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認(rèn)證類(lèi)型：個(gè)人認(rèn)證

認(rèn)證主體：胡**（實(shí)名認(rèn)證）

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IP屬地：天津 上傳時(shí)間：2022-11-06 格式：DOCX 頁(yè)數(shù)：4 大?。?2.69KB 積分：12 舉報(bào) 版權(quán)申訴

享廷頓蛋白結(jié)合蛋白1對(duì)胰島p細(xì)胞胰島素分泌和L型鈣通道Cav1.2胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)挠绊懞嗤㈩D蛋白結(jié)合蛋白1(huntingtin-associatedprotein1,HAP1) 是最早發(fā)現(xiàn)的能與亨廷頓病(Huntington'sdisease,HD)基因產(chǎn)物亨廷頓蛋白(huntingtin,Htt)相互結(jié)合的蛋白質(zhì)。HAP1具有HAP1A和HAP1B兩種剪接體，既在神經(jīng)元中表達(dá)，也在分泌含氮激素激內(nèi)分泌細(xì)胞中表達(dá)。在神經(jīng)元內(nèi),HAP1參與細(xì)胞器和分子的運(yùn)輸、膜受體轉(zhuǎn)運(yùn)與再循環(huán)。 HAP1可通過(guò)與驅(qū)動(dòng)蛋白(kinesin)輕鏈(KLC)和重鏈(KHC)、驅(qū)動(dòng)蛋白家族運(yùn)動(dòng)蛋白5(KIF5)、動(dòng)力蛋白激活蛋白復(fù)合物的亞單位P150Glued等微管相關(guān)運(yùn)動(dòng)蛋白相互作用，參與或調(diào)控神經(jīng)元內(nèi)囊泡、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、受體等基于微管的運(yùn)輸。HAP1的胞內(nèi)運(yùn)輸功能受自身磷酸化程度的影響，HAP1A羧基末端PKA磷酸化位點(diǎn)(T598)的磷酸化能顯著減少其與P150Glued和KLC的結(jié)合，抑制其參與的胞內(nèi)運(yùn)輸活動(dòng)，去磷酸化后則相反。HAP何能通過(guò)神經(jīng)元內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸對(duì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育、存活、遞質(zhì)釋放起調(diào)節(jié)作用。在大鼠、小鼠胰島內(nèi)，HAP1選擇性表達(dá)于分泌胰島素的P細(xì)胞內(nèi)：MIN6.NIT-1、INS-1等胰島P細(xì)胞瘤細(xì)胞系也表達(dá)HAP1抑制MIN6和NIT-1細(xì)胞的HAP俵達(dá)能顯著抑制其胰島素的分泌；胰島P細(xì)胞HAP1選擇性敲除的小鼠，其糖耐量能力下降，葡萄糖刺激后的胰島素分泌減少。由此表明，HAP1與胰島P細(xì)胞胰島素的分泌有關(guān)。電位門(mén)控鈣通道(voltagegatedcalciumchennel,Cav)參與調(diào)控葡萄糖刺激引起的胰島P細(xì)胞胰島素的分泌，葡萄糖濃度的升高可促進(jìn)P細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝入和代謝，增加ATP-ADM轉(zhuǎn)化和抑制K+1道活性，使細(xì)胞膜去極化并由此使Cav開(kāi)放，大量鈣離子內(nèi)流最終引發(fā)胰島素的分泌。P細(xì)胞主要表達(dá) Cav1.2和Cav1.3兩種亞型的L型鈣通道，其中Cav1.2在P細(xì)胞胰島素的分泌中發(fā)揮重要作用。Cav與多種離子通道一樣，在粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上進(jìn)行合成組裝后，以膜小泡的形式進(jìn)入高爾基復(fù)合體進(jìn)一步修飾加工形成囊泡，然后轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜，表達(dá)在細(xì)胞膜的特定區(qū)域。Cav的細(xì)胞膜表達(dá)量決定.Ca2+內(nèi)流的大小與動(dòng)力學(xué)。HAP1是否通過(guò)影響鈣通道的胞內(nèi)運(yùn)輸、細(xì)胞膜表達(dá)而影響胰島素的分泌，日前未見(jiàn)報(bào)道。有關(guān)調(diào)節(jié)鈣通道膜表達(dá)的機(jī)制研究表明，腫瘤抑制因子eIF3e（eukaryotictranslationinitiationfactor3subunitE）通過(guò)與Cav1.2的結(jié)合，調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞和胰島P細(xì)胞內(nèi)Cavl.2的雙向運(yùn)輸，即從胞質(zhì)向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)（膜表達(dá)）和從細(xì)胞膜向胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)（內(nèi)在化’internalization），從而維持胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)。elF3e對(duì)Cav1.2通道蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)和膜表達(dá)的調(diào)節(jié)作用提示HAP1可能通過(guò)與elF3e蛋白相互作用，調(diào)節(jié)胰島P細(xì)胞內(nèi)鈣通道的運(yùn)輸，進(jìn)而影響胰島素的分泌。本研究在進(jìn)一步證實(shí)HAP1影響胰島p細(xì)胞胰島素分泌的基礎(chǔ)上，觀察了HAP1表達(dá)水平對(duì)？細(xì)胞Cav1.2活性、外鈣內(nèi)流、Cav1.2膜表達(dá)的影響，并分析了P細(xì)胞內(nèi)HAP1和eIF3e之間的相互作用。、HAP1促進(jìn)胰島p細(xì)胞胰島素的分泌為了進(jìn)一步證明HAP1對(duì)胰島p細(xì)胞胰島素分泌的調(diào)節(jié)作用，對(duì)HAP1基因敲除小鼠血漿胰島素含量和沉默HAP1對(duì)大鼠胰島p細(xì)胞瘤細(xì)胞INS-1細(xì)胞胰島素分泌能力的影響進(jìn)行了檢測(cè)。放射免疫分析顯示，HAP1基因敲除小鼠血漿中胰島素含量明顯降低； 全細(xì)胞膜片鉗膜電容檢測(cè)顯示，與野生型和轉(zhuǎn)染表達(dá)對(duì)照質(zhì)粒的INS-1細(xì)胞比較，在轉(zhuǎn)染表達(dá)HAP1-SiRNA勺INS-1細(xì)胞中，無(wú)論是即刻釋放庫(kù)（immediatelyreleasablepool,IRP)分泌還是快速釋放庫(kù)(rapidiyreleasablepool,RRP)分泌均明顯降低；pHluorin是一種pH敏感熒光蛋白，將囊泡標(biāo)記蛋白VAMP2-pHluorin的表達(dá)質(zhì)粒與HAP1-SiRNA質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞后，利用共聚焦活細(xì)胞動(dòng)態(tài)成像技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，沉默HAP1表達(dá)后,INS-1細(xì)胞胰島素的囊泡分泌事件次數(shù)、分泌持續(xù)時(shí)間和分泌事件強(qiáng)度等均明顯減少。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了HAP1對(duì)胰島P細(xì)胞的胰島素分泌具有促進(jìn)作用，抑制HAP1的表達(dá)可抑制胰島素的分泌。二、沉默HAP1導(dǎo)致P細(xì)胞L型鈣電流減小和外鈣內(nèi)流減少鈣離子內(nèi)流可引發(fā)和調(diào)控胰島素的分泌。為了探討HAP1是否通過(guò)影響胰島P細(xì)胞L型鈣通道和鈣離子內(nèi)流而影響胰島素的分泌，繼而檢測(cè)了沉默HAP1對(duì)INS-1細(xì)胞L型鈣電流和鈣離子內(nèi)流的影響。采用膜片鉗全細(xì)胞電壓鉗檢測(cè)技術(shù)，利用鋇離子替代鈣離子，記錄INS-1細(xì)胞L型鈣電流。INS-1細(xì)胞分別瞬轉(zhuǎn)HAP1沉默質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒，48h后分別記錄兩實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞L型鈣電流的變化。結(jié)果顯示,HAP1低表達(dá)后,INS-1細(xì)胞L型鈣電流明顯減小。進(jìn)一步應(yīng)用Fura-2定量測(cè)定胞內(nèi)鈣技術(shù)檢測(cè)INS-1細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度顯示，高K+刺激條件下，野生型或轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒的INS-1細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速出現(xiàn)大幅度的上升，而轉(zhuǎn)染表達(dá)HAP1-SiRNA勺INS-1細(xì)胞在高K+刺激后只表現(xiàn)出一個(gè)小幅度的鈣離子濃度的提高。由此證明,HAP1可通過(guò)調(diào)節(jié)胰島P細(xì)胞L型鈣通道而影響其介導(dǎo)的鈣離子內(nèi)流，從而影響胰島素的分泌。三、沉默HAP1減少Cavl.2通道的膜表達(dá)鈣通道膜表達(dá)量是影響鈣電流和鈣離子濃度大小的因素之一。沉默HAP1后INS-1細(xì)胞的L型鈣電流和外鈣內(nèi)流都明顯下降提示，HAP1可能影響胰島P細(xì)胞L型鈣通道的膜表達(dá)。離子通道膜表達(dá)的多少一方面與其總的表達(dá)水平有關(guān)，另一方面與其從胞質(zhì)向膜上轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。我們首先觀察了沉默HAP1對(duì)INS-1細(xì)胞Cav1.2的mRNA表達(dá)水平的影響。兩組INS-1細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染HAP1沉默質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒，48h后用RT-PCF方法進(jìn)行檢測(cè),發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和沉默組Cavl.2的mRN表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異，由此證明HAP1對(duì)P細(xì)胞Cav1.2的表達(dá)無(wú)影響。為了探討HAP1是否通過(guò)影響鈣通道從胞質(zhì)向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)而影響其膜表達(dá)，應(yīng)用免疫熒光技術(shù)分析了HAP1對(duì)INS-1細(xì)胞Cavl.2通道囊泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)和膜表達(dá)的影響。將胞內(nèi)N末端連接有YFR胞外n區(qū)的S5和H5環(huán)處連接一個(gè)HA肽段的L型鈣通道融合蛋白YFP-Cav1.2-HA表達(dá)質(zhì)粒及其輔助亞基（P1b+a2S表達(dá)質(zhì)粒與HAP1-SiRNA￡粒或?qū)φ召|(zhì)粒共轉(zhuǎn)染INS-1細(xì)胞后，在不用TritonX-100處理?xiàng)l件下用HA抗體進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記顯示，沉默HAP1可顯著降低INS-1細(xì)胞膜上HA免疫熒光強(qiáng)度，表明HAP1參與了Cav1.2鈣通道蛋白的從胞質(zhì)向細(xì)胞膜的運(yùn)輸。四、HAP1和elF3e兩個(gè)蛋白之間的相互作用為了探討HAP1通過(guò)對(duì)P細(xì)胞內(nèi)Cav1.2胞內(nèi)運(yùn)輸具有調(diào)控作用的eIF3e影響p細(xì)胞內(nèi)Cav1.2膜表達(dá)的可能性，對(duì)HAP1與eIF3e之間的相互作用進(jìn)行了分析。對(duì)INS-1細(xì)胞內(nèi)源性HAP1和eIF3e的免疫熒光雙標(biāo)檢測(cè)顯示,兩種蛋白在胞質(zhì)內(nèi)的定位分布完全相同。在HEK293細(xì)胞和INS-1細(xì)胞中，共轉(zhuǎn)染表達(dá)的eIF3e-CFP和HAP1A-YF除少量呈彌散分布外，大多呈現(xiàn)顆粒狀分布，并在顆粒中共定