新不同種族腸道菌群及其益生菌的選擇

不同種族的腸道菌群及其

益生菌的選擇

乳酸菌菌種資源的收集和生物多樣性的研究2001-2014年，從中國、蒙古國、俄羅斯、巴拉圭等國家不同地區(qū)采集自然發(fā)酵乳制品、酸粥，泡菜，酸面團(tuán)以及人體糞便、動(dòng)物糞便等樣品2048份，從中分離乳酸菌6,447株，包括乳酸菌的8個(gè)屬，68個(gè)種及亞種，建成中國最大的乳酸菌菌種資源庫。NCBI登錄界面實(shí)驗(yàn)室裝備的PacBio第三代單分子實(shí)時(shí)測序儀器超長讀長：最新公布的P6-C4試劑可產(chǎn)生平均8.5-10.0Kb的有效讀長，有助于基因組拼接。錯(cuò)誤率低：避免了之前測序技術(shù)中PCR擴(kuò)增的環(huán)節(jié)，可確保稀有突變及其頻率的測定。特有動(dòng)力學(xué)信息：DNA聚合酶動(dòng)力學(xué)原理能幫助研究者實(shí)時(shí)觀察到重要的表觀遺傳修飾。腸道菌群的重要生理功能營養(yǎng)物質(zhì)加工能量代謝及平衡免疫發(fā)育和成熟代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)生理功能通過腦腸軸影響神經(jīng)系統(tǒng)影響腸道菌群的因素年齡胖瘦基因型疾病抗生素飲食腸道菌群是宿主第二套指紋密碼不同人群個(gè)體腸道微生物群落多樣性及功能基因組豐度差異顯著，可借此作為個(gè)體身份識(shí)別的第二套指紋密碼馬背上的民族--蒙古人蒙古人處于內(nèi)陸干旱半干旱型氣候環(huán)境中，

主要膳食紅肉和乳制品蒙古人的腸道內(nèi)含量最高的是普氏菌屬

（Prevotella），明顯高于歐洲人和漢族人，該菌群可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸發(fā)揮抗炎癥

作用，所以蒙古人雖然膳食纖維攝入比例很

低依然可以保持健康。蒙古人腸道核心菌群主要參與的代謝通路主要有：糖酵解，脂肪酸代謝，半乳糖代謝，丙氨酸及谷氨酸代謝，精氨酸及脯氨酸代謝，淀粉及蔗糖代謝，碳代謝，硫胺素代謝和嘧啶代謝。最后的狩獵民族--坦桑尼亞的哈扎人哈扎人適應(yīng)大草原環(huán)境生活，其腸道菌群多樣性非常豐富；哈扎人男女的腸道菌群結(jié)構(gòu)顯著不同（可能與其飲食構(gòu)成有直接聯(lián)系

男性狩獵和采集蜂蜜；女性收集塊莖等植物食物）哈扎人腸道中含高水平密螺旋體菌屬和較低水平的雙歧桿菌屬，在傳統(tǒng)定義中該菌群并不“健康”，但哈扎人很少患腸道菌失衡引起的自身免疫性疾病。最原始的群居部落--委內(nèi)瑞拉雅諾馬馬人

雅諾馬馬人在亞馬遜河流域中的熱帶雨林氣候生活，以采集、種植和狩獵為生，屬于群居的母系社會(huì)；雅諾馬馬人的腸道菌群、口腔菌群以及皮膚菌群與現(xiàn)代美國人結(jié)構(gòu)迥異，腸道菌群多樣性比美國人高出30%-40%；雅諾馬馬人腸道中含高水平的普氏菌屬，這點(diǎn)與蒙古人類似。同時(shí)含有豐富的螺桿菌和脫硫弧菌等不“健康”菌群，但雅諾馬馬人也保持了很好的健康。城市化水平最低國家--巴布亞新幾內(nèi)亞巴布亞新幾內(nèi)亞處于熱帶海洋性氣候，許多居民仍保留著傳統(tǒng)生活習(xí)慣，堅(jiān)持以農(nóng)業(yè)為基礎(chǔ)的生活方式；巴布亞新幾內(nèi)亞居民腸道菌群多樣性更大、個(gè)體差異性較低。美國居民缺乏近50種細(xì)菌類型，這些細(xì)菌屬于巴布亞新幾內(nèi)亞居民腸道菌群的核心種類；巴布亞新幾內(nèi)亞居民腸道中也含高水平的普氏菌屬。同時(shí)含有豐富的Alistipes

菌和鏈球菌，其雙歧桿菌也很少。這與傳統(tǒng)認(rèn)為的好菌群相反。非洲布基納法索兒童與歐洲兒童腸道菌群布基納法索兒童的飲食是以小米、高粱、黑眼豆和蔬菜為主，其纖維含量為的意大利兒童飲食中的兩倍；布基納法索兒童腸道中也含高水平的普氏菌屬，菌群結(jié)構(gòu)中硬壁菌與擬桿菌比例正好與意大利兒童腸道菌群相反。西伯利亞的勇士--俄羅斯人俄羅斯人處于溫帶，冬季嚴(yán)寒漫長，其典型的膳食是富含淀粉的面包或者土豆作為主要食物來源；俄羅斯人腸道中普遍缺乏普氏菌屬和擬桿菌。有些樣本中雙歧桿菌和乳桿菌占絕對優(yōu)勢，還存在很多古細(xì)菌。這與傳統(tǒng)認(rèn)為的健康優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)不一致。世界各地不同種族腸道菌群構(gòu)成呈現(xiàn)豐富的多樣性，而健康的腸道菌群不止一種模式；因此當(dāng)不同種族人群腸道菌群出現(xiàn)紊亂時(shí)，不應(yīng)該使用同一種益生菌來調(diào)節(jié)腸道菌群健康，不存在一株益生菌適用于全世界各族人民；益生菌產(chǎn)品的開發(fā)一定要以當(dāng)?shù)鼐用衲c道菌群多樣性的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，結(jié)合當(dāng)?shù)鼐用衲c道菌群構(gòu)成特點(diǎn)，篩選出符合當(dāng)?shù)鼐用衲c道菌群特征的益生菌制品。不同種族腸道菌群的啟示1917年，德國AlfredNissle教授從第一次世界大戰(zhàn)士兵的糞便中一株大腸桿菌E.coliNissle1917。這名士兵在一次嚴(yán)重的志賀氏菌大爆發(fā)中沒有發(fā)生小腸炎。在抗生素還沒有被發(fā)現(xiàn)的那個(gè)時(shí)代，Nissle利用這株菌在當(dāng)?shù)刂委熌c道感染疾?。ㄓ缮抽T氏菌和志賀氏菌引發(fā)）取得可觀成果。E.coli

Nissle1917原籍地益生菌成功發(fā)揮益生作用--實(shí)例11923年，法國科學(xué)家亨利·布拉德在東南亞受當(dāng)?shù)赝林用裼脽釒び米骺垢篂a治療的啟發(fā)，從許多熱帶水果（荔枝和莽吉柿）表面分離了酵母菌株Saccharomycesboulardiilyo

（布拉德酵母）。這一菌株在當(dāng)?shù)睾荛L時(shí)間內(nèi)成功對抗腹瀉，成為著名的抗腹瀉菌株。原籍地益生菌成功發(fā)揮益生作用--實(shí)例2“洋”益生菌臨床研究的局限--僅針對原籍地人群根據(jù)現(xiàn)有研究報(bào)道，一些知名的“洋”益生菌如：鼠李糖乳桿菌-GG株（LGG）、乳雙歧桿菌-12株(BB12)以及干酪乳桿菌-Shirota株（LcS）都具有改善胃腸道功能，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的功效。然而上述臨床研究在志愿者征集時(shí)，大多局限于該菌株分離地，而這些菌株針對世界不同區(qū)域種族人群，特別是中國人，是否能夠發(fā)揮相同功效仍未有定論。益生菌作用的分歧--

BifidobacteriumlactisCNCMI-2494而對于益生菌Bifidobacteriumlactis

CNCMI-2494的研究就是個(gè)很好的例證。2011年，一項(xiàng)基于美國志愿者的研究表明，志愿者在服用添加該菌株發(fā)酵的酸奶后腸道菌群結(jié)構(gòu)和群落多樣性并沒有顯著變化；2013年，一項(xiàng)基于該菌株更大規(guī)模美國人群的研究依然表明，志愿者飲用含有該益生菌發(fā)酵的乳制品后腸道內(nèi)優(yōu)勢菌群變化甚微。而2014年一項(xiàng)基于英國曼徹斯特志愿者的研究則表明，該益生菌的攝入可以有效調(diào)節(jié)英國志愿者腸道菌群結(jié)構(gòu)，增加丁酸鹽產(chǎn)生菌的含量并抑制嗜膽菌屬的增殖。益生菌作用的分歧--

BifidobacteriumlactisCNCMI-2494對于同一株益生菌，其益生作用出現(xiàn)這樣的區(qū)別，我們固然可以歸因于三項(xiàng)研究的測序技術(shù)略有差異。但是，更值得我們關(guān)注的是，上述三項(xiàng)研究的志愿者來源于不同的國家區(qū)域，同一株益生菌在不同種族的腸道內(nèi)發(fā)揮的作用大相徑庭。

因此結(jié)合當(dāng)?shù)鼐用衲c道菌群構(gòu)成特點(diǎn)，篩選出符合當(dāng)?shù)鼐用衲c道菌群特征的益生菌制品就顯得格外重要璀璨中華民族的古老智慧--水土問題一方水土養(yǎng)一方人，是中華民族古老的諺語，長期以來在某個(gè)特定的地域逐漸形成的生產(chǎn)方式和生活習(xí)慣長期以來在某個(gè)特定的地域逐漸形成的生產(chǎn)方式和生活習(xí)慣這也是古老的中華民族用自己的智慧和認(rèn)識(shí)，適應(yīng)和改造自然的結(jié)果一方水土養(yǎng)一方腸道菌群中國健康人群腸道微生物構(gòu)成研究

中國作為一個(gè)多民族、地域遼闊和食物多樣的國家，特別是中國人的居住環(huán)境、飲食和生活習(xí)慣均與西方人有較大差異,那么,占世界人口近1/5的中國人群腸道菌群構(gòu)成是一個(gè)什么樣的情況?

在我實(shí)驗(yàn)室前期研究中，共從中國9個(gè)省份采集到漢族、壯族、維吾爾族、哈薩克族、蒙古族、藏族和白族等7個(gè)民族314份健康志愿者的糞便樣品，應(yīng)用焦磷酸測序技術(shù)分析了其中微生物多樣性。

中國健康人群腸道中細(xì)菌主要隸屬于硬壁菌門,擬桿菌門,變形菌門，和放線菌門四個(gè)門，與已報(bào)道的外國人群腸道菌群構(gòu)成類似。其中，考拉桿菌屬，(平均含量＝13.8%)是中國健康人群腸道中含量最多且個(gè)體差異最大的微生物。不同民族的居民其腸道菌群構(gòu)成有明顯區(qū)別。漢族與白族、哈薩克族與維吾爾族居民的腸道菌群構(gòu)成相對相似，而漢族與藏族，維吾爾族居民腸道菌群差異顯著中國健康人群腸道微生物構(gòu)成研究

中國人自己益生乳酸菌的研究與開發(fā)

LactobacilluscaseiZhang是從分離自43份傳統(tǒng)發(fā)酵酸馬奶樣品中的243株乳酸菌中篩選出的1株益生菌，具有降血脂、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、拮抗腸道病原菌生長等益生功能。來源于內(nèi)蒙古錫林郭勒大草原。2008年完成的益生乳酸菌LactobacilluscaseiZhang全基因組的研究是我國第一次獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的乳酸菌全基因組序列。研究發(fā)現(xiàn)L.caseiZhang基因組編碼31個(gè)完整的磷酸轉(zhuǎn)移酶基因復(fù)合體和一個(gè)典型的relBE抗毒素系統(tǒng)，這些有利于該菌株在營養(yǎng)不良環(huán)境中生長圍繞LactobacilluscaseiZhang開展的基礎(chǔ)研究發(fā)表論文85篇授權(quán)專利14項(xiàng)1、分離鑒定與篩選2、基因組與蛋白組研究3、調(diào)節(jié)血壓、血脂及防治肝損傷4、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用5、調(diào)節(jié)腸道菌群并預(yù)防二型糖尿病6、發(fā)酵特性研究益生菌LCZ對腸道菌群的調(diào)節(jié)服用L.caseiZhang14天后，糞便中該菌株含量達(dá)到8.41±0.68lgCFU/g，到28天時(shí)為8.55±0.57lgCFU/g。對于不同年齡的人而言，青年人群糞便中的活菌數(shù)＞老年人群＞中年人群。當(dāng)停止口服L.caseiZhang14天時(shí)糞便中活菌仍然保持在10的5次方數(shù)量級(jí)益生菌LCZ對腸道菌群的調(diào)節(jié)基于焦磷酸測序結(jié)果的聚類分析我們可以看出，服用益生菌LactobacilluscaseiZhang期間各個(gè)年齡段的志愿者腸道菌群構(gòu)成與服用該菌株前比較差異顯著。而當(dāng)志愿者停止服用該益生菌后，其腸道菌群構(gòu)成又恢復(fù)到服用前的結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，中年人服用益生菌LactobacilluscaseiZhang后腸道菌群結(jié)構(gòu)顯著（P<0.001）趨向于青年人，此結(jié)果說明益生菌LactobacilluscaseiZhang可以使中年人腸道菌群結(jié)構(gòu)年輕化！益生菌LCZ對腸道菌群的調(diào)節(jié)服用L.caseiZhang期間志愿者腸道內(nèi)有益菌群（Bifidobacterium

和Lactobacillus）數(shù)量顯著增加,而致病菌以及潛在致病菌（Clostridium,Escherichia

和

Serratia）數(shù)量顯著減少。基于q-PCR定量結(jié)果表明：Bifidobacterium和Atopobiumcluster的數(shù)量顯著增加，Clostridiumgroup的數(shù)量顯著減少，而Bacteroidesgroup數(shù)量變化并不顯著。這一結(jié)果和焦磷酸測序結(jié)果相吻合益生菌LCZ對腸道菌群的調(diào)節(jié)促進(jìn)短鏈脂肪酸的分泌并抑制次級(jí)膽汁酸的形成Zhangetal.2014.FEMSMicrobiolEcol,2014：DOI:10.1111/1574-6941.12328Kwoketal.2014.BenefMicrobes.2014，5（3）：295-304LCZ與腸道菌群的互作

Metagenome&Metatranscriptome為了進(jìn)一步探索益生菌Lactobacilluscasei

Zhang與宿主腸道菌群的相互作用機(jī)制（包括該益生菌對宿主腸道菌群的功能代謝影響，以及該益生菌進(jìn)入腸道后，在腸道環(huán)境選擇壓力的作用下可能發(fā)生的代謝通路應(yīng)激性變化），我們再次征集6名健康志愿者參與該試驗(yàn)。在試驗(yàn)期間，志愿者連續(xù)28天每天服用含有4x1010

LactobacilluscaseiZhang的片劑，并于0天，14天和28天采集志愿者糞便，應(yīng)用宏基因組學(xué)和宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)解析了益生菌與腸道菌群的互作機(jī)制。生物信息學(xué)分析流程LCZ與腸道菌群的互作----腸道菌群物種多樣性改變

基于宏基因組種水平的分析顯示，服用益生菌Lactobacilluscasei

Zhang28天后志愿者腸道菌群在物種多樣性層面上發(fā)生的改變與上述研究結(jié)果一致，均出現(xiàn)有益菌群（Bifidobacterium

和Lactobacillus）數(shù)量顯著增加,而致病菌以及潛在致病菌（Clostridium等）數(shù)量顯著減少的現(xiàn)象。LCZ與腸道菌群的互作----近源乳桿菌多樣性變化對其它近源乳桿菌菌種多樣性無顯著影響

LCZ與腸道菌群的互作----腸道菌群功能基因表達(dá)調(diào)節(jié)服用益生菌后腸道菌群表達(dá)上調(diào)(A)和下調(diào)(B)的COG功能單元及其相關(guān)性經(jīng)過與COG數(shù)據(jù)庫比對注釋，我們發(fā)現(xiàn)服用益生菌Lactobacilluscasei

Zhang后，志愿者腸道菌群與能量代謝和氨基酸代謝相關(guān)的功能基因表達(dá)上調(diào)，表明該益生菌的攝入可以使宿主腸道菌群代謝更加旺盛，進(jìn)而促進(jìn)腸蠕動(dòng)。LCZ與腸道菌群的互作----腸道菌群代謝通路變化經(jīng)過與KEGG數(shù)據(jù)庫比對注釋，我們發(fā)現(xiàn)服用該益生菌后，志愿者腸道菌群參與維生素H合成代謝途徑顯著增強(qiáng)。而維生素H在維護(hù)宿主腸粘膜上皮細(xì)胞完整性以及促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞內(nèi)免疫應(yīng)答能力上扮演重要角色。維生素H合成代謝LCZ與腸道菌群的互作----腸道菌群代謝通路變化益生菌攝入后腸道菌群丙酸鹽及丁酸鹽合成代謝途徑增強(qiáng)，丙酸與丁酸是短鏈脂肪酸的主要成員，可以有效降低慢性炎癥的發(fā)生。該結(jié)果很好的解釋了上述研究中短鏈脂肪酸分泌增強(qiáng)的現(xiàn)象。LCZ與腸道菌群的互作----益生菌功能基因表達(dá)調(diào)節(jié)進(jìn)而我們研究了益生菌進(jìn)入宿主腸道內(nèi)，在腸道環(huán)境選擇壓力下可能發(fā)生的功能基因及代謝通路的改變。通過比較COG功能大類，我們發(fā)現(xiàn)，益生菌Lactobacilluscasei

Zhang進(jìn)入腸道內(nèi)為了生存定植，其參與轉(zhuǎn)錄翻譯、氨基酸合成以及能量代謝的相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。該結(jié)果從機(jī)制層面為該菌株的可定植性和良好耐受性提供了理論支持。LCZ與腸道菌群的互作----益生菌代謝通路變化而基于KEGG具體代謝通路的分析結(jié)果與COG功能基因分析結(jié)果呈現(xiàn)高度的一致性。氨?；鵷RNA合成途徑的增強(qiáng)表明益生菌Lactobacilluscasei

Zhang進(jìn)入腸道后自身轉(zhuǎn)錄翻譯增強(qiáng)，繁殖加快，而在這一過程中需要消耗更多的能量，因此我們觀察到其糖酵解產(chǎn)能代謝途徑相應(yīng)更加旺盛。氨酰tRNA合成增強(qiáng)糖酵解代謝旺盛痛風(fēng)患者腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能研究及其預(yù)測模型的建立痛風(fēng)是一種因嘌呤代謝障礙，由尿酸累積引起的代謝類疾病。本研究共征集

83名志愿者。其中，35名重度痛風(fēng)病患者，33名健康志愿者和15名患有痛風(fēng)病風(fēng)險(xiǎn)的志愿者。本研究旨在分析痛風(fēng)患者與健康人腸道菌群的物種和功能的差異并確認(rèn)關(guān)鍵性生物標(biāo)識(shí)。以此為契機(jī)，構(gòu)建基于痛風(fēng)病患者腸道菌群物種和功能的預(yù)測模型。在方法學(xué)上，我們應(yīng)用16S可變區(qū)焦磷酸測序技術(shù)和基于DNA全序列的metagenome-shotgun測序相結(jié)合的技術(shù)對所有樣品進(jìn)行深度測序?；谖⑸镂锓N和功能的結(jié)構(gòu)性分析均顯示，痛風(fēng)患者和健康人在腸道菌群結(jié)構(gòu)上存在顯著差異，且微生物多樣性顯著低于健康人?；贛etagenomicSpecies(MGS)的分析顯示，和健康人相比，痛風(fēng)患者腸道內(nèi)缺少Faecalibacterium

prausnitzii菌種和Clostridium類丁酸產(chǎn)生菌，卻富含Bacteroides

caccae

和Bacteroides

xylanisolvens

。此外，我們發(fā)現(xiàn)在嘌呤代謝途徑上，痛風(fēng)患者腸道菌群合成嘌呤的能力減弱而代謝嘌呤生成尿酸的能力增強(qiáng)。而且能夠分解尿酸生成尿素的尿囊素酶含量較健康人顯著降低，這些變化最終導(dǎo)致尿酸堆積形成痛風(fēng)疾病。痛風(fēng)患者腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能研究及其預(yù)測模型的建立基于這些差異性物種和功能單元，我們構(gòu)建了預(yù)測痛風(fēng)疾病的微生物模型，以期應(yīng)用該模型準(zhǔn)確的預(yù)測痛風(fēng)疾病的發(fā)生。受試者工作曲線顯示，該預(yù)測模型準(zhǔn)確率高達(dá)82%，這說明該模型可以作為臨床診斷的依據(jù)配合血尿酸指標(biāo)對痛風(fēng)疾病進(jìn)行及時(shí)診療。內(nèi)蒙古錫林郭勒和四川紅原牧區(qū)生態(tài)環(huán)境中微生物多樣性及功能基因研究為探索內(nèi)蒙古錫林郭勒蒙古族牧區(qū)和四川紅原藏族牧區(qū)兩種草原生態(tài)環(huán)境中微生物多樣性及其功能基因組，進(jìn)而回答物種腸道菌群與環(huán)境及物種共進(jìn)化問題，本研究從內(nèi)蒙古牧區(qū)采集該生境中典型生物樣本（蒙古族人，馬，黃牛，山羊，綿羊和土壤）各10份；從紅原牧區(qū)采集藏民，牦牛和土壤樣品各10份，應(yīng)用WholeGenomeShotgun測序和454焦磷酸測序相結(jié)合的技術(shù)對上述樣本進(jìn)行深度測序。通過對菌群多樣性研究發(fā)現(xiàn)：兩種生態(tài)環(huán)境擁有大量共性菌屬。同時(shí)，兩種生境又具有其獨(dú)特的微生物群落結(jié)構(gòu)，例如錫盟生態(tài)環(huán)境中所有生物與土壤共享Blautia菌屬，而紅原地區(qū)生物與土壤共有Prevotella菌