載體腺病毒相關(guān)病毒(adenovirusassociatedvirus，AAV)是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒，是目前所發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物病毒中最小的病毒，其基因組DNA小于5kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨(dú)立復(fù)制，只有在輔助病毒如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒存在的條件下才能進(jìn)行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。圖示AAV的結(jié)構(gòu)。AAV生命周期的特點(diǎn)：●單獨(dú)不能進(jìn)行復(fù)制；以潛伏感染為主；●病毒基因組與細(xì)胞共存；●只要宿主細(xì)胞正常，AAV基因表達(dá)就處于抑制而維持潛伏狀態(tài)；●若細(xì)胞受刺激，表達(dá)應(yīng)激基因，AAV基因表達(dá)從而使AAV病毒復(fù)制；●產(chǎn)生子代病毒并釋放，又感染新的細(xì)胞，建立新的潛伏狀態(tài)。AAV載體是目前正在研究的一類新型安全載體，它對人類無致病性。其中一種B19病毒可以高效定位整合至人19號(hào)染色體的特定區(qū)域中，并能較穩(wěn)定地存在。這種靶向整合可以避免隨機(jī)整合可能帶來的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險(xiǎn)性，而且外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，并可受到周圍基因的調(diào)控，兼具逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體兩者的優(yōu)點(diǎn)。AAV載體的缺陷：AAV載體容量小，目前最多只能容納5kb外源DNA片段；感染效率比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體低。在40%-80%的成人中存在過感染，可能會(huì)引起免疫排斥。（四）單純性皰疹病毒(herpessimplexvirus，HSV)載體HSV具有許多天然特征，適合作為神經(jīng)組織的基因轉(zhuǎn)移載體：在不同的神經(jīng)細(xì)胞中可建立長期潛伏狀態(tài)；在病毒進(jìn)入細(xì)胞和建立潛伏狀態(tài)時(shí)，不需要宿主細(xì)胞的分裂；在神經(jīng)元細(xì)胞核中，病毒基因可持續(xù)存在，不整合至宿主細(xì)胞的染色體中，避免了因整合而使宿主細(xì)胞基因失活或激活原癌基因的潛在危險(xiǎn)。HSV載體的優(yōu)點(diǎn)：1）HSV中有許多基因，切除后可明顯阻礙其在體內(nèi)的復(fù)制，使之喪失神經(jīng)毒性；2）切除大部分病毒基因的重組HSV，可克隆較大的外源基因片段甚至多個(gè)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)移，而不影響病毒外殼的包裝能力；3）HSV在體外可達(dá)到很高的滴度，以作為病毒貯備。2.非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（非生物學(xué)方法）。（一）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)1.脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。基本原理:利用陽離子脂質(zhì)體單體與DNA混合后，可以自動(dòng)形成包埋外源DNA的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源DNA（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。圖示脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移過程。（二）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)將DNA與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，即可使DNA具有靶向性。這種偶聯(lián)通常通過多聚陽離子，如多聚賴氨酸來實(shí)現(xiàn)。多聚陽離子與配體共價(jià)連接后，又通過電荷相互作用與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合，將DNA團(tuán)團(tuán)包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復(fù)合物可被帶有特異性受體的靶細(xì)胞有效吞飲，從而將外源DNA導(dǎo)入靶細(xì)胞。圖示受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移過程。第一個(gè)進(jìn)行這方面應(yīng)用研究的受體是僅在肝細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的去唾液酸糖蛋白受體。它的主要天然配體為去唾液酸血清類粘蛋白。將牛血清白蛋白半乳糖基化也可形成該受體的人工配體，帶有這種配體的DNA復(fù)合物即可被定向送入肝細(xì)胞，而不進(jìn)入其他組織。目前研究的配體有胰島素、表皮生長因子、凝集素、運(yùn)鐵球蛋白和紅細(xì)胞生成素等等。這種類型轉(zhuǎn)移技術(shù)還存在一些缺點(diǎn)，如DNA復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞依賴于配體－受體介導(dǎo)的吞飲作用，而這是一個(gè)將配體－受體復(fù)合物導(dǎo)向溶酶體的過程。在溶酶體中大部分復(fù)合物將被降解和再循環(huán)利用，只有少數(shù)導(dǎo)入的DNA能夠逃避這條途徑而進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用。（三）基因直接注射技術(shù)不需要進(jìn)行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露基因DNA注入動(dòng)物肌肉或某些器官組織內(nèi)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：接受注射異體DNA的小鼠能夠按其基因編碼合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并能維持?jǐn)?shù)月之久。將促進(jìn)心臟血管生長的基因直接注入實(shí)驗(yàn)鼠的心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細(xì)血管增加30%～40%；將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細(xì)胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素；肌內(nèi)注射凝血因子Ⅸ基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子等等?；蛑苯幼⑸浞ǖ膬?yōu)點(diǎn)：1.制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒DNA重組體的技術(shù)較容易；2.排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用；3.導(dǎo)入的基因不需整合即可表達(dá)，避免了逆轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)的缺點(diǎn)；4.基因直接注射法可反復(fù)使用，而病毒載體則可能誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答，致使反復(fù)治療效果下降。（四）納米轉(zhuǎn)運(yùn)體（五）其它方法非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中還包括磷酸鈣共沉淀、電穿孔法、DEAE－葡聚糖法、細(xì)胞顯微注射以及基因槍顆粒轟擊等多種物理、化學(xué)方法。這些轉(zhuǎn)移方法的效率差異較大，有的需要特殊的儀器，只適合體外基因轉(zhuǎn)移，在基因治療中極少使用。列表比較各種基因轉(zhuǎn)移方法的特性。第三節(jié)基因干預(yù)一、反義RNA(－)反義RNA與基因表達(dá)調(diào)控利用反義RNA對體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控通常采用的方法有兩種：1.體外合成反義RNA，直接作用于培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞吸收RNA后，發(fā)揮作用。2.構(gòu)建一些能轉(zhuǎn)錄反義RNA的重組質(zhì)粒，將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄出反義RNA而發(fā)揮作用。反義RNA用于體內(nèi)基因治療，必須解決以下兩個(gè)關(guān)鍵問題。l.專一性轉(zhuǎn)移問題：即如何專一性地對病變細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，而不影響其它正常細(xì)胞。2.反義RNA進(jìn)入靶細(xì)胞前的降解問題：反義RNA抗RNase的能力并不強(qiáng)。將反義RNA注射到體內(nèi)。體內(nèi)的RNase就會(huì)使反義RNA的有效量迅速減少，剩下的未被降解的反義RNA也無法集中到病灶處而是分散到全身。（二）受體介導(dǎo)反義RNA技轉(zhuǎn)移術(shù)借助受體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)移方法把DNA換成反義RNA，就可以實(shí)現(xiàn)受體介導(dǎo)的反義RNA的轉(zhuǎn)移。受體介導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)移十分專一，而且效率高；被轉(zhuǎn)移的RNA是被保護(hù)的，與周圍環(huán)境之間存在多聚賴氨酸的保護(hù)層,因而可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用，提高轉(zhuǎn)移效率。利用脫唾液酸血清類粘蛋白（ASGP）受體介導(dǎo)反義RNA轉(zhuǎn)移時(shí),應(yīng)先脫去血清類粘蛋白上的唾液酸，得到ASGP，通過化學(xué)物質(zhì)作為中間連接物，將AGSP與多聚賴氨酸（PL）共價(jià)結(jié)合，得到ASGP-PL復(fù)合物，即成為運(yùn)載核酸的工具。ASGP-PL反義RNA復(fù)合物可以專一性地被肝細(xì)胞表面的ASGP受體所識(shí)別，并吞噬到肝細(xì)胞中，反義RNA通過這一途徑進(jìn)入肝細(xì)胞后，可被逐漸釋放出來發(fā)揮作用。利用肝素作為配體在細(xì)胞水平可以抑制c-myc基因的表達(dá)。利用ASGP受體介導(dǎo)系統(tǒng)，在細(xì)胞水平可以專一地抑制乙肝病毒基因的表達(dá)。（三）反義RNA的應(yīng)用前景受體介導(dǎo)的反義RNA基因治療有其自身的優(yōu)點(diǎn)，而且在一定程度上補(bǔ)充了轉(zhuǎn)基因治療的不足：安全性高，反義RNA只作用于特異的mRNA分子，并不改變所調(diào)節(jié)基因的結(jié)構(gòu)。反義RNA分子無論怎樣修飾，最終將在細(xì)胞內(nèi)部被降解，不留“殘?jiān)?。反義RNA設(shè)計(jì)和制備方便；具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng)；能直接作用于一些RNA病毒，在治療RNA病毒感染性疾病時(shí)，受體介導(dǎo)的反義RNA基因治療比一般的DNA基因治療有更大的優(yōu)勢。利用反義RNA可以直接作用于病毒RNA，阻斷RNA病毒的繁殖。反義RNA技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)不再局限于反義RNA自身的特性，而是可以讓反義RNA帶上其它活性，從而使受體介導(dǎo)的反義RNA技術(shù)在基因治療方面更具優(yōu)勢。例如：用硫代磷酸核苷代替通常的核苷酸，可以增強(qiáng)反義核酸的抗降解作用。又如，設(shè)計(jì)出具有核酶活性的反義RNA，不僅可以阻斷特定mRNA的翻譯，而且能通過它帶上的核酶來切割mRNA分子，促進(jìn)mRNA的降解。已有人利用攜帶核酶的反義RNA增強(qiáng)了反義RNA對HIV-1的抑制作用。核酶反義RNA技術(shù)，必將更加有效地阻斷RNA病毒的復(fù)制，從而實(shí)現(xiàn)RNA病毒的治療。二、干擾RNA（一）RNA干擾現(xiàn)象對RNA干擾的認(rèn)識(shí)來源于用線蟲（C.elegans）和果蠅所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)。最初的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，有義鏈RNA（senseRNA）或反義鏈RNA（antisenseRNA）均能抑制秀麗線蟲基因的表達(dá)，雙鏈RNA比單鏈RNA更為有效。將特異的雙鏈RNA注入線蟲體內(nèi)可抑制有同源序列的基因的表達(dá)。得到的結(jié)果是有義鏈RNA和反義鏈RNA都同樣阻斷基因表達(dá)途徑。這與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。而且其抑制基因表達(dá)的效率比純化后的反義RNA至少高2個(gè)數(shù)量級(jí)。RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過程中，與雙鏈RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，從而抑制了該基因的表達(dá)。RNA干擾技術(shù)在基因功能研究和人類疾病治療方面有廣闊的應(yīng)用前景。（二）RNA干擾的機(jī)制RNA干擾過程主要有2個(gè)步驟：（1）小干擾性RNA：長雙鏈RNA被細(xì)胞內(nèi)的雙鏈RNA特異性核酸酶切成21-23個(gè)堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干擾性RNA（smallinterferingRNA，siRNA）。（2）siRNA與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。該復(fù)合體可識(shí)別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點(diǎn)將該mRNA切斷。闡明siRNA在雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默中的作用是RNA干擾研究中最重要的發(fā)現(xiàn)之一。圖示RNAi抑制基因表達(dá)的過程除使用人工合成的siRNA之外，人們已經(jīng)成功地使用質(zhì)粒載體或病毒載體在細(xì)胞內(nèi)生成siRNA，來特異性地抑制外源性或內(nèi)源性基因在哺乳類動(dòng)物表達(dá)。用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細(xì)胞內(nèi)長時(shí)間、穩(wěn)定地生成siRNA。這些研究將有助于把RNA干擾技術(shù)用于治療人類疾病。在大多數(shù)用哺乳類細(xì)胞做的RNA干擾實(shí)驗(yàn)中，雙鏈RNA比單鏈RNA更有效。有少數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雙鏈RNA通過其反義鏈而起作用，但僅使用反義鏈RNA常常不能在哺乳類細(xì)胞中有效抑制基因的表達(dá)。siRNA的發(fā)現(xiàn)不僅加深了人們對RNA干擾機(jī)制的認(rèn)識(shí)，同時(shí)突破了一個(gè)用長雙鏈RNA在哺乳類細(xì)胞中抑制基因表達(dá)時(shí)常常遇到的障礙，即非特異性作用。長于30個(gè)堿基對的雙鏈RNA常常會(huì)激活蛋白激酶而誘發(fā)對蛋白質(zhì)合成的非特異抑制。siRNA一般不會(huì)在哺乳類細(xì)胞中誘發(fā)這種非特異性抑制。用人工合成的siRNA可特異性地抑制哺乳類細(xì)胞中外源性或內(nèi)源性基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明，長度為21個(gè)堿基、3ˊ末端有2個(gè)堿基突出的siRNA活性較高。siRNA誘發(fā)的基因抑制具有高度的序列特異性。小結(jié)雙鏈siRNA能夠特異性地抑制序列與之相同基因的表達(dá)，這種現(xiàn)象被稱為RNA干擾（RNAi)。長度為21~23個(gè)堿基的雙鏈siRNA通過誘導(dǎo)蛋白質(zhì)復(fù)合體RISC后，與之相結(jié)合分解靶基因，抑制靶基因的表達(dá)。siRNA可以進(jìn)行化學(xué)合成以及體外轉(zhuǎn)錄合成等，也可以通過質(zhì)粒載體、腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等在細(xì)胞內(nèi)合成。RNAi可以廣泛應(yīng)用到各種基因功能研究以及發(fā)育生物學(xué)的研究中，也有望應(yīng)用到各種疾病的基因治療中。（三）RNA干擾的應(yīng)用前景RNA干擾現(xiàn)象在生物界普遍存在，以及RNA干擾的作用機(jī)制和生物學(xué)功能的初步闡明，為RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。RNA干擾研究目前已經(jīng)在功能基因組學(xué)研究、微生物學(xué)研究、基因治療和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等廣泛領(lǐng)域取得了令人矚目的進(jìn)展，使其在醫(yī)學(xué)、生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用有著廣闊的前景。1.研究基因功能的新工具由于RNA干擾技術(shù)具有高度的序列專一性和有效的干擾能力，可以特異地使特定基因沉默或功能喪失，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具。研究表明RNA干擾技術(shù)能夠在哺乳動(dòng)物中抑制特定基因的表達(dá)，建立多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)。RNA干擾技術(shù)成功用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，標(biāo)志著RNA干擾技術(shù)將成為研究基因功能不可或缺的工具。2.腫瘤的基因治療傳統(tǒng)反義RNA技術(shù)誘發(fā)的單一癌基因的阻斷，不可能完全抑制或逆轉(zhuǎn)腫瘤的生長，而RNA干擾技術(shù)可以利用同一基因家族的多個(gè)基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性，設(shè)計(jì)針對這一區(qū)段序列的雙鏈RNA分子，只使用一種雙鏈RNA即可以產(chǎn)生多個(gè)基因同時(shí)剔除的表現(xiàn)，也可以同時(shí)使用多種雙鏈RNA而將多個(gè)序列不相關(guān)的基因同時(shí)剔除。RNA干擾技術(shù)可用于治療有異常基因表達(dá)的惡性腫瘤。K-RAS蛋白為腫瘤發(fā)生所必需，bcr/ab1融合基因與人白血病有關(guān)，用RNA干擾技術(shù)可以阻礙K-RAS蛋白的表達(dá)從而抑制腫瘤發(fā)生，或殺死有bcr/ab1的人白血病細(xì)胞系。通過RNA干擾抑制某些內(nèi)源性基因的表達(dá)，能促進(jìn)白血病細(xì)胞系的細(xì)胞凋亡或增加其對化療藥物的反應(yīng)性。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)成功地阻斷了MCF-7乳腺癌細(xì)胞中一種異常表達(dá)的與細(xì)胞增殖分化相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子基因Sp1的功能。3.病毒性疾病的基因治療

RNA干擾可以被看成是一種與免疫系統(tǒng)類似的防御機(jī)制。用siRNA抑制人類免疫缺陷病毒（HIV）某些基因的表達(dá)，如P24、Vif、nef、tat或rev，阻礙HIV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。用RNA干擾技術(shù)抑制HIV的受體（CD4）或輔助受體（CXCR4或CCR5）在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可阻礙HIV感染細(xì)胞。也可通過RNA干擾抑制其他病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，如脊髓灰質(zhì)炎病毒、人乳頭瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。siRNA在病毒感染的早期階段能有效地抑制病毒的復(fù)制，病毒感染能被針對病毒基因和相關(guān)宿主基因的siRNA所阻斷，這些結(jié)果提示RNA干擾技術(shù)能用于許多病毒性疾病的基因治療，RNA干擾技術(shù)將成為一種有效的抗病毒治療手段。這對于許多嚴(yán)重的病毒性疾病的防治具有十分重大的意義。三、核酶(ribozyme)天然核酶多為單一的RNA分子，具有自剪切作用。但核酶也可以由兩個(gè)RNA分子組成。只要兩個(gè)RNA分子通過互補(bǔ)序列相結(jié)合，形成錘頭狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)（3個(gè)螺旋區(qū)），并能組成核酶的核心序列（13個(gè)或11個(gè)保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應(yīng)。在這種情況下，組成核酶的兩個(gè)RNA分子中，帶有被剪切位點(diǎn)的RNA分子實(shí)際上是被剪切的靶分子，而與之結(jié)合的RNA分子雖然只是構(gòu)成了核酶的一部分，但實(shí)際上是作為一個(gè)酶在起作用，這種RNA分子也被稱為核酶，基因治療中應(yīng)用的就是這種核酶。在基因治療時(shí)，利用這種核酶分子結(jié)合到靶RNA分子中適當(dāng)?shù)泥徫?，形成錘頭核酶結(jié)構(gòu)，將靶RNA分子切斷，通過破壞靶RNA分子達(dá)到治療疾?。ㄈ缜宄《净蚪MRNA）的目的。(－)核酶的設(shè)計(jì)應(yīng)用核酶進(jìn)行基因治療是通過靶RNA分子與核酶分子共同組成酶活性結(jié)構(gòu)域，需要從靶分子和核酶分子兩個(gè)方面來考慮核酶的設(shè)計(jì)。1.選擇合適的靶部位,即具有核酶切割位點(diǎn)，能與核酶分子結(jié)合并組成酶活性結(jié)構(gòu)域。2.核酶的基本組成：用于基因治療的核酶分子由三個(gè)部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導(dǎo)序列。在基因治療中，主要是根據(jù)治療的靶基因序列的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)和合成特定的核酶。設(shè)計(jì)的基本原則是核酶分子與靶部位結(jié)合后能形成酶活性結(jié)構(gòu)域。圖示核酶抑制翻譯的過程。核酶兩端的引導(dǎo)序列與靶RNA分子的序列互補(bǔ)，起著識(shí)別和結(jié)合底物的作用。這兩段序列可以根據(jù)底物核苷酸序列而變動(dòng)，關(guān)鍵是能夠特異性識(shí)別并結(jié)合靶分子，形成錘頭結(jié)構(gòu)的三個(gè)螺旋區(qū)。引導(dǎo)序列的長度、引導(dǎo)序列識(shí)別區(qū)域的確定（如抗病毒時(shí)選擇調(diào)節(jié)或功能必需區(qū)域），在實(shí)際應(yīng)用時(shí)還需具體考慮。（二）核酶的應(yīng)用在基因治療研究領(lǐng)域中，反義核酸技術(shù)是一個(gè)非常重要的技術(shù)。在該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用中，存在著一個(gè)難題，由于mRNA的拷貝數(shù)太多，難以達(dá)到完全的抑制。核酶的出現(xiàn)，為這一問題的解決提供了契機(jī)。與一般的反義RNA相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊，而更重要的是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它的mRNA分子。核酶導(dǎo)入細(xì)胞的方法：l.外源導(dǎo)入：多采用脂質(zhì)體法，將體外轉(zhuǎn)錄合成的核酶通過脂質(zhì)體包裹后，導(dǎo)入細(xì)胞，此種方法將核酶導(dǎo)入細(xì)胞的效率較高，每個(gè)細(xì)胞中可導(dǎo)入30萬個(gè)核酶分子。2．內(nèi)源導(dǎo)入：指通過真核表達(dá)載體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)核酶。根據(jù)靶序列設(shè)計(jì)合成核酶的正鏈和負(fù)鏈的DNA片段；形成DNA雙鏈后，將其克隆至合適的真核表達(dá)載體；最后將此載體用適當(dāng)?shù)姆椒ㄞD(zhuǎn)入靶細(xì)胞或組織，讓其表達(dá)出核酶，阻斷基因表達(dá)。四、三鏈DNA脫氧寡核苷酸(ODN)能與雙鏈DNA專一性序列結(jié)合，形成三鏈DNA，來阻止基因轉(zhuǎn)錄或DNA復(fù)制，此種ODN又被稱為三鏈DNA形成脫氧寡核苷酸（triplehelix-formingoligonucleotides，TFO）。為了與作用在mRNA翻譯水平的反義RNA的反義技術(shù)相區(qū)別，又將三鏈DNA技術(shù)稱之為反基因技術(shù)。（－）三鏈DNA與基因表達(dá)ODN以DNA雙螺旋分子的專一性序列為靶標(biāo)，通過與該序列形成三螺旋DNA來阻止基因轉(zhuǎn)錄。由于反義RNA技術(shù)和核酶技術(shù)對于源源不斷的mRNA難以一一阻斷或剪斷，也就難以達(dá)到完全抑制。因此，當(dāng)基因治療的目的是盡可能完全地抑制特定基因的表達(dá)時(shí)，必須將注意力轉(zhuǎn)向mRNA的源頭，即從轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行抑制。反基因技術(shù)給腫瘤及病毒性疾病的治療提示了一個(gè)新的方向。（二）作用機(jī)制DNA雙螺旋內(nèi)具有同聚嘌吟和同聚嘧啶的H回文區(qū)域可發(fā)生自身折疊，形成局部的分子內(nèi)三鏈DNA結(jié)構(gòu)，同時(shí)游離出一段DNA單鏈。同理，合成的同聚嘌呤或同聚嘧啶ODN在一定條件下也可以與雙螺旋DNA分子中的同聚聚嘌呤和同聚嘧啶區(qū)段結(jié)合形成局部的分子間三鏈DNA，這一結(jié)構(gòu)也是由氫鍵所穩(wěn)定。三堿基體有C＋GC、GGC及TAT、AAT。能形成三螺旋的ODN必須滿足C、G對GC或T、A對AT的識(shí)別。靶基因的優(yōu)勢結(jié)合位點(diǎn)在15～40堿基對的范圍內(nèi)，ODN通常結(jié)合到雙螺旋中同聚嘌吟（A和G）鏈上；形成三螺旋的ODN不干擾原有雙螺旋間的氫鍵，ODN中每個(gè)堿基與雙螺旋靶區(qū)中的嘌呤堿基形成兩個(gè)新的氫鍵。（三）三鏈DNA的應(yīng)用研究不少基因中存在同聚嘌呤和同聚嘧啶的區(qū)域，能夠通過TFO對基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)。能與her-2原癌基因的啟動(dòng)子區(qū)域形成三螺旋的TFO可通過競爭性結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄因子與相應(yīng)位點(diǎn)的結(jié)合，為過度表達(dá)HER-2的乳腺癌的治療帶來了可能。能與人c-myc基因轉(zhuǎn)錄起站位點(diǎn)－115bp處結(jié)合形成三鏈DNA的TFO可在體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)抑制c-myc的轉(zhuǎn)錄。孕激素對于某些腫瘤尤其是生殖系統(tǒng)腫瘤的生長有促進(jìn)作用，這是通過孕激素受體對孕激素反應(yīng)基因(PRG)的激活而實(shí)現(xiàn)的。實(shí)驗(yàn)證明，TFO與PRG的孕激素反應(yīng)元件的結(jié)合，可阻止孕激素受體與PRG的特異性結(jié)合，并抑制這一基因的轉(zhuǎn)錄。人類mdr1基因編碼一種跨膜糖蛋白，其過度表達(dá)與人類腫瘤細(xì)胞的多抗藥性形成有關(guān)。能與這種基因編碼區(qū)的高嘌呤序列形成三鏈DNA結(jié)構(gòu)的TFO可對基因表達(dá)進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)。這種抑制作用，對于腫瘤化療來說無疑是一個(gè)很好的輔助手段。第四節(jié)

基因治療的靶細(xì)胞選擇轉(zhuǎn)移基因的靶細(xì)胞時(shí)考慮的因素：1.不管是invivo還是exvivo基因轉(zhuǎn)移，選擇目的基因表達(dá)的組織細(xì)胞，最好是組織特異性細(xì)胞。2.細(xì)胞較易獲得，且生命周期較長。3.離體細(xì)胞較易受外源遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)化。4.離體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染和一定時(shí)間培養(yǎng)后再植回體內(nèi)仍較易成活。在基因治療過程中，要有針對性地選擇靶細(xì)胞，確保導(dǎo)入的基因能夠有效表達(dá)并發(fā)揮治療作用。一、造血細(xì)胞造血組織細(xì)胞在體內(nèi)多處分布，有較多的遺傳病與造血組織相關(guān)，骨髓移植方法已經(jīng)建立，使造血細(xì)胞成為基因治療中最重要的受體細(xì)胞。將基因轉(zhuǎn)移至骨髓多能造血干細(xì)胞，則可以使轉(zhuǎn)移基因始終存在于所有造血細(xì)胞內(nèi)。造血干細(xì)胞能分化成各系血細(xì)胞，具有移植方便、繁殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)，因此是基因治療合適的靶細(xì)胞。對骨髓細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)主要是將基因轉(zhuǎn)移到未分離的骨髓細(xì)胞，如果轉(zhuǎn)移后4個(gè)月在骨髓和（或）淋巴組織內(nèi)仍有轉(zhuǎn)移基因的存在或表達(dá)，即認(rèn)為已成功地轉(zhuǎn)染了造血干細(xì)胞。近年來造血干細(xì)胞分離技術(shù)不斷完善，對基因治療的發(fā)展無疑具有重要意義。二、肝細(xì)胞肝臟是重要的代謝器官，許多遺傳病都是由于肝特異的基因產(chǎn)物缺陷而引起的，肝臟也是腫瘤的高發(fā)部位；此外，肝細(xì)胞作為移植細(xì)胞也可在異位發(fā)揮功能，以肝細(xì)胞作為受體細(xì)胞是基因治療研究的熱點(diǎn)之一。肝細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移的另一個(gè)特點(diǎn)就是可以利用受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，在體內(nèi)直接進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。有人應(yīng)用去唾液酸血清類粘蛋白和多聚賴氨酸復(fù)合物轉(zhuǎn)移β-半乳糖苷酶基因至鼠肝細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞達(dá)％。三、血管內(nèi)皮細(xì)胞將基因?qū)胙軆?nèi)皮細(xì)胞，可以直接向血液中分泌基因表達(dá)產(chǎn)物。已有實(shí)驗(yàn)在豬的髂動(dòng)脈內(nèi)利用雙氣囊導(dǎo)管直接向動(dòng)脈內(nèi)注入含有β-半乳糖苷酶基因的脂質(zhì)體，該部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)β-半乳糖苷酶達(dá)5個(gè)月之久。四、淋巴細(xì)胞外周血淋巴細(xì)胞中的T淋巴細(xì)胞擔(dān)負(fù)著重要的免疫功能，也很容易從體內(nèi)取出和回輸，可以在體外進(jìn)行培養(yǎng)和擴(kuò)增，并對目前常用的幾種基因轉(zhuǎn)移方法都具有一定的敏感度。應(yīng)用各種基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，已將細(xì)胞因子、功能蛋白質(zhì)和選擇抗性等基因?qū)肓送庵苎馨图?xì)胞并獲得穩(wěn)定高效表達(dá)，這是免疫缺陷性疾病、腫瘤、血液系統(tǒng)單基因遺傳性疾病基因治療的一條重要途徑。五、肌肉細(xì)胞骨骼肌細(xì)胞的突出特點(diǎn)：骨骼肌細(xì)胞中的成肌細(xì)胞（myoblast）作為基因治療的靶細(xì)胞具有很大的優(yōu)勢。成肌細(xì)胞壽命較長，適于較長期的外源基因表達(dá)，來源豐富，容易取出和培養(yǎng)，具有一定的分裂能力，因而對逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染很敏感，容易移植。成肌細(xì)胞中分泌的外源基因表達(dá)產(chǎn)物，不僅對骨骼肌組織產(chǎn)生一些生物效應(yīng)，而且可以進(jìn)入血液以影響全身?？刹捎弥苯芋w內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，即將真核表達(dá)載體直接注射入骨骼肌。用含β-半乳糖苷酶基因的真核表達(dá)質(zhì)粒直接注射入小鼠骨骼肌，在注射區(qū)域的肌細(xì)胞可以檢測到該基因的表達(dá)。血管平滑肌細(xì)胞可進(jìn)行體外培養(yǎng)，經(jīng)遺傳操作后再送回血管。在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，已有將自殺基因和抑癌基因?qū)胙芷交〖?xì)胞中成功抑制血管壁增厚的報(bào)道。六、腫瘤細(xì)胞各種腫瘤細(xì)胞也是基因治療研究中極為重要的靶細(xì)胞類型。視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤與wilm瘤都是由于某些基因的缺失而引起的。如果將RB顯性基因轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的細(xì)胞，獲得RB表達(dá)以后，可使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞形態(tài)正常轉(zhuǎn)化，故RB和Wilm腫瘤的基因治療必須以腫瘤細(xì)胞作為其基因治療的靶細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞對目前絕大多數(shù)的基因轉(zhuǎn)移方法都比較敏感。特別是腫瘤細(xì)胞始終處于旺盛的分裂狀態(tài)，因此，可以進(jìn)行高效率的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。七、其它細(xì)胞許多實(shí)質(zhì)性器官細(xì)胞也是基因治療較為常用的細(xì)胞類型，除了肝細(xì)胞外，還有心肌細(xì)胞和脾細(xì)胞。但實(shí)質(zhì)性器官細(xì)胞的取出一般要借助外科手術(shù)。至少也是活檢，移植也較為困難，實(shí)質(zhì)性器官細(xì)胞對逆轉(zhuǎn)錄病毒的感染也不是十分敏感，這些都給基因治療帶來一些困難。第五節(jié)治療基因的受控表達(dá)治療基因的受控表達(dá)包括控制治療基因表達(dá)的時(shí)間、空間和水平三個(gè)方面。時(shí)間有兩個(gè)方面的內(nèi)容：1.控制治療的基因在患者需要實(shí)施治療時(shí)才表達(dá)，而平時(shí)不需要進(jìn)行治療時(shí)則處于關(guān)閉狀態(tài)；2.根據(jù)不同疾病的治療要求，控制治療基因持續(xù)表達(dá)的時(shí)間跨度?？臻g是指為了提高基因治療的專一性和安全性，嚴(yán)格限制治療基因只在靶細(xì)胞中表達(dá)，避免治療基因指導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)干擾非靶細(xì)胞的正常生活，產(chǎn)生毒副作用。表達(dá)水平：希望治療基因能在一個(gè)適當(dāng)?shù)乃奖磉_(dá)。要實(shí)現(xiàn)治療基因的受控表達(dá)，必須建立完善的基因表達(dá)調(diào)控體系?；蛘{(diào)控策略大致有以下幾種：基因內(nèi)部調(diào)節(jié)機(jī)制、基因外部調(diào)節(jié)機(jī)制、利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達(dá)以及治療基因的誘導(dǎo)表達(dá)等。一、基因內(nèi)部的調(diào)節(jié)機(jī)制（一）使用正常細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件不同類型的正常細(xì)胞或組織中往往存在某些特有的蛋白質(zhì)，它們的基因表達(dá)調(diào)控元件可用于驅(qū)動(dòng)治療基因的特異性表達(dá)，從而起到治療作用。例如，酪氨酸酶是皮膚細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞產(chǎn)生色素途徑中的一種酶，可利用其啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)治療基因只在黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)，而不在正常的周邊細(xì)胞中表達(dá)。前列腺特異性抗原(PSA)是參與精液凝塊中蛋白質(zhì)降解、使精液液化的一種絲氨酸蛋白酶。它主要在前列腺中產(chǎn)生，而在前列腺癌細(xì)胞中含量很高，可以利用PSA基因調(diào)控元件驅(qū)動(dòng)治療基因在PSA陽性的前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)而發(fā)揮作用，而其在PSA陰性細(xì)胞和非前列腺癌細(xì)胞中不能使治療基因表達(dá)。（二）使用病變細(xì)胞的組織特異性啟動(dòng)子、增強(qiáng)子元件某些病變的細(xì)胞或組織產(chǎn)生一些特殊的蛋白質(zhì)，其基因表達(dá)調(diào)節(jié)元件也可以用來控制治療基因的特異性表達(dá)。例如，甲胎蛋白(AFP)基因正常情況下只在胚胎肝細(xì)胞中表達(dá)，不在成年肝臟細(xì)胞中表達(dá)。肝細(xì)胞腺癌細(xì)胞中AFP基因異常激活，因此可利用該基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)治療基因(如自殺基因)在癌細(xì)胞中表達(dá)，使癌細(xì)胞經(jīng)給藥后被殺死。癌胚抗原(CEA)是膜糖蛋白家族的成員，在許多腺癌細(xì)胞中含量很高，采用其啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)治療基因，可以使治療基因只在CEA陽性的癌細(xì)胞中表達(dá)，而不會(huì)在陰性細(xì)胞中表達(dá)。此外，正在開展研究的這種類型的調(diào)控元件還有DF3(MUC1)啟動(dòng)子、HER-2/neu(erbB2)啟動(dòng)子和Myc-Max響應(yīng)元件等。二、基因外部的調(diào)節(jié)機(jī)制除利用基因內(nèi)部的調(diào)節(jié)機(jī)制以外，還可通過施加外部刺激，促進(jìn)治療基因在特定細(xì)胞或組織中表達(dá)效果。例如：采用熱休克蛋白基因的表達(dá)調(diào)控元件來啟動(dòng)治療基因，可以通過對病灶局部進(jìn)行熱處理，達(dá)到使治療基因特異性表達(dá)的目的。又如：Egr-1基因是一種編碼鋅指轉(zhuǎn)錄因子的早期基因，包括電離輻射和細(xì)胞因子等在內(nèi)的多種外部刺激都可以誘導(dǎo)其表達(dá)，將其調(diào)控序列啟動(dòng)的治療基因(如腫瘤壞死因子基因)導(dǎo)入腫瘤組織，可在電離輻射等作用下，使治療基因獲得暫時(shí)性的局部表達(dá)，增強(qiáng)放療效果，殺死腫瘤細(xì)胞。組織纖溶酶原激活物(t-PA)作為溶解血栓的藥劑，在中風(fēng)和心肌梗死等疾病治療中起著重要的作用。在一些抗放療的腫瘤中，t-PA的活性在輻射后竟然增加50倍，表明其基因表達(dá)調(diào)控元件中存在受輻射誘導(dǎo)的調(diào)控元件，故可利用其調(diào)控元件啟動(dòng)治療基因的表達(dá)，增強(qiáng)放療效果。三、利用病灶微環(huán)境使治療基因特異性表達(dá)病灶微環(huán)境與正常時(shí)往往不同，因此可利用這些變化控制治療基因的表達(dá)。例如，在腫瘤病灶處，常常出現(xiàn)葡萄糖缺乏等情況，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白GRP78/Bip的含量也隨之增加，使癌細(xì)胞能夠抵御應(yīng)激。當(dāng)采用這種基因的啟動(dòng)子來控制治療基因時(shí)，可以使治療基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，使腫瘤組織壞死。在過度生長的腫瘤組織中，由于腫瘤細(xì)胞生長速度快于形成血管的內(nèi)皮細(xì)胞，造成供血不足，因此在腫瘤內(nèi)部形成酸性、缺氧和營養(yǎng)缺乏的區(qū)域，而缺氧條件可以通過缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)和缺氧響應(yīng)元件(HRE)相互作用，調(diào)節(jié)一些基因的表達(dá)；如果采用缺氧響應(yīng)元件(HRE)來控制治療基因的表達(dá)，即可實(shí)現(xiàn)治療基因只在缺氧的腫瘤組織中表達(dá)，而在正常組織中不表達(dá)。機(jī)體發(fā)炎時(shí)所可產(chǎn)生的許多急性期蛋白，其基因的啟動(dòng)子可以控制發(fā)炎條件下治療基因的表達(dá)；而一旦炎癥消失，治療基因的表達(dá)也隨之終止。四、治療基因的誘導(dǎo)表達(dá)采用組織特異性啟動(dòng)子控制治療基因的表達(dá)，可能造成這些基因在靶細(xì)胞中表達(dá)，不再受外界控制。為了避免這種情況發(fā)生，研究人員正在開發(fā)和完善一些可誘導(dǎo)性基因表達(dá)系統(tǒng)。這種系統(tǒng)的必要成分有兩種：一種是轉(zhuǎn)錄激活劑，它只在誘導(dǎo)藥物存在時(shí)才能與DNA結(jié)合；另一種則是特異性基因表達(dá)調(diào)控元件，僅對這種轉(zhuǎn)錄激活劑有所響應(yīng)。目前較理想的可誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)有四環(huán)素抗性操縱子系統(tǒng)。原理：大腸桿菌四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄受到Tet阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控，在沒有四環(huán)素存在的條件下，阻遏蛋白與四環(huán)素抗性操縱子序列結(jié)合從而阻斷四環(huán)素抗性基因的表達(dá)；而當(dāng)四環(huán)素存在的時(shí)候，由于阻遏蛋白與四環(huán)素具有極高的親和性，造成阻遏蛋白對四環(huán)素抗性操縱子阻遏解除，從而使四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行?；谏鲜鲈硭_發(fā)的Tet-off/Tet-on基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)已成為基因治療基礎(chǔ)研究中的一種有效工具。四環(huán)素抗性操縱子系統(tǒng)原理四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄受Tet阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控。無四環(huán)素存在時(shí)，阻遏蛋白與四環(huán)素抗性操縱子序列結(jié)合阻斷四環(huán)素抗性基因的表達(dá)；四環(huán)素存在時(shí)，阻遏蛋白與四環(huán)素具有極高的親和性，造成阻遏蛋白對四環(huán)素抗性操縱子阻遏解除，使四環(huán)素抗性基因的轉(zhuǎn)錄得以進(jìn)行。圖示四環(huán)素抗性操縱子系統(tǒng)工作原理第六節(jié)

基因治療的應(yīng)用研究世界上第一個(gè)正式被批準(zhǔn)用于基因治療的病例是先天性腺苷脫氨酶（ADA）缺乏癥。1990年9月美國Blaese博士成功地將正常的人的ADA基因植入ADA缺乏癥病人的淋巴結(jié)內(nèi)，完成世界上首例基因治療試驗(yàn)。在此后十幾年中，基因治療在臨床上的試驗(yàn)和應(yīng)用越來越多。一、遺傳病的基因治療研究已知人類有4000多種遺傳病，在人群中的發(fā)病率約為40％～50％。但真正了解病因，能進(jìn)行產(chǎn)前診斷的僅限于那些為數(shù)不多的常見遺傳病。由于目前基因治療的發(fā)展正處于起步階段，對遺傳病進(jìn)行基因治療的研究范圍還十分有限，必須符合以下要求的遺傳病才可以考慮開展基因治療研究工作：1.在DNA水平明確其發(fā)病原因及機(jī)制；2.必須是單基因遺傳病，而且屬隱性遺傳；3.該基因的表達(dá)不需要精確調(diào)控；4.該基因能在一種便于臨床操作的組織細(xì)胞(如皮膚細(xì)胞，骨髓細(xì)胞等)中表達(dá)并發(fā)揮其生理作用；5.該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴(yán)重后果(如不治療難以存活等)?？晒┻x擇并符合上述4條以上要求的不過只有30余種遺傳病,如：腺苷脫氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)缺乏癥；珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白??；血友病和其他血漿蛋白缺乏癥；苯丙酮酸尿癥和其他先天性代謝缺陷?。蝗R-納(Lesch-Nyhan)綜合征；家族性高膽固醇血癥；囊性纖維化病等。二、惡性腫瘤基因治療研究腫瘤發(fā)生是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，許多基因的突變會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，如乳腺癌的發(fā)生至少與20個(gè)基因缺失有關(guān)。21世紀(jì)腫瘤的基因治療將會(huì)在以下幾個(gè)方面取得突破：（1）通過基因置換和基因補(bǔ)充，導(dǎo)入多種抑癌基因以抑制癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移；（2）是抑制癌基因的活性，通過干擾癌基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)揮抑癌作用；（3）是增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，通過對腫瘤組織進(jìn)行細(xì)胞因子修飾，刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對腫瘤細(xì)胞的溶解和排斥反應(yīng)；四是通過導(dǎo)入“自殺基因”殺傷癌細(xì)胞。（一）腫瘤基因治療的基本策略從實(shí)際應(yīng)用于臨床治療的角度來看，腫瘤基因治療的策略包括：(1)直接殺傷腫瘤細(xì)胞或抑制其生長。(2)增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)，間接殺傷或抑制腫瘤細(xì)胞。(3)改善腫瘤常規(guī)治療方法，提高療效。從基因操作的角度來看，腫瘤基因治療則主要有四大策略，即基因修正、基因置換、基因失活和基因修飾。基因修正：采用基因打靶技術(shù)糾正突變的抑癌基因中的突變序列；基因置換：將外源性的正常抑癌基因直接導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞，取代突變的抑癌基因發(fā)揮作用，以改變腫瘤細(xì)胞的惡性表型；基因失活：利用基因干擾技術(shù)等抑制異常表達(dá)的癌基因或腫瘤相關(guān)基因，降低其表達(dá)活性或不表達(dá)；基因修飾：將具有增強(qiáng)治療效果的外源基因?qū)氚屑?xì)胞，外源基因的表達(dá)產(chǎn)物可以修飾、改變靶細(xì)胞的功能或使靶細(xì)胞原有功能得到增強(qiáng)，其中包括自殺基因治療、免疫基因治療、藥物敏感基因治療和耐藥基因治療等多種方法。（二）腫瘤基因治療的常用方法1．基因干預(yù)技術(shù)：通過基因干預(yù)，使得腫瘤細(xì)胞過度表達(dá)的癌基因得到抑制，從而降低其惡性表型。2．自殺基因治療—分子化療：直接殺死腫瘤細(xì)胞。3．腫瘤的免疫基因治療：以激發(fā)機(jī)體腫瘤免疫效應(yīng)或提高免疫效應(yīng)細(xì)胞功能為目的的一種腫瘤基因治療方法。4．提高化療效果的輔助基因治療：(1)藥物增敏基因治療；(2)耐藥基因治療。（1）反義RNA技術(shù)：反義RNA的獲得可通過體外構(gòu)建反義RNA表達(dá)載體，導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞表達(dá)反義RNA，也可體外合成反義RNA，導(dǎo)入靶細(xì)胞，直接對表達(dá)異常的癌基因產(chǎn)生抑制效應(yīng)。反義RNA技術(shù)治療腫瘤的途徑：（1）封閉異常表達(dá)的癌基因，如fos、neu、k-ras、c-src、c-myb和c-myc；（2）癌基因易位和重排部位是反義RNA治療的靶點(diǎn)。費(fèi)城染色體(phˊ)bcr-abl融合基因的連接處是反義封閉的最佳位置。（3）抑制腫瘤細(xì)胞耐藥性，提高化療效果。（2）RNA干擾技術(shù)：RNA干擾技術(shù)可用于癌基因異常表達(dá)的惡性腫瘤基因治療。利用RNA干擾技術(shù)可以阻斷K-ras基因的表達(dá)從而抑制腫瘤發(fā)生，或殺死bcr/abl表達(dá)的人白血病細(xì)胞系。通過RNA干擾技術(shù)可以抑制某些內(nèi)源性基因的表達(dá)，促進(jìn)白血病細(xì)胞的凋亡或增加其對化療藥物的敏感性。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)成功地阻斷了乳腺癌細(xì)胞中一種異常表達(dá)的與細(xì)胞增殖分化相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子基因的功能。RNA干擾技術(shù)在惡性腫瘤的基因治療中顯示了美好的前景。(3）反基因技術(shù)：由于人工合成的TFO很容易被體內(nèi)廣泛存在的DNA酶降解，因此在使用前必須對其進(jìn)行修飾。修飾主要針對反義寡核苷酸的磷酸骨架，可采用硫原子或甲基基團(tuán)代替磷酸二酯中帶負(fù)電的氧原子，提高對核酸酶的耐受力。TFO與HER-2原癌基因的啟動(dòng)子區(qū)域競爭性結(jié)合，抑制乳腺癌細(xì)胞中過度表達(dá)的HER-2基因。使用TFO也成功地抑制了Hela細(xì)胞中c-myc的轉(zhuǎn)錄。2．自殺基因治療：是目前腫瘤基因治療領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)之一?；驹恚合蚰[瘤細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入某些真核細(xì)胞中不存在的酶基因，這些基因表達(dá)的特異性酶可以催化對真核細(xì)胞無毒或低毒的藥物前體，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸种坪怂岷铣尚?yīng)的抗代謝藥物，進(jìn)而選擇性地將轉(zhuǎn)染了該基因的腫瘤細(xì)胞“自殺”。這些基因也相應(yīng)地被稱為“自殺基因”。目前研究較多的“自殺基因”有單純皰疹病毒的胸腺嘧啶激酶(TK)基因，它編碼的胸腺嘧啶激酶可以將無毒的核苷類似物──丙氧鳥苷（ganciclovir,GCV）磷酸化為細(xì)胞毒性物質(zhì)。此外，還有大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶（cytosinedeaminase,CD）基因，它編碼的酶可以將5-氟胞嘧啶（5-fluorocytosine,5-FC）轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性藥物5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）。自殺基因治療的前提條件是“自殺基因”的表達(dá)必須局限于腫瘤細(xì)胞中，而不傷及正常細(xì)胞。自殺基因轉(zhuǎn)移常用方法：①利用免疫脂質(zhì)體、受體介導(dǎo)等技術(shù)進(jìn)行定向基因轉(zhuǎn)移。②根據(jù)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞分裂的顯著差異，利用逆病毒載體不感染非分裂細(xì)胞的特點(diǎn)，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移。③腫瘤特異性基因轉(zhuǎn)錄。④腫瘤內(nèi)直接注射?！芭杂^者效應(yīng)”（bystandereffect）：不僅轉(zhuǎn)導(dǎo)了“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰的未轉(zhuǎn)導(dǎo)“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞也被殺死。這種效應(yīng)明顯擴(kuò)大了“自殺基因”的殺傷作用，大大放寬了對基因轉(zhuǎn)移效率的限制，對于自殺基因治療的發(fā)展具有重要意義。3．腫瘤的免疫基因治療腫瘤的免疫基因治療是根據(jù)免疫學(xué)的理論和技術(shù)，并結(jié)合基因轉(zhuǎn)移和基因表達(dá)調(diào)控等分子生物學(xué)方法，以激發(fā)機(jī)體腫瘤免疫效應(yīng)或提高免疫效應(yīng)細(xì)胞功能為目的的一種腫瘤基因治療方法。主要包括細(xì)胞因子（或受體）基因治療和抗原抗體基因治療兩大類。4．提高化療效果的輔助基因治療：臨床上對腫瘤患者進(jìn)行化療時(shí)，通常面臨兩大難題：一是患者機(jī)體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感程度存在差異，特別是某些經(jīng)過多次化療的患者，其體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞已經(jīng)產(chǎn)生了多藥耐藥性，對多種化療藥物產(chǎn)生交差耐受，最終導(dǎo)致化療失敗。二則是大劑量的化療可能導(dǎo)致患者的正常細(xì)胞，特別是骨髓造血細(xì)胞的功能受到抑制。(1)藥物增敏基因治療：為了使化療藥物能夠最大程度地殺死腫瘤細(xì)胞，可以考慮將某些藥物增敏基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，特別是對化療藥物原本不敏感的腫瘤細(xì)胞，使其對抗腫瘤藥物的敏感性大大