動(dòng)物細(xì)胞工程Ch4課件

細(xì)胞工程云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院林潔

主講linjie@第五章

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)第一節(jié)

體外培養(yǎng)細(xì)胞的無菌操作技術(shù)第二節(jié)

原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)技術(shù)第三節(jié)

貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)技術(shù)第四節(jié)

動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)第五節(jié)

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式第六節(jié)

動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)第七節(jié)

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)污染的檢測(cè)和排除第八節(jié)

動(dòng)物細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇第一節(jié)

體外培養(yǎng)細(xì)胞的無菌操作技術(shù)在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，一旦出現(xiàn)污染，可出現(xiàn)以下的不利影響：污染后雜菌的生長速度超過細(xì)胞生長，使培養(yǎng)環(huán)境完全破壞；污染后雜菌所產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物，可改變培養(yǎng)液的某些理化性質(zhì)；污染雜菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，可直接影響細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)品的質(zhì)量、產(chǎn)量和穩(wěn)定性；污染雜菌將危及細(xì)胞治療產(chǎn)品的安全性；在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)出現(xiàn)的污染，可能造成其他培養(yǎng)物和培養(yǎng)環(huán)境的污染。無菌技術(shù)是體外培養(yǎng)細(xì)胞過程中首要而且絕對(duì)重要的部分，包括3大部分：工作環(huán)境及表面的無菌；細(xì)胞培養(yǎng)用品與培養(yǎng)用液的無菌處理；實(shí)驗(yàn)者的無菌操作。在實(shí)驗(yàn)前要制定好實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和操作程序，有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好；根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，準(zhǔn)備各種所需的器材和物品，消毒后放入培養(yǎng)室；I.培養(yǎng)前的準(zhǔn)備無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅（苯扎溴銨）脫洗地面一次（拖布要專用），紫外線照射消毒30~50min；超凈工作臺(tái)臺(tái)面每次實(shí)驗(yàn)前要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦洗，然后用紫外線消毒30min。一些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺(tái)內(nèi)同時(shí)紫外照射消毒。注意：消毒時(shí)工作臺(tái)面上用品不要過多或重疊放置，否則會(huì)遮擋射線，降低消毒效果；在工作臺(tái)面消毒時(shí)，切勿將培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液同時(shí)照射紫外線。II.培養(yǎng)室和超凈臺(tái)的消毒進(jìn)入無菌培養(yǎng)室原則上必須徹底洗手并按外科手術(shù)要求著裝，無菌服、帽子和口罩每次實(shí)驗(yàn)后都要清洗消毒；開始操作前要用75%酒精或0.2%新潔爾滅消毒手或前臂；如果實(shí)驗(yàn)過程中觸及可能污染的物品或出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。平時(shí)僅做觀察不做培養(yǎng)操作時(shí)，可穿經(jīng)紫外線照射30min的一般清潔工作服。III.洗手與著裝無菌培養(yǎng)操作的重點(diǎn)：細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)在超凈工作臺(tái)里進(jìn)行，一切操作都應(yīng)在火焰近處經(jīng)燒灼進(jìn)行；盡量避免使用先前已打開消毒包裝的物品；培養(yǎng)用液或其他消毒后物品不應(yīng)在工作區(qū)以外打開；培養(yǎng)液開放操作時(shí)，應(yīng)避免衣袖或其他非無菌物品的細(xì)菌掉落到培養(yǎng)液中；在超凈工作臺(tái)中，應(yīng)每次進(jìn)行一種細(xì)胞系的操作，不同的細(xì)胞系應(yīng)使用各自單獨(dú)的培養(yǎng)液，以避免細(xì)胞系的交叉污染；超凈工作臺(tái)在實(shí)驗(yàn)完畢后，應(yīng)盡可能的減少物品堆放，并用適當(dāng)?shù)南疽翰料磁_(tái)面；培養(yǎng)箱定期進(jìn)行消毒處理；在培養(yǎng)過程中進(jìn)行細(xì)胞的常規(guī)檢查監(jiān)測(cè)。IV.無菌培養(yǎng)操作*I.組織塊原代培養(yǎng)法概述該方法是將從動(dòng)物機(jī)體取出的組織剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶，并使組織小塊在培養(yǎng)液中黏附、生長，并從組織小塊中游離出細(xì)胞的技術(shù)過程。組織塊培養(yǎng)法是一種簡便易行且成功率較高的常用原代培養(yǎng)方法。技術(shù)特點(diǎn)操縱簡單、適合于組織量少的原代培養(yǎng)反復(fù)剪切和接種的過程對(duì)組織塊存在損傷，有的組織小塊不能長出細(xì)胞。技術(shù)步驟與注意事項(xiàng)組織塊原代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)取材時(shí)要嚴(yán)格無菌操作，組織樣本要盡量避免紫外線照射和接觸消毒用化學(xué)試劑。取材組織時(shí)，應(yīng)細(xì)心除去組織上帶有的血液、脂肪、神經(jīng)組織、結(jié)締組織和壞死組織，在修剪和切碎過程中，為避免組織干燥，可浸泡于少量培養(yǎng)液中；組織塊接種后1~3天，由于游出細(xì)胞數(shù)少，組織塊的黏附不牢固，在觀察和移動(dòng)過程中要注意動(dòng)作輕巧，盡量不要引起液體的振蕩而產(chǎn)生對(duì)組織塊的沖擊力使其飄起；在原代培養(yǎng)1~2天內(nèi)要特別注意觀察是否有細(xì)菌、霉菌的污染，一旦發(fā)現(xiàn)，要及時(shí)清除，以防給培養(yǎng)箱內(nèi)的其他細(xì)胞帶來污染；原代培養(yǎng)3~5天，需換培養(yǎng)液一次，去除漂浮的組織塊和殘留的血細(xì)胞；原代培養(yǎng)過程中，應(yīng)采用豐富的培養(yǎng)液，最好添加10%~20%的FCS；如組織塊不易貼壁，可預(yù)先在瓶底涂薄層血清、膠原或膽汁等。組織消化法原代培養(yǎng)的技術(shù)步驟30~50倍體積的0.25%胰蛋白酶，37℃消化20~60min過100目孔徑的細(xì)胞篩除掉未充分消化的大塊組織和成分800~1000rpm離心去除胰蛋白酶，用平衡鹽溶液或培養(yǎng)液漂洗1~2次加入培養(yǎng)用液制成細(xì)胞懸液細(xì)胞計(jì)數(shù)，一般按照

接種培養(yǎng)瓶

組織消化法原代培養(yǎng)的注意事項(xiàng)取材與修剪組織的操作的注意點(diǎn)與“組織塊原代培養(yǎng)”相同；胰蛋白酶的消化效果主要與pH、溫度、胰蛋白酶的濃度、組織塊的大小和硬度有關(guān)，因此要根據(jù)具體情況調(diào)整消化液濃度和消化條件；胰蛋白酶消化后，可直接加入含血清的培養(yǎng)液終止消化；而胰蛋白酶與EDTA的混合消化液則必須離心才能除去EDTA；其他的酶如膠原酶、鏈霉蛋白酶、黏蛋白酶、蝸牛酶等也可用于組織消化，需根據(jù)酶的作用特點(diǎn)及組織成分的不同選擇使用；對(duì)于一些纖維成分很少的組織，如腦組織、部分胚胎組織和一些腫瘤組織，可采用機(jī)械法制備細(xì)胞懸液；對(duì)懸浮生長的細(xì)胞，如白血病細(xì)胞、骨髓細(xì)胞和腹水瘤細(xì)胞等可不經(jīng)過消化直接離心分離收集；同樣要注意細(xì)胞生長的常規(guī)監(jiān)測(cè)。第二節(jié)

原代培養(yǎng)與傳代培養(yǎng)技術(shù)2.傳代培養(yǎng)技術(shù)當(dāng)原代培養(yǎng)成功后，細(xì)胞分裂增殖擴(kuò)展成片，占滿培養(yǎng)器皿的表面，這時(shí)需要進(jìn)行分離培養(yǎng)。細(xì)胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程稱為傳代；進(jìn)行一次分離再培養(yǎng)稱為傳一代。根據(jù)細(xì)胞生長類型的不同，傳代培養(yǎng)技術(shù)也可以分為兩類I.貼壁生長細(xì)胞的傳代培養(yǎng)II.懸浮生長細(xì)胞的傳代培養(yǎng)I.貼壁生長細(xì)胞的傳代培養(yǎng)貼壁生長細(xì)胞的傳代培養(yǎng)使用消化法傳代。技術(shù)步驟S1:吸除或倒掉培養(yǎng)器皿內(nèi)舊的培養(yǎng)液S2:加入適量消化液S3:37℃或室溫環(huán)境下消化2~5min后，顯微鏡下觀察，若發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大后，應(yīng)立即終止消化S4:加入含血清培養(yǎng)液（只有胰蛋白酶）或離心漂洗（含有EDTA），終止消化S5:用彎頭吸管吸取器皿內(nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液S6:細(xì)胞計(jì)數(shù)，并接種于新的培養(yǎng)器皿內(nèi)II.懸浮生長細(xì)胞的傳代培養(yǎng)懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)代是不必采用酶消化方法，而可離心收集細(xì)胞后傳代。技術(shù)步驟S1:將細(xì)胞連同培養(yǎng)液一并轉(zhuǎn)到離心管內(nèi)，800~1000rpm，離心5min，棄上清S2:加入新鮮的培養(yǎng)液到離心管內(nèi)，用吸管吹打，制備細(xì)胞懸液S3:細(xì)胞計(jì)數(shù)，并接種于新的培養(yǎng)器皿內(nèi)，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)有時(shí)也可直接傳代，即讓懸浮細(xì)胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清吸掉1/2~2/3，然后用吸管吹打形成細(xì)胞懸液后，再傳代。第三節(jié)

貼壁培養(yǎng)與懸浮培養(yǎng)技術(shù)2.懸浮培養(yǎng)技術(shù)[定義]是指細(xì)胞自由地懸浮于培養(yǎng)液內(nèi)生長繁殖的一種培養(yǎng)方法。[適用范圍]一切非貼壁依賴性細(xì)胞或兼性貼壁細(xì)胞，例如雜交瘤細(xì)胞和小鼠骨髓瘤細(xì)胞（SP2/0，NSO），對(duì)于部分適于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞（如CHO和BHK細(xì)胞）可通過細(xì)胞生長形式的馴化，使其適應(yīng)于懸浮培養(yǎng)。[優(yōu)點(diǎn)]細(xì)胞傳代時(shí)無需消化，避免了操作對(duì)細(xì)胞的損害；細(xì)胞收率高；操作簡便、工藝可控性強(qiáng)、培養(yǎng)條件均一、易于放大培養(yǎng)規(guī)模。[缺點(diǎn)]細(xì)胞培養(yǎng)體積較大，相對(duì)細(xì)胞密度低，設(shè)備資金投入大；適用面窄；不適于包括二倍體細(xì)胞在內(nèi)的正常組織細(xì)胞培養(yǎng)，具有轉(zhuǎn)化致癌的可能；第四節(jié)

動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是建立在貼壁培養(yǎng)技術(shù)和懸浮培養(yǎng)技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，主要包括以下幾種常用技術(shù)：1.動(dòng)物細(xì)胞的深層懸浮培養(yǎng)技術(shù)2.微載體培養(yǎng)技術(shù)3.微囊化培養(yǎng)技術(shù)4.中空纖維法培養(yǎng)2.微載體培養(yǎng)技術(shù)1967年，凡-維茨爾開發(fā)了微載體系統(tǒng)培養(yǎng)貼壁細(xì)胞，在一定程度上解決了“貼壁培養(yǎng)難于放大的技術(shù)障礙”。微載體是直徑為60~250微米的微珠，最初使用的材料是用一種離子交換樹脂（DEAE-SephadexA-50）做基質(zhì)，后經(jīng)改進(jìn)，用帶不同基團(tuán)的葡聚糖交聯(lián)成幾種大分子，使其帶有適當(dāng)電荷，以利于細(xì)胞的貼壁及生長。表面積與體積之比（S/V）大，因此它的單位體積培養(yǎng)基的細(xì)胞產(chǎn)率高，培養(yǎng)基利用率高，若提高微載體濃度，細(xì)胞產(chǎn)率會(huì)更大。勞動(dòng)強(qiáng)度小、培養(yǎng)系統(tǒng)占有空間小、生產(chǎn)規(guī)模放大容易。把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，具有兩種培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)。用簡便的顯微鏡觀察即能監(jiān)測(cè)出細(xì)胞在微珠生長情況。收獲細(xì)胞及胞外產(chǎn)物的過程不復(fù)雜。微載體培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)細(xì)胞的技術(shù)步驟S1:選擇合適的微載體類型（通過計(jì)算不同微載體的細(xì)胞貼壁率和細(xì)胞數(shù)，比較細(xì)胞容納量，微載體用量和攪拌速度）S2:微載體的浸泡水化及消毒（無鈣和鎂的PBS浸泡、洗滌和消毒；使用時(shí)微載體濃度一般為3mg/100ml，攪拌速度為50~70r/min）S3:細(xì)胞接種（根據(jù)細(xì)胞類型決定接種濃度）S4:培養(yǎng)觀察與計(jì)數(shù)（直接鏡下觀察細(xì)胞在載體表面的生長情況，并用胰蛋白酶消化后，測(cè)每毫升培養(yǎng)體系中的細(xì)胞數(shù)）S5:消化（收集培養(yǎng)體系，洗去已酸化的培養(yǎng)液，用50~100ml/g微載體的消化液消化，按20~30ml/g微載體的比例加入血清終止消化）S6:分離細(xì)胞（分組沉降、400rpm低速離心或100微米篩網(wǎng)過濾）S7:傳代培養(yǎng)（若需進(jìn)一步傳代以放大培養(yǎng)，可向脫離微載體的細(xì)胞加入新的微載體）用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的微載體的定義和種類微載體是指直徑在60~250微米、適用于細(xì)胞貼壁生長的固體或半固體實(shí)心微球，以及不僅適用于貼壁依賴型細(xì)胞也可用于非貼壁依賴型細(xì)胞的固定化培養(yǎng)的內(nèi)部具有完全連通溝回的多孔微載體。隨著微載體培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，商品化的微載體的種類越來越多，按其機(jī)制材料可以劃分為：交聯(lián)葡聚糖微載體塑料微載體明膠/變性膠原微載體玻璃微載體纖維素微載體理想的微載體所應(yīng)具有的特征生物相容性好簡便的無毒害固定化過程良好的傳質(zhì)特性良好的機(jī)械穩(wěn)定性最大的比表面積適合細(xì)胞生長的形狀和大小粒徑分布均一能高壓滅菌可重復(fù)利用，易于清洗能保護(hù)細(xì)胞免受機(jī)械損傷接種方便能固定大部分細(xì)胞適合大規(guī)模培養(yǎng)易使細(xì)胞、載體和培養(yǎng)基分離適合于貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)3.微囊化培養(yǎng)技術(shù)微囊是一種用人造的半透膜制成的多孔微球體，小分子物質(zhì)可以自由透過，而各種酶和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)可包裹在其中不能溢出，利用它們催化反應(yīng)底物。微囊化培養(yǎng)技術(shù)的定義與優(yōu)點(diǎn)是借鑒固定化技術(shù)將細(xì)胞包裹在微囊中，在培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)；細(xì)胞生長在各自的微小環(huán)境里受到一定的保護(hù)，細(xì)胞總的生長體積有一定的增加，而且減少了攪拌對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的剪切力；由于環(huán)境的改善，細(xì)胞會(huì)很好的生長，細(xì)胞密度和純度提高；是一種利于生產(chǎn)分泌型胞外產(chǎn)物（如單抗）的大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)；不僅適合于非貼壁依賴型細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，同時(shí)也適合貼壁依賴型細(xì)胞；微囊化培養(yǎng)的細(xì)胞還能作為治療性人工器官或腫瘤藥物的體內(nèi)篩選。微囊化細(xì)胞的模式圖自本世紀(jì)60年代固定化酶技術(shù)問世以來，用微囊化方法包埋生物大分子及細(xì)胞的方法很多，但并不是所有的方法都能適合于動(dòng)物細(xì)胞的，它必須具備以下一些條件：微囊化的過程要溫和，快速，不損傷細(xì)胞，盡可能在液體狀態(tài)和生理?xiàng)l件下制備；微囊化所用的試劑和膜材料必須對(duì)細(xì)胞無毒害作用；微囊化所形成的膜必須能使?fàn)I養(yǎng)物和代謝產(chǎn)物自由通過，膜的孔徑可以控制；膜應(yīng)具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度以抵抗培養(yǎng)過程中的攪拌，不至使微囊破裂；微囊的大小應(yīng)當(dāng)適中，直徑一般控制在200~400微米范圍?？傆^目前的方法用得最多的是海藻酸-聚賴氨酸（ALG-PLL）包埋法。動(dòng)物細(xì)胞微囊化需具備的條件動(dòng)物細(xì)胞微囊化的技術(shù)步驟（ALG-PLL法）S1:將分離好的細(xì)胞懸浮在1%~1.2%的海藻酸鈉溶液中（保證與細(xì)胞等滲及等生理pH），細(xì)胞終濃度達(dá)到1×107cell/ml。S2:細(xì)胞懸浮液經(jīng)微囊發(fā)生器制成微粒微球，將微球加入1.3%CaCl2溶液后制成凝膠球，10min后，去除上清收集膠球，并用生理鹽水緩沖液清洗S3:加入0.05%的聚賴氨酸，微球膠體顆粒表面包裹一層膜形成微囊，用生理鹽水緩沖液洗兩次S4:將微囊懸浮于0.06%的海藻酸鈉溶液中反應(yīng)5min，用生理鹽水緩沖液漂洗S5:用1.5%的檸檬酸鈉處理8~10min，重復(fù)處理一次，用生理鹽水緩沖液洗滌3次S6:將含有細(xì)胞的微囊放入培養(yǎng)液中培養(yǎng)PS：通過控制賴氨酸的濃度、與海藻酸鈉球混合的時(shí)間、溶液的pH和溫度等條件，能夠制備孔徑大小不同的微囊化細(xì)胞。4.中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的產(chǎn)生中空纖維培養(yǎng)技術(shù)是理查德-克瑞克等在1972年發(fā)明的，最初使用的空心纖維是一種由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的可透性膜，表面有許多海綿狀多孔結(jié)構(gòu)。這樣，水分子、營養(yǎng)物質(zhì)和氣體可以透過，細(xì)胞也能在上面貼附生長。目前已開發(fā)出由硅膠、聚砜、聚丙烯等材料構(gòu)建的空心纖維培養(yǎng)系統(tǒng)中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的原理模擬機(jī)體內(nèi)組織器官的供血系統(tǒng)，利用具有通透性的中空纖維或稱毛細(xì)管作為維持細(xì)胞正常代謝的物質(zhì)通道而建立的一種動(dòng)物細(xì)胞體外大規(guī)模培養(yǎng)方法；中空纖維切面電鏡圖譜中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的原理中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)由于中空纖維能夠給外腔細(xì)胞提高營養(yǎng)清除代謝物，因此能夠十分方便的分離和純化培養(yǎng)細(xì)胞分泌的產(chǎn)品，在生產(chǎn)激素和單抗時(shí)經(jīng)常采用。中空纖維培養(yǎng)技術(shù)無機(jī)械剪切，物質(zhì)傳遞效率高，能有效提高細(xì)胞和產(chǎn)物水平。中空纖維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的局限性中空纖維反應(yīng)器中營養(yǎng)物質(zhì)沿流向的梯度衰減；（加大流速，縮短長度）靠近膜的部位的細(xì)胞得以優(yōu)勢(shì)生長，當(dāng)細(xì)胞長到一定的密度時(shí)，細(xì)胞富集在膜表面，往往造成膜孔堵塞，遠(yuǎn)離膜的細(xì)胞得不到足夠的營養(yǎng)物質(zhì)和氧而生長緩慢或死亡；（采用雙腔中空纖維反應(yīng)器）在使用過程中，大分子易堵塞膜，中空纖維反應(yīng)器不能重復(fù)使用。第五節(jié)

動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的操作方式無論是貼壁細(xì)胞還是懸浮細(xì)胞，就操作方式而言，動(dòng)物細(xì)胞的深層培養(yǎng)可分為下列5種操作方式：1.分批式（Batch）2.流加式（Fed-Batch）3.半連續(xù)式（Semi-continuous）4.連續(xù)式（Continuous）5.灌注式（Perfusion）不同的操作方式，具有不同的特征。1.分批式培養(yǎng)基本概念分批式培養(yǎng)是指將細(xì)胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)，進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長，產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過一段時(shí)間反應(yīng)后，將整個(gè)反應(yīng)系取出的細(xì)胞培養(yǎng)操作方式。細(xì)胞生長情況細(xì)胞生長分為四個(gè)期：延遲期、生長期、穩(wěn)定期和衰退期特點(diǎn)分批式操作，操作簡便，容易掌握，是常用的操作方式。細(xì)胞所處的環(huán)境時(shí)刻都在發(fā)生變化，不能使細(xì)胞自始至終處于最優(yōu)條件下，并不是一種好的操作方式。2.流加式培養(yǎng)基本概念流加式培養(yǎng)是指先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，在適宜條件下接種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長，產(chǎn)物也不斷形成。隨著細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，新的營養(yǎng)成分不斷補(bǔ)充至反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞進(jìn)一步生長代謝，到反應(yīng)終止時(shí)取出整個(gè)反應(yīng)系；從控制角度可分為無反饋控制流加和有反饋控制流加兩種；最常見的流加物質(zhì)是葡萄糖、谷氨酰胺、氨基酸、維生素和其他細(xì)胞生長所需物質(zhì)。特點(diǎn)

流加培養(yǎng)可以根據(jù)細(xì)胞生長速率、營養(yǎng)物消耗和代謝產(chǎn)物抑制情況，流加營養(yǎng)培養(yǎng)液。一方面，它可以避免某種營養(yǎng)成分的初始濃度過高而出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象，另一方面，能防止某些限制性營養(yǎng)成分在培養(yǎng)過程中被耗盡而影響細(xì)胞的生長和產(chǎn)物的形成；由于新鮮培養(yǎng)液的加入，整個(gè)過程中反應(yīng)體積是變化的，因此常使用濃縮培養(yǎng)液；根據(jù)不同情況，存在不同的流加方式無反饋控制流加包括定流量流加和間斷流加等。有反饋控制流加，一般是連續(xù)或間斷地測(cè)定系統(tǒng)中限制性營養(yǎng)物質(zhì)的濃度，并以此為控制指標(biāo)，來調(diào)節(jié)流加速率或流加液中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度等。3.半連續(xù)式培養(yǎng)基本概念半連續(xù)式培養(yǎng)又稱為反復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)，是指在分批式操作的基礎(chǔ)上，不全部取出反應(yīng)系，剩余部分重新補(bǔ)充新的營養(yǎng)成分，再按分批式操作的方式進(jìn)行培養(yǎng)，反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變的操作方式。特點(diǎn)培養(yǎng)物體積逐步增加；可進(jìn)行多次收獲；細(xì)胞可持續(xù)對(duì)數(shù)生長；培養(yǎng)可延續(xù)很長時(shí)間。這種操作方式可以反復(fù)收獲培養(yǎng)液，對(duì)于培養(yǎng)基因工程動(dòng)物細(xì)胞分泌有用產(chǎn)物或病毒培養(yǎng)過程比較實(shí)用，尤其是微載體培養(yǎng)系統(tǒng)更是如此。例如，采用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)基因工程rCHO細(xì)胞，待細(xì)胞長滿微載體后，可反復(fù)收獲細(xì)胞分泌的乙肝表面抗原（HBsAg）制備乙肝疫苗。4.連續(xù)式培養(yǎng)基本概念連續(xù)式培養(yǎng)，是指將細(xì)胞種子和培養(yǎng)液一起加入反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)液不斷加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，使反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。特點(diǎn)連續(xù)培養(yǎng)可以控制細(xì)胞所處的環(huán)境條件長時(shí)間的穩(wěn)定，可以使細(xì)胞維持在優(yōu)化狀態(tài)下，促進(jìn)細(xì)胞生長和產(chǎn)物形成；可以連續(xù)不斷地收獲產(chǎn)物，并能提高細(xì)胞密度，在生產(chǎn)中被應(yīng)用于培養(yǎng)非貼壁依賴性細(xì)胞。如英國Celltech公司采用連續(xù)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞的方法，連續(xù)不斷地大量生產(chǎn)單克隆抗體。對(duì)于細(xì)胞的生理或代謝規(guī)律的研究，連續(xù)培養(yǎng)是一種重要的手段。5.灌注培養(yǎng)基本概念灌注式操作是指細(xì)胞接種后進(jìn)行培養(yǎng)，一方面新鮮培養(yǎng)基不斷加入反應(yīng)器，一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，但細(xì)胞留在反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞處于一種不斷的營養(yǎng)狀態(tài)。特點(diǎn)灌注培養(yǎng)方式的細(xì)胞截流系統(tǒng)可使細(xì)胞保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細(xì)胞濃度，一般可達(dá)107~108個(gè)／m1，從而提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量;連續(xù)灌注系統(tǒng),使細(xì)胞穩(wěn)定的處于較好的營養(yǎng)環(huán)境中,有害代謝廢物濃度積累較低;反應(yīng)速率容易控制,培養(yǎng)周期較長,可提高生產(chǎn)率,目標(biāo)產(chǎn)品的回收率高;產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短,可及時(shí)回收并在低溫下保存,有利于保持產(chǎn)品的活性;在病毒、單克隆抗體等胞外生物活性生物制品的大規(guī)模產(chǎn)生中，灌注培養(yǎng)可以不斷地收獲產(chǎn)物，特別是采用無血清/無蛋白培養(yǎng)基時(shí)，能夠?qū)⑸a(chǎn)和分離在線偶聯(lián)。第六節(jié)

動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)由于動(dòng)物細(xì)胞沒有細(xì)胞壁、非常脆弱、對(duì)剪切敏感以及對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境有嚴(yán)格的要求，傳統(tǒng)的微生物發(fā)酵反應(yīng)器不適用于動(dòng)物細(xì)胞的大量培養(yǎng)，因而對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用反應(yīng)器的設(shè)計(jì)和過程控制提出了特殊的要求。1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器應(yīng)具備的基本要求2.幾種新型生物反應(yīng)器3.動(dòng)物細(xì)胞體外放大培養(yǎng)的主要階段4.生物反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)5.動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)的應(yīng)用1.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器應(yīng)具備的基本要求一臺(tái)生物反應(yīng)器的設(shè)計(jì)必須具備如下的6個(gè)基本要求：生物因素：生物反應(yīng)器必須有很好的生物相容性，反應(yīng)器內(nèi)空間利用率高，具有合適細(xì)胞生長的載體系統(tǒng)和材料。化學(xué)因素：設(shè)計(jì)必須提供足夠的停留時(shí)間，完成所需要的轉(zhuǎn)化度，符合過程反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的要求。傳質(zhì)因素：混合系統(tǒng)設(shè)計(jì)應(yīng)能提供均勻、溫和的混合培養(yǎng)狀態(tài)剪切力小，保證良好的傳質(zhì)效果。傳熱因素：能夠精確地控制溫度。安全因素：有毒害的反應(yīng)物和產(chǎn)物的隔離，能夠嚴(yán)格地保證無污染環(huán)境。操作因素：能夠方便、快捷地實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)液的連續(xù)添加、樣品的采樣和觀察；能夠精確地控制酸堿度、溶解氧和CO2濃度等工藝條件。

2.幾種新型生物反應(yīng)器常見的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器有：氣升式生物反應(yīng)器攪拌式生物反應(yīng)器中空纖維生物反應(yīng)器A.氣升式生物反應(yīng)器[工作原理]

氣體混合物從底部的氣體分布器進(jìn)入反應(yīng)器的導(dǎo)流管，使導(dǎo)流管內(nèi)的流體密度低于其他區(qū)域，從而形成循環(huán)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)一般采用內(nèi)循環(huán)式。[特點(diǎn)]

器內(nèi)無機(jī)械運(yùn)動(dòng)部件，由剪切力導(dǎo)致的細(xì)胞損傷率比較小；氧傳遞速率高；液體循環(huán)量達(dá)，傳質(zhì)性好；通氣產(chǎn)生的氣泡對(duì)細(xì)胞有損傷。[應(yīng)用]

懸浮細(xì)胞（如雜交瘤）的培養(yǎng)。[設(shè)計(jì)要求]

底物的氣體分布器為環(huán)形管，孔的設(shè)計(jì)要保證在控制的氣速范圍內(nèi)產(chǎn)生的氣泡直徑為1~200mm，空氣流速一般控制在0.01~0.06L/min，反應(yīng)器的高徑比一般為3:1~12:1。B.攪拌式生物反應(yīng)器[工作原理]

利用機(jī)械攪拌產(chǎn)生反應(yīng)器內(nèi)流體的循環(huán)混合。[特點(diǎn)]

參數(shù)的放大和過程控制，比其他培養(yǎng)系統(tǒng)容易理解和掌握。[應(yīng)用]

該類生物反應(yīng)器是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)工藝中使用最多的一種，特別是重組治療性蛋白和抗體的規(guī)?；a(chǎn)；還可用于固定化細(xì)胞的培養(yǎng)。[設(shè)計(jì)要求]

攪拌器轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)產(chǎn)生的剪切力小，混合性能好；深層通氣而不產(chǎn)生泡沫C.中空纖維生物反應(yīng)器[工作原理]

把細(xì)胞限制在具有半透膜性質(zhì)的中空纖維外壁生長，培養(yǎng)液從中空纖維管中流過，細(xì)胞通過半透膜獲得營養(yǎng)物質(zhì)和氧。[應(yīng)用]應(yīng)用廣泛，特別是胞外產(chǎn)物的大規(guī)模生產(chǎn)。[特點(diǎn)]

易操作、穩(wěn)定；中空纖維的過濾功能有利于培養(yǎng)過程的營養(yǎng)控制、細(xì)胞的生長和產(chǎn)物的回收；通過兩個(gè)或多個(gè)的反應(yīng)器組合，可實(shí)現(xiàn)反應(yīng)與分離的耦合。[設(shè)計(jì)要求]

營養(yǎng)物質(zhì)沿流向的梯度衰減會(huì)造成管式中空纖維反應(yīng)器的細(xì)胞分布不均勻，限制培養(yǎng)系統(tǒng)的進(jìn)一步放大。3.動(dòng)物細(xì)胞放大培養(yǎng)的主要階段所謂大規(guī)模培養(yǎng)的“大”就是指細(xì)胞培養(yǎng)的放大大，通常是指生產(chǎn)規(guī)模的增大和生產(chǎn)能力的增加。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)由實(shí)驗(yàn)室建立的細(xì)胞株到反應(yīng)器的大規(guī)模培養(yǎng)一般經(jīng)歷5個(gè)不同的階段：第一階段是篩選和開發(fā)能表達(dá)所需產(chǎn)物的細(xì)胞系。這一階段通常涉及到重組DNA技術(shù)和細(xì)胞融合技術(shù)以期獲得一個(gè)有較高生長速率、較強(qiáng)的抗誘變性能、很高的專一表達(dá)水平和生產(chǎn)速率的細(xì)胞株。第二階段是在方瓶或轉(zhuǎn)瓶中確定該細(xì)胞系對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)和環(huán)境的要求。第三階段是將細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)入生物反應(yīng)器中進(jìn)行，最理想的是采用由生產(chǎn)規(guī)模的反應(yīng)器縮小的臺(tái)式反應(yīng)器，通常為15L。對(duì)細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)要求和環(huán)境條件參數(shù)要進(jìn)行驗(yàn)證和修正，確定最佳的操作方式（如分批、流加、半連續(xù)、連續(xù)或灌注操作）。放大的過程從這一階段開始。第四階段在中試規(guī)模進(jìn)一步根據(jù)生產(chǎn)的實(shí)際條件和可能性，確定過程的控制方案，根據(jù)細(xì)胞株的實(shí)際情況尋求過程的優(yōu)化方案，對(duì)培養(yǎng)的環(huán)境作進(jìn)一步的調(diào)整。這一階段是把實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果引向生產(chǎn)水平過程中所必需的，其中包含有許多在轉(zhuǎn)入生產(chǎn)規(guī)模時(shí)所必須解決的工程問題。第五階段是擴(kuò)大到生產(chǎn)規(guī)模，所用的反應(yīng)器是生產(chǎn)規(guī)模的，但是還必須與中試過程密切結(jié)合，在生產(chǎn)規(guī)模中尚需解決的問題可以和中試車間的試驗(yàn)相結(jié)合，以最終實(shí)現(xiàn)由實(shí)驗(yàn)室研究轉(zhuǎn)入工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。4.生物反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)動(dòng)物細(xì)胞的放大培養(yǎng)受到很多因素的限制，因此在動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)時(shí)應(yīng)重點(diǎn)注意：培養(yǎng)基細(xì)胞系細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境細(xì)胞的死亡與調(diào)亡污染控制培養(yǎng)的過程控制A.培養(yǎng)基動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基是細(xì)胞賴以生長、繁殖、分化的重要因素，也是影響動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的關(guān)鍵要素。無血清培養(yǎng)基的應(yīng)用和開發(fā)是當(dāng)前細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的一大課題。無血清培養(yǎng)基能避免血清的批次、質(zhì)量、成分等對(duì)細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)造成的污染、毒性作用和質(zhì)量不穩(wěn)定等不良的影響；在生產(chǎn)疫苗、單抗和各種生物活性蛋白等生物制品的應(yīng)用領(lǐng)域中，優(yōu)化無血清培養(yǎng)基的成分可使不同的細(xì)胞在最有利于細(xì)胞生長和表達(dá)目的產(chǎn)物的環(huán)境中維持高密度培養(yǎng)，同時(shí)產(chǎn)出的產(chǎn)物容易回收；但無血清培養(yǎng)基不適用于廣泛的細(xì)胞類型，需要條件摸索。B.細(xì)胞系穩(wěn)定、高產(chǎn)、安全的細(xì)胞系是決定動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的根本要素。通過建立原始細(xì)胞庫、主細(xì)胞庫和生產(chǎn)細(xì)胞庫三級(jí)細(xì)胞庫系統(tǒng)以及相關(guān)的細(xì)胞背景資料及核準(zhǔn)手續(xù)，保證大規(guī)模生產(chǎn)的穩(wěn)定、高產(chǎn)、高質(zhì)和安全；通過生物技術(shù)方法建立能夠高效表達(dá)外源基因并正確加工表達(dá)產(chǎn)物的基因工程細(xì)胞系，能夠提高整個(gè)表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)率；通過生物技術(shù)方法改變細(xì)胞代謝途徑，從而使細(xì)胞能夠在無血清（甚至是無蛋白）的培養(yǎng)基中大規(guī)模培養(yǎng)和生產(chǎn)。C.細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，由于大量細(xì)胞的代謝，細(xì)胞環(huán)境發(fā)生改變，許多限制性因素的產(chǎn)生和積累都會(huì)限制細(xì)胞的放大培養(yǎng)的生產(chǎn)。常見的限制性因素有：氨離子（氨離子的積累會(huì)影響細(xì)胞生長和蛋白的糖基化過程）乳酸（糖代謝產(chǎn)物，乳酸的積累會(huì)抑制能量的產(chǎn)生，影響細(xì)胞生長）CO2（CO2

的積聚，會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，改變細(xì)胞的代謝水平，影響pH）甲基乙二醛（脂類和氨基酸代謝的產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞有潛在損傷）滲透壓（高滲透壓能提高目的蛋白的表達(dá)水平，加入滲透壓保護(hù)劑穩(wěn)定細(xì)胞）可利用的生長表面積（微載體、多孔載體）上述培養(yǎng)環(huán)境中的限制性因素不僅可以通過培養(yǎng)基組成來調(diào)節(jié)，同時(shí)操作方式的改變（連續(xù)、灌注）等過程的調(diào)控確能起到十分好的效果。D.細(xì)胞的死亡和調(diào)亡大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的后期，維持細(xì)胞高的活力是富有挑戰(zhàn)性的課題。最初認(rèn)為此時(shí)的細(xì)胞死亡大多由于壞死，而逐漸認(rèn)識(shí)到一些細(xì)胞系在生物反應(yīng)器中死亡主要原因是細(xì)胞凋亡，目前認(rèn)為細(xì)胞凋亡的發(fā)生是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過程的重要制約環(huán)節(jié)，預(yù)防并控制細(xì)胞凋亡也就成為了研究熱點(diǎn)：用基因工程方法將細(xì)胞凋亡抑制基因（如bcl-2基因）導(dǎo)入細(xì)胞；由于細(xì)胞凋亡/死亡多是在營養(yǎng)成分耗盡、有毒代謝產(chǎn)物增多時(shí)發(fā)生，因此可以通過培養(yǎng)操作方式的改變，使細(xì)胞達(dá)到生長平衡態(tài)。E.污染的控制動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物可能被各種微生物病毒污染。這些污染物的來源包括細(xì)胞種子、血清、試劑、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和操作人員。污染的控制起始于細(xì)胞種子及其保存。對(duì)凍存細(xì)胞必須嚴(yán)格測(cè)試證明其無污染。某些組分如血清或胰酶（用在貼壁生長細(xì)胞的傳代培養(yǎng)）可能被支原體或病毒污染。有些污染物難以被過濾除菌除去，故可高溫滅菌的培養(yǎng)基應(yīng)運(yùn)而生。實(shí)驗(yàn)室或中試車間需要有快速、靈敏和價(jià)廉的測(cè)試方法檢定支原體和病毒等常見的細(xì)胞培養(yǎng)污染物。在生產(chǎn)過程或?qū)嶒?yàn)室空間中，完全沒有微生物的污染是不可能的，這需通過改進(jìn)設(shè)備的設(shè)計(jì)消除這些污染源，其中反應(yīng)器的設(shè)計(jì)是關(guān)鍵。實(shí)驗(yàn)人員也常是重要的污染源，無菌操作技術(shù)的良好訓(xùn)練是污染控制的基礎(chǔ)。F.培養(yǎng)的過程控制大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中由于大量細(xì)胞的代謝，細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境迅速改變，過程在線監(jiān)控非常重要。在線測(cè)定生物反應(yīng)器中培養(yǎng)條件、代謝產(chǎn)物和目的產(chǎn)物濃度等大量數(shù)據(jù)，并對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析處理，及時(shí)對(duì)培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行反饋性控制是成功進(jìn)行大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的需要細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的監(jiān)控（溫度、pH、溶氧、滲透壓、CO2）產(chǎn)物濃度的在線監(jiān)控（在線取樣與層析技術(shù)偶聯(lián)，蛋白含量和性質(zhì)鑒定）5.動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)的應(yīng)用利用生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)具有重要醫(yī)用價(jià)值的酶、生長因子、疫苗和單抗等已成為生物醫(yī)藥高技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要部分：目前動(dòng)物細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)生產(chǎn)的生物制品主要有以下幾類：病毒疫苗（乙肝疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、狂犬疫苗）非抗體免疫調(diào)節(jié)劑（干擾素、白細(xì)胞介素、B細(xì)胞生長因子、巨噬細(xì)胞激活因子等）多肽生長因子（神經(jīng)生長因子、成纖維生長因子、表皮生長因子、血清生長因子等）酶類（組織纖溶酶原激活劑等）激素（紅細(xì)胞生成素、促黃體生成素、促濾胞素等）腫瘤特異性抗原（癌胚抗原、甲胎抗原等）單克隆抗體病毒殺蟲劑（桿狀病毒等）1996年至1997年使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系生產(chǎn)的獲得

許可的診斷用重組生物制品（BLA）產(chǎn)品BLA名稱生產(chǎn)商批準(zhǔn)日期產(chǎn)品類型細(xì)胞系方法培養(yǎng)基人I，II型T淋巴病毒／AbbottHTLV-1/HTLV-2EIATM（用于酶免疫分析）AbbottLaboratories8/15/1997鼠單克隆抗體，鼠／人IgG1慢性感染的人T和B淋巴細(xì)胞未公開未公開Capromabpendtide/ProstaScintTM（癌癥造影劑）Cytogen10/28/1996單克隆抗體（mAb）鼠雜交細(xì)胞系中空纖維無血清，含牛血清白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白Nofetumomab/VerlumaTM（癌癥造影劑）DrKarlThomae8/20/1996單克隆抗體（mAb），鼠抗IgG1哺乳動(dòng)物細(xì)胞未公開無血清Imciromabpentetate/MyoscintTM（心臟造影劑）Centocor7/3/1996單克隆抗體（mAb），鼠抗IgG2bFab片段鼠雜交瘤細(xì)胞系未公開含血清，含慶大霉素1997年至1998年使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系生產(chǎn)的獲得

許可的疫苗及細(xì)胞用重組生物制品（BLA）產(chǎn)品BLA名稱生產(chǎn)商批準(zhǔn)日期產(chǎn)品類型細(xì)胞系方法培養(yǎng)基Rotavirus疫苗（狂犬病疫苗）WyethLaboratories8/31/1998活病毒疫苗FRh1-2未公開培養(yǎng)基中含胎牛血清，新霉素硫酸鹽和兩性霉素Rabavert用于狂犬病的免疫ChironBehring10/20/1997疫苗未公開未公開未公開甲肝疫苗滅活／VaQTATM（用于預(yù)防甲型肝炎）Merck&Co3/29/1996滅活病毒人MRC－5二倍體細(xì)胞貼壁，NCF到Costar培養(yǎng)管，連續(xù)補(bǔ)料培養(yǎng)含血清自體培養(yǎng)軟骨細(xì)胞／CarticelSMServicesTM（修復(fù)軟骨性缺陷）Genzymetissue8/22/1997自體同源細(xì)胞軟骨細(xì)胞組織培養(yǎng)瓶含血清1998年至1999年使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系生產(chǎn)的獲得

許可的治療用重組生物制品（BLA）產(chǎn)品BLA名稱生產(chǎn)商批準(zhǔn)日期產(chǎn)品類型細(xì)胞系方法培養(yǎng)基－n1干擾素lymphoblastoid/WellferonTM（治療慢性丙型肝炎）WellcomeFoundationLiminted,3/25/1999內(nèi)源糖蛋白人淋巴細(xì)胞未公開未公開血凝因子VIIa（重組）／NovoSevenTM（用于治療A型和B型血友?。㎞ovoNordiskA/S3/25/1999重組糖蛋白BHK未公開含新生牛血清Etanercept/EnbrelTM（治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎）Immunex11／2／1998IgG1與TNF受體融合CHO攪拌釜式反應(yīng)器，懸浮未公開Trastuzmmab/HerceptinTM（治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌）Genentech9/25/1998單克隆抗體（mAb)帶有鼠CDRs的人源化IgG1CHO攪拌釜式反應(yīng)器，懸浮無血清，含慶大霉素Infliximab/RemicadeTM（治療局部性回腸炎）Centocor8/24/1998單克隆抗體（mAb),鼠／人嵌合抗體IgG1鼠雜交瘤細(xì)胞系重組NSO攪拌釜反應(yīng)器，懸浮，灌流培養(yǎng)（旋轉(zhuǎn)過濾器）無血清，含蛋白水解物，牛轉(zhuǎn)鐵蛋白，胰島素，血清白蛋白和ExcyteTM1996年至1998年使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系生產(chǎn)的獲得

許可的治療用重組生物制品（BLA）產(chǎn)品BLA名稱生產(chǎn)商批準(zhǔn)日期產(chǎn)品類型細(xì)胞系方法培養(yǎng)基Palivizumab/SynagisTM（預(yù)防呼吸性融合細(xì)胞病毒）Medimmune6/19/1998單克隆抗體（mAb）鼠雜交瘤細(xì)胞系重組NSO攪拌釜反應(yīng)器，懸浮，補(bǔ)料培養(yǎng)無血清Basiliximab／SimulecTM（預(yù)防急性器官排斥反應(yīng)）NovartisPharmacerticals5/12/1998單克隆抗體（mAb),鼠／人IgG1鼠雜交瘤細(xì)胞系重組NSO攪拌反應(yīng)器，懸浮，灌流培養(yǎng)無血清Daclizumab/ZenapaxTM（預(yù)防急性器官排斥反應(yīng)）Hoffman-La-Roche12/10/1997單克隆抗體（mAb),鼠／人IgG1SP2/0未公開未公開Rituximab/RituxanTM（治療B細(xì)胞非Hodgkin淋巴瘤?。㊣DEC-Pharmacertical/Genentech11/26/1997單克隆抗體（mAb),鼠／人IgG1CHO攪拌釜反應(yīng)器，懸浮含慶大霉素血凝因子IX（重組）／BenefixTM（控制B型血友病人的出血發(fā)生率）GeneticsInstitute2/11/1997重組糖蛋白CHO攪拌釜反應(yīng)器，懸浮，批式補(bǔ)料培養(yǎng)無血清，含重組胰島素干擾素－1a／AvonexTM（用于多發(fā)性硬化的治療）Biogen5/17/1996重組糖蛋白CHO攪拌反應(yīng)器，懸浮未公開2000年使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系生產(chǎn)的獲得

許可的診斷用重組生物制品（BLA）產(chǎn)品BLA名稱生產(chǎn)商批準(zhǔn)日期產(chǎn)品類型細(xì)胞系方法培養(yǎng)基IDMicroTypingSystem（Anti-A）MicroTypingSystem，Inc09/21/2000鼠單克隆抗體BIRMA-1細(xì)胞系未公開未公開IDMicroTypingSystem（Anti-B）MicroTypingSystem，Inc09/21/2000鼠單克隆抗體LB-2細(xì)胞系未公開未公開IDMicroTypingSystem（Anti-AandAnti-B）MicroTypingSystem，Inc09/21/2000鼠單克隆抗體ES－15＆細(xì)胞系未公開未公開IDMicroTypingSystem（Anti-D）MicroTypingSystem，Inc09/21/2000人單克隆抗體MS201細(xì)胞系未公開未公開2000年至2002年使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系生產(chǎn)的獲得

許可的生物制品（BLA）產(chǎn)品BLA名稱生產(chǎn)商批準(zhǔn)日期產(chǎn)品類型細(xì)胞系方法培養(yǎng)基Rebif（降低回歸熱性硬結(jié)病人臨床病情惡化）Serono3/7/2002干擾素－1aCHOAranesp（治療慢性腎衰相關(guān)的貧血）Amege9/17/2001TWINRIX（甲肝滅活和重組乙肝疫苗）SMITHKLINEBeechamBiologicals5/11/2001MRC-5生產(chǎn)甲肝疫苗，酵母生產(chǎn)乙肝疫苗Campath（治療B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞白血?。㎝illenniumandILEXPartnersLP5/7/2001CHO懸浮培養(yǎng)含neomycinTenecteplase/TNKaseTM（降低急性心肌梗塞死亡率）Genentech6/2/2000重組糖蛋白CHO未公開未公開抗血友病因子（重組）／ReFactoTM（控制血友病發(fā)生率）GeneticsInstitute3/6/2000重組糖蛋白CHO連續(xù)灌流無血清，含有人血清白蛋白和重組胰島素第七節(jié)

細(xì)胞培養(yǎng)中污染的檢測(cè)與排除污染是細(xì)胞培養(yǎng)工作的大敵。在工作中，除需要好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和技術(shù)方法外，成敗的關(guān)鍵還在于能否避免污染。一項(xiàng)好的研究，或獲得的滿意細(xì)胞株，往往由于遭受污染而前功盡棄。因此，在細(xì)胞培養(yǎng)工作中，要始終注意防止和控制污染

。凡混入培養(yǎng)環(huán)境中對(duì)細(xì)胞生存有害的成分和造成細(xì)胞不純的異物，都應(yīng)視為污染。微生物：真菌、細(xì)菌、支原體和病毒[最易發(fā)生、最難防止]化學(xué)物質(zhì)（毒性物質(zhì)）：影響細(xì)胞生存的、非細(xì)胞所需的化學(xué)成分

[少發(fā)生、易防止]

其他細(xì)胞：非同種的其它細(xì)胞

[容易防止]一、細(xì)胞培養(yǎng)中污染的來源和途徑1.空氣空氣是微生物轉(zhuǎn)播的最主要途徑。由于空氣流動(dòng)性大，在操作空間與外界隔離不嚴(yán)和消毒不充分的情況下，外界不潔空氣很容易侵入造成污染。因此培養(yǎng)設(shè)施不能設(shè)在通風(fēng)場(chǎng)所；現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)室普遍使用凈化工作臺(tái)，能產(chǎn)生濾過的無菌的屏障氣流，可有效防止不潔空氣的侵入。但凈化工作臺(tái)使用過久、濾器受塵埃堵塞，可是凈化工作不能正常進(jìn)行。因此要定期檢查和清洗高效濾器。工作時(shí)不帶口罩或面對(duì)操作野大聲講話、咳嗽等使外界氣流過強(qiáng)，污染空氣均可進(jìn)入操作野，造成污染。因此，工作時(shí)減少空氣流動(dòng)是防止污染的重要環(huán)節(jié)；雖然采用多種措施，但也難以排除空氣中所有微生物。操作野每立方米內(nèi)含菌數(shù)不應(yīng)超過15個(gè)。2.培養(yǎng)用品各種培養(yǎng)器皿及器械清洗消毒不徹底；污物殘留及培養(yǎng)用液等滅菌不徹底，都可以引入有害物質(zhì)；另外需要主要的是CO2培養(yǎng)箱，由于箱內(nèi)濕度大，溫度適宜，取存細(xì)胞時(shí)不慎將培養(yǎng)液漏出，易使細(xì)菌、霉菌滋生，而CO2培養(yǎng)箱內(nèi)是開放式培養(yǎng)，如不定期消毒，可形成污染。3.操作過程實(shí)驗(yàn)操作無菌觀念不強(qiáng)、動(dòng)作不準(zhǔn)確、使用污染的器具，或封瓶不嚴(yán)，都可發(fā)生污染；培養(yǎng)兩種以上細(xì)胞時(shí)，操作不規(guī)范，交叉使用吸管或培養(yǎng)液瓶等有可能導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染；因此，所有工作要進(jìn)行得有條不紊和安全可靠，操作時(shí)由始至終要保持一定順序性，動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷，并要注意防止空氣流動(dòng)，減少污染機(jī)會(huì)，培養(yǎng)器具如吸管等應(yīng)分別使用，不能混用

，以防擴(kuò)大污染或?qū)е录?xì)胞交叉污染。4.血清血清也是污染的主要來源，市售血清有的制備不嚴(yán)、檢測(cè)不嚴(yán)，常已被支原體或病毒等污染。因此，要購買可靠廠家的血清，并最好先進(jìn)行檢測(cè)后再用。5.組織原代培養(yǎng)的污染多數(shù)來源于組織樣本；另外，手術(shù)時(shí)使用碘酒消毒，這些混入組織中的碘也可以影響細(xì)胞的生長；因此，手術(shù)時(shí)一定要嚴(yán)格消毒，規(guī)范操作，避免組織或細(xì)胞污染。二、污染對(duì)細(xì)胞的影響當(dāng)細(xì)胞受到有害物污染時(shí)，輕者細(xì)胞增殖生長緩慢、分裂相減少，細(xì)胞粗糙，輪廓增強(qiáng)，胞質(zhì)出現(xiàn)較多的顆粒狀物質(zhì)；污染較重的細(xì)胞增殖停止、分裂相消失、細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)大量的堆積物，細(xì)胞變圓或崩解，從瓶壁脫落。支原體污染細(xì)胞后，培養(yǎng)液不發(fā)生混濁，多數(shù)情況下細(xì)胞病理變化輕微或不顯著，細(xì)胞變化也可由于傳代、換液而緩解，因此容易被忽視。但個(gè)別嚴(yán)重者，可致細(xì)胞增殖緩慢，甚至從培養(yǎng)器皿脫落。不同的污染物對(duì)細(xì)胞的影響也不同。支原體和病毒對(duì)細(xì)胞形態(tài)和機(jī)能的影響是長期的、緩慢的和潛在的；霉菌和細(xì)菌繁殖迅速，在很短時(shí)間內(nèi)壓制細(xì)胞生長或產(chǎn)生有毒物質(zhì)殺滅細(xì)胞；化學(xué)物質(zhì)污染如重金屬或其它化學(xué)試劑混入培養(yǎng)液中后，有的毒性小，如能及時(shí)排出細(xì)胞仍可存活，但有些烴化物如多環(huán)芳烴等有致突變性，能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。三、微生物污染的檢測(cè)1.真菌污染的檢測(cè)2.細(xì)菌污染的檢測(cè)3.支原體污染的檢測(cè)1.真菌污染的檢測(cè)在微生物污染中，以真菌污染最多，最常見的有：煙曲霉、黑曲霉、毛霉、孢子霉、白色念珠菌、酵母菌等。真菌種類繁多，形態(tài)各異，但污染后均不難發(fā)現(xiàn)，霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色小點(diǎn)漂浮物，一般肉眼可見，較易發(fā)現(xiàn)，短期內(nèi)培養(yǎng)液多不渾濁；倒置顯微鏡下可見在細(xì)胞之間有縱橫交錯(cuò)穿行的呈絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲，并懸浮漂蕩在培養(yǎng)液中。念珠菌和酵母菌形態(tài)呈卵圓形態(tài)，散在于細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長。2.細(xì)菌污染的檢測(cè)細(xì)菌污染較為多見的是以白色葡萄菌、大腸桿菌、假單孢菌、枯草桿菌等。加用抗生素的培養(yǎng)液一般可預(yù)防和排除個(gè)別少量細(xì)菌的污染。一旦發(fā)生細(xì)菌污染很容易發(fā)現(xiàn)：多數(shù)情況下培養(yǎng)液短期內(nèi)顏色變黃，表明有大量酸性物質(zhì)產(chǎn)生；同時(shí)培養(yǎng)液變混濁，有時(shí)靜置的培養(yǎng)液初看不渾濁，但稍加振蕩，就有很多混濁物漂??；倒置顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，有時(shí)在細(xì)胞表面和周圍有大量細(xì)菌存在，細(xì)胞生長停止并出現(xiàn)中毒表現(xiàn)；必要時(shí)可取少量培養(yǎng)液涂片染色檢查以證實(shí)細(xì)菌種類；有的培養(yǎng)液改變不明顯而又疑有污染的，可取出少量培養(yǎng)液向肉湯培養(yǎng)及內(nèi)滴加，37℃下培養(yǎng)可以檢測(cè)是否污染。3.支原體污染的檢測(cè)支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見、不易被察覺、最干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一種污染。近年隨實(shí)驗(yàn)設(shè)備的改善和技術(shù)方法的改進(jìn)，支原體污染率有所下降，但未能徹底杜絕

，污染仍時(shí)有發(fā)生。支原體污染是細(xì)胞培養(yǎng)研究室重點(diǎn)預(yù)防對(duì)象支原體是一種大小介于細(xì)菌和病毒之間（直徑為0.2~2微米）、并獨(dú)立生活的微生物，約有1%可通過過濾菌器。支原體無細(xì)胞壁，形態(tài)呈高度多樣性，有圓形、絲狀或梨狀等，在光學(xué)顯微鏡下不易看到內(nèi)部結(jié)構(gòu)。多數(shù)支原體適于偏堿條件下生存（pH7.6~8.0），對(duì)酸耐受性差，對(duì)熱較敏感，對(duì)一般抗生素不敏感。支原體多吸附或散在分布于細(xì)胞表面和細(xì)胞之間，能抑制細(xì)胞代謝和生長，能影響DNA合成，引起一系列嚴(yán)重后果，如改變細(xì)胞染色體核型、增加染色體畸變等。細(xì)胞培養(yǎng)中的絕大部分來源于人和牛，其次是豬。3.支原體污染的檢測(cè)支原體污染細(xì)胞后，培養(yǎng)基不發(fā)生渾濁、細(xì)胞病理變化輕微或不明顯，所以難以發(fā)現(xiàn)。為確切證明是否有支原體污染，有以下一些檢測(cè)方法：相差顯微鏡檢測(cè)低滲溶脹處理地衣紅染色觀察法DNA熒光染色法電鏡檢查支原體培養(yǎng)法相差顯微鏡檢測(cè)將細(xì)胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶內(nèi)的蓋玻片上，24h后取出，使細(xì)胞面向上置于載物臺(tái)上，再蓋上一較大蓋片（也可取少許培養(yǎng)液滴于載玻片上，再蓋上蓋玻片），用相差油鏡觀察。支原體呈暗色微小顆粒位于細(xì)胞表面或細(xì)胞之間，有類似布朗運(yùn)動(dòng)的表現(xiàn)。相差顯微鏡的基本原理是，把透過標(biāo)本的可見光的光程差變成振幅差，從而提高了各種結(jié)構(gòu)間的對(duì)比度，使各種結(jié)構(gòu)變得清晰可見。光線透過標(biāo)本后發(fā)生折射，偏離了原來的光路，同時(shí)被延遲了1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變?yōu)?/2λ，兩束光合軸后干涉加強(qiáng)，振幅增大或減下，提高反差。

該法為固定染色法，通過對(duì)細(xì)胞低滲處理，使細(xì)胞體積擴(kuò)張，細(xì)胞膜表面的皺褶和結(jié)構(gòu)減少，使附著在細(xì)胞表面的支原體容易被識(shí)別。該法簡便易行，標(biāo)本可長期保存，亦可用于檢測(cè)真菌和細(xì)菌。操作步驟如下：S1取材：用蓋玻片培養(yǎng)法或培養(yǎng)液均可。用培養(yǎng)液時(shí)，先吸取培養(yǎng)液1ml，500~800rpm離心5min后，棄去上清，余0.2ml備用。S2低滲處理：用新鮮配制的0.5%的枸櫞酸溶液，處理蓋玻片上的細(xì)胞或加入到步驟一獲得的0.2ml懸液中，置10min。S3固定：用新鮮配制的Carnoy液固定2次，共10min，取出蓋玻片晾干；而培養(yǎng)液，則先離心棄上清固定液，余沉淀物0.2ml，制成涂片2~3片。S4染色：用2%醋酸地衣紅染色5min。S5封片：樹膠。S6觀察：支原體細(xì)胞被染成紫紅色，支原體附著于細(xì)胞表面或散在細(xì)胞之間。低滲溶脹處理地衣紅染色觀察法DNA熒光染色法該法用能與DNA特異性結(jié)合的熒光染料Hoechast33258，可使支原體內(nèi)含有的DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。具體方法如下：S1取材：將細(xì)胞接種蓋玻片上，在細(xì)胞為長滿前取出玻片，用不含酚紅的Hank’s液漂洗一下；S2固定：用固定液（1:3的醋酸甲醇溶液）固定10min，然后用生理鹽水漂洗；S3染色：將上步漂好的樣品置于用生理