凍干管開啟規(guī)程

-.z.凍干管的開啟及制作規(guī)程一、培養(yǎng)基的配制要求：1.按照菌種庫相應(yīng)要求配置培養(yǎng)基，6支液體試管（5ml/支），三角瓶4個（30-50ml/瓶），斜面5支。2.所有培養(yǎng)基配制完成后，放置于相應(yīng)的培養(yǎng)溫度和37℃無菌檢查48h。注意：有很多無機(jī)鹽的培養(yǎng)基要將能夠產(chǎn)生沉淀的鹽分開溶解（各自用10ml去離子水溶解后，再加入到主培養(yǎng)基中）二、超凈工作臺的準(zhǔn)備1.將新潔爾滅原液稀釋50倍，噴到臺面上，或者紗布浸濕后擦拭臺面，或者用75%的乙醇擦拭或者噴灑（注意不要開火）。2.開紫外燈照射20-30min。3.關(guān)閉紫外燈，開啟風(fēng)機(jī)，10分鐘以上。4.在開始接種前，用75%酒精棉擦拭臺面，手、槍。5.可以在臺面上鋪一塊滅菌的紗布。三、凍干管的開啟1.凍干管的開啟：一般有滴水法和砂輪打磨法。從DSMZ買來的雙層菌種管需要用滴水方法，從國內(nèi)的有些庫購買的，或NRRL得到的菌種管很細(xì)，滴水法很難打開，因此，需要用砂輪打磨。滴水法：用酒精棉擦拭菌種管，尖頭稍傾斜向下（以防菌種滾落到前面燙的區(qū)域致死，重要?。?，用酒精燈的外焰燒烤菌種管的前端，約1min后，用無菌水快速滴加到菌種管上，此時，管上會有裂縫，繼續(xù)靠火操作，用無菌鑷子輕敲破碎處，將菌種管打開。砂輪打磨法：用玻璃砂輪在菌種管的一側(cè)反復(fù)打磨，出現(xiàn)痕跡。接著，將該處在火上灼燒滅菌。將一張無菌牛皮紙包在菌種管上，反方向用力掰斷。2.菌種的復(fù)水：將液體培養(yǎng)基吸取0.5-1ml左右（視菌體量多少而定，厭氧菌加0.5ml），充分水化后，吸取100ul左右到第一支試管中（第二支和第三只分別稀釋100倍和1000倍），100ul到斜面上，晃動使其均勻分布，也可以用無菌接種針涂布均勻。如有多余的凍干液，則接200ul左右至搖瓶中。有些菌要求的初始菌液濃度比較大，因此需將凍干液全部接種到液體試管中。剩余的凍干液用EP管裝好，放置于4℃冰箱中，以備不測。開啟凍干管需要準(zhǔn)備的器材：無菌水、培養(yǎng)基、黃藍(lán)槍頭、紗布、EP管四、傳代培養(yǎng)從菌種庫接出來的一般稱為第一代，第一代其生長可能同正常的菌不一樣，會出現(xiàn)延滯期延長等現(xiàn)象，因此如果一個菌出現(xiàn)長時間不長的現(xiàn)象，可以延長等候時間，直至過了其2-3個生長期后仍不長，可判斷菌種死亡。因此所有保種的菌必須用第二代或第三代來保種。第一代菌體進(jìn)行染色、涂片，對圖片資料進(jìn)行保存。五、凍干管制作保護(hù)劑——脫脂牛奶的制作：大多數(shù)的菌種都可以用脫脂牛奶作為保護(hù)劑，但DSM1616等屬的微生物需要用蔗糖和明膠作為保護(hù)劑。初始菌種如果呈現(xiàn)米色塊狀，一般是用牛奶做保護(hù)劑的，如果呈現(xiàn)透明狀，則可能是使用明膠蔗糖或DMSO做保護(hù)劑的。a、用藍(lán)蓋瓶裝20-30ml水，121℃，30min滅菌。b、在無菌室取2-3g脫脂奶粉（BD），（10%的濃度），在無菌室中加入到藍(lán)蓋瓶中，溶解完全，蓋好蓋子，115℃15min滅菌。將滅菌好的牛奶涂布在肉湯培養(yǎng)基平板上，37℃檢查48h，驗證無菌后待用。牛奶放4℃冰箱中。1.凍干管一般用斜面，如果斜面生長不理想，或者厭氧菌，則可以用菌液離心后的沉淀來保種。2.正常傳代，菌種長至對數(shù)生長期。將待保種的菌體涂片檢查，圖片資料進(jìn)行保存。3.斜面：取出新鮮斜面兩支，如果菌苔較厚，則吸取1ml牛奶到EP管中，用接種環(huán)刮取菌苔，到牛奶中，混合均勻，蓋好蓋子，用振蕩器混勻。如果菌苔較薄，無法刮取，則吸取牛奶液到斜面中，用接種環(huán)將菌體刮到牛奶中，再用長針頭吸出。菌液：將新鮮菌液吸取無菌離心管中，離心沉淀，加入牛奶，長針頭吸出。牛奶菌懸液的濃度一般在1億個/ml。4.將混合好的菌液用長針頭吸出到凍干管中，凍干管事先用紙塞子塞好。全部做好后，用八層紗布扎好，每5-6只扎一起。5.菌體預(yù)凍：將制作好的凍干管先放在4℃，2h后轉(zhuǎn)入-20℃，2h后轉(zhuǎn)入-80℃。多數(shù)細(xì)菌可以直接凍到-80℃，兩小時或者過夜之后，上凍干機(jī)。制作凍干管需要準(zhǔn)備的器材：菌種、凍干管、長針頭、大小紗布、牛奶、肉湯培養(yǎng)基（可以用LB培養(yǎng)基取代）、接種針、槍頭、EP管六、凍干機(jī)的使用：a、將真空泵和凍干機(jī)之間的接頭打至垂直，將真空泵預(yù)熱。b、將凍干機(jī)的冷凍腔開關(guān)打開，待降至-52℃時，將樣品放置在冷凍腔中，接頭打至平行。c、抽干8h以上，可過夜。d、接頭打至垂直，放氣，待真空度顯示正常，取出有機(jī)玻璃罩，取出樣品，再把玻璃罩放上，抽真空。e、待真空度達(dá)到0.1Mpa時，先把白色旋鈕垂直向上，上凍干管，待凍干管全部插滿后，將白色旋鈕垂直向下，開始抽真空，約10min后，開始熱熔封。f、將所有管子熱熔封后，將真空泵和凍干機(jī)之間的接頭打至垂直，關(guān)閉真空泵，將白色旋鈕打至傾斜，開始往冷凍腔中緩慢進(jìn)氣，真空度慢慢解除。關(guān)閉凍干機(jī)。g、將凍干機(jī)前面的黑色旋鈕打開，放冷凝水。h、關(guān)閉煤氣開關(guān)。七、菌種管檢查為了保證凍干管的純度，需要對該批凍干管進(jìn)行檢查，隨機(jī)取出一支，按三中的方法開啟凍干管，分別接液體和斜面，待生長后，涂片，檢查純度。八、入庫記錄演示：1.凍干管開啟。2.菌體涂片檢查。3.酒精棉制作。4.長針頭制作。5.凍干機(jī)使用。亨蓋特法厭氧培養(yǎng)基的制備一．目的:學(xué)習(xí)制備厭氧菌培養(yǎng)基。二．實驗原理按照微生物與氧的關(guān)系，可把微生物分成好氧菌和厭氧菌兩大類，并可細(xì)分為五類。（1）專性好氧菌：必須在有分子氧的條件下才能生長，有完整的呼吸鏈，以分子氧作為最終氫受體，細(xì)胞含超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶。絕大多數(shù)真菌和許多細(xì)菌都是專性好氧菌。（2）兼性好氧菌：在有氧或無氧條件下均能生長，但有氧情況下生長得更好；在有氧時靠呼吸產(chǎn)能，無氧時借發(fā)酵或無氧呼吸產(chǎn)能；細(xì)胞含SOD和過氧化氫酶。許多酵母菌和許多細(xì)菌都是兼性厭氧菌。（3）微好氧菌：只能在較低的氧分壓下才能正常生長的微生物。也通過呼吸鏈并以氧為最終受體而產(chǎn)能。（4）耐氧菌：一類可在分子氧存在下進(jìn)行厭氧生活的厭氧菌，即它們的生長不需要氧，分子氧對它也無毒害。不具有呼吸鏈，僅依靠專性發(fā)酵獲得能量。細(xì)胞內(nèi)存在SOD和過氧化物酶，但缺乏過氧化氫酶。一般的乳酸菌多數(shù)是耐氧菌。（5）厭氧菌：分子氧對它們有毒，即使短期接觸空氣，也會抑制其生長甚至致死。厭氧菌在固體或半固體培養(yǎng)基深層才能生長，其生命活動所需能量通過發(fā)酵、無氧呼吸、循環(huán)光合磷酸化或甲烷發(fā)酵等提供；細(xì)胞內(nèi)缺乏SOD和細(xì)胞色素氧化酶，大多數(shù)還缺乏過氧化氫酶。氧氣進(jìn)入菌體后，能接受電子而產(chǎn)生不同還原性的氧離子，如過氧離子、過氧化物自由基。過氧化物自由基和過氧離子都是很強(qiáng)的氧化劑，對微生物有毒，能氧化微生物生長過程中所必需的酶。好氧菌、兼性好氧菌以及微好氧菌體內(nèi)含有過氧化物歧化酶（SOD)和過氧化氫酶。這兩種酶能將過氧化物自由基和過氧離子還原成沒有毒性的水分子，所以以上三種菌不會被氧氣所殺死。耐氧菌雖沒有過氧化氫酶，但有SOD酶，而不會被氧毒害。厭氧菌體內(nèi)都沒有這些酶，所以不能忍受氧氣。厭氧微生物的研究可采用美國微生物學(xué)家Hungate（亨蓋特）于1950年提出并廣泛應(yīng)用的厭氧滾管技術(shù)又稱亨蓋特滾管技術(shù)（Hungateroll-tubetechnique）。其原則是利用物理化學(xué)的手段在制備、保存、培養(yǎng)等各個環(huán)節(jié)驅(qū)除和避免接觸氧氣，具體做法有五點：①利用高純氮驅(qū)除小范圍的空氣，創(chuàng)造缺氧的小環(huán)境。②培養(yǎng)基要經(jīng)過煮沸以除氧。③在培養(yǎng)基中加入低濃度的還原劑如半胱氨酸或硫化鈉，以得到較低的氧化還原電位。④用無氧指示劑刃天青指示培養(yǎng)基中的無氧環(huán)境。⑤用特殊的密封器皿進(jìn)行培養(yǎng)，如帶有丁基橡膠塞的血清瓶或試管（用試管可制作亨蓋特（Hungate）滾管）。三．實驗器材1.培養(yǎng)基：解纖維梭菌（Clostridiumcellulolyticum）培養(yǎng)基（配方見該實驗附）2.過濾除菌的Na2CO3(5%w/v)溶液3.還原劑半胱氨酸，還原劑Na2S?9H2O10%母液。4.高純混合氮氣鋼瓶（80%N2+20%CO2），減壓閥。5.其他：高壓蒸汽滅菌鍋，厭氧試管，厭氧瓶（即血清瓶），異丁烯橡膠塞，煤氣燈，注射器、18#長針頭，移液器，槍頭，一次性無菌過濾器。四．實驗步驟1.高壓鋼瓶的使用氣體鋼瓶是儲存壓縮氣體的特制的耐壓鋼瓶。使用時，通過減壓閥（氣壓表）有控制地放出氣體。由于鋼瓶的內(nèi)壓很大（有的高達(dá)15MPa），而且有些氣體易燃或有毒，所以在使用鋼瓶時要注意安全。（1）在鋼瓶上裝上與氣體配套的減壓閥（圖1）。（2）使減壓閥處于旋松狀態(tài)，此時氣體不會外泄。用時先逆時針打開鋼瓶總開關(guān)，觀察高壓表讀數(shù)，記錄高壓瓶內(nèi)總的氮氣壓，然后順時針轉(zhuǎn)動減壓閥，使其壓縮主彈簧將活門打開。這樣進(jìn)口的高壓氣體由高壓室經(jīng)節(jié)流減壓后進(jìn)入低壓室，并經(jīng)出口通往工作系統(tǒng)。使用結(jié)束后，先順時針關(guān)閉鋼瓶總開關(guān)，再逆時針旋松減壓閥。減壓閥旋鈕主閥減壓閥旋鈕主閥圖1高壓氣體鋼瓶及減壓閥（3）利用分支管從氮氣鋼瓶中接出兩支氣路，每支氣路各接長針頭（圖2）。長針頭長針頭圖2氮氣氣路連接圖2.解纖維梭菌液體培養(yǎng)基的制備（1）稱量：按照配方稱取除鈣鎂鹽、刃天青外所有組分。（2）溶解定容：用500ml左右蒸餾水溶解，然后將鈣鹽和鎂鹽溶液按需要的量滴加其中，滴加過程中不斷攪拌，混合后定容至1000ml。（3）調(diào)節(jié)pH：由于刃天青和半胱氨酸加入后會影響培養(yǎng)基的pH值，因此將二者加入到培養(yǎng)基后再調(diào)節(jié)pH。刃天青加1ml，半胱氨酸0.4g，此時培養(yǎng)基呈現(xiàn)藍(lán)紫色。滅菌前用鹽酸將pH調(diào)整到6.0，滅菌后用過濾除菌的Na2CO3(5%w/v)溶液在混合氣體保護(hù)下（80%N2+20%CO2）將pH調(diào)整到7.2（一般10ml培養(yǎng)基中加入0.4ml）。（4）煮沸除氧氣：將調(diào)好pH值的培養(yǎng)基放置在煤氣燈上加熱至沸騰，培養(yǎng)基保持沸騰時會顯示除氧后的顏色，即刃天青變?yōu)闊o色，培養(yǎng)基顯示出原本的淡黃色。此時打開高純氮氣鋼瓶，將長針頭置入培養(yǎng)基中通氣，并冷卻。（5）培養(yǎng)基的分裝：往培養(yǎng)基中加入Na2S?9H2O母液5ml，將厭氧瓶或厭氧管用長針頭通上氮氣，然后取出定量注射器從培養(yǎng)基中吸取一定量的培養(yǎng)基注入?yún)捬跗炕騾捬豕苤?，繼續(xù)通氣15s左右，迅速塞好塞子。（6）121℃高壓蒸汽滅菌20min。3.厭氧固體培養(yǎng)基的制備（1）按照步驟2（1）~（3）步進(jìn)行操作。（2）取適量上述培養(yǎng)基，加入適量瓊脂粉，然后在煤氣燈上煮沸以徹底融化瓊脂并除氧。（3）按2-（5），2-（6）的步驟進(jìn)行分裝和滅菌，厭氧管裝量為5ml。（4）滅菌結(jié)束后進(jìn)行滾管操作。將滅完菌的厭氧管放置在桌面上進(jìn)行勻速滾動，這樣培養(yǎng)基會在試管壁形成一層瓊脂面，且面積較大，可以進(jìn)行分離的操作，也可以擺放成斜面。4.厭氧生理鹽水的制備（1）配制0.85%的生理鹽水。（2）按照1ml/1000ml的比例加入刃天青母液，按終濃度0.05%加入半胱氨酸固體粉末。將生理鹽水煮沸至無色后，保持沸騰5min。（3）將生理鹽水中通N2，用10ml定量注射器吸取9ml生理鹽水，注入到已經(jīng)換氣的厭氧試管中，繼續(xù)通氣15s左右，迅速塞好塞子。五．注意事項1.氣體鋼瓶使用的注意事項（1）壓縮氣體鋼瓶應(yīng)直立使用，務(wù)必用框架或柵欄圍護(hù)固定。（2）壓縮氣體鋼瓶應(yīng)遠(yuǎn)離熱源、火種，置通風(fēng)陰涼處，防止日光曝曬，嚴(yán)禁受熱。（3）禁止隨意搬動敲打鋼瓶，經(jīng)允許搬動時應(yīng)做到輕搬輕放。（4）使用時要注意檢查鋼瓶及連接氣路的氣密性，確保氣體不泄漏。使用鋼瓶中的氣體時，要用減壓閥（氣壓表）。各種氣體的氣壓表不得混用，以防爆炸。（5）使用完畢按規(guī)定關(guān)閉閥門，主閥應(yīng)擰緊不得泄露。養(yǎng)成離開實驗室時檢查氣瓶的習(xí)慣。（6）不可將鋼瓶內(nèi)的氣體全部用完，一定要保留0.05MPa以上的殘留壓力（減壓閥表壓）。（7）絕不可使油或其他易燃性有機(jī)物沾在氣瓶上（特別是氣門嘴和減壓閥）。也不得用棉、麻等物堵住，以防燃燒引起事故。（8）各種氣瓶必須按國家規(guī)定進(jìn)行定期檢驗，使用過程中必須要注意觀察鋼瓶的狀態(tài)，如發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重腐蝕或其他嚴(yán)重?fù)p傷，應(yīng)停止使用并提前報檢。2.培養(yǎng)基配制注意事項（1）刃天青在氧化態(tài)時呈現(xiàn)絳紫色，在完全還原時為無色。它第一步不可逆地還原為resorufin，呈現(xiàn)桃紅色；然后再可逆地還原為無色的二氫resorufin。如果制備的培養(yǎng)基呈現(xiàn)桃紅色，表明培養(yǎng)基已經(jīng)被氧化，氧化還原電位已經(jīng)升高，其還原指示電位為-42mV。但如果配制低氧化還原電位菌株（如-330mV甲烷菌）培養(yǎng)基，由刃天青所指示的培養(yǎng)基氧化還原電位還不能滿足要求，仍需添加一定數(shù)量的還原劑如硫化鈉，使得培養(yǎng)基的氧化還原電位進(jìn)一步降低。（2）硫化鈉的母液應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。（3）滅菌后的培養(yǎng)基應(yīng)為淡黃色，如果出現(xiàn)粉色甚至是紫色，表明氧化還原電位已經(jīng)升高，培養(yǎng)基已不適合專性厭氧菌的生長。4）配制好的培養(yǎng)基應(yīng)盡快使用。附：本實驗所用培養(yǎng)基和試劑1.解纖維梭菌（Clostridiumcellulolyticum）培養(yǎng)基（g/L）：(NH4)2SO41.30，KH2PO41.50，K2HPO4?3H2O2.90，MgCl2?6H2O0.20，CaCl2?2H2O0.075，微量元素溶液1.0ml（配方見下），刃天青（resazurin）母液1ml，酵母粉2.0，纖維素10.0，蒸餾水定容至1000ml。其中：刃天青母液：用無菌水配制濃度為0.1%的母液，置于4℃冰箱保存。2.微量元素溶液配方HCl(25%；7.7M)10.00ml，F(xiàn)eCl2?4H2O1.50g，ZnCl270.00mg，MnCl2?4H2O100.00mg，H3BO36.00mg，CoCl2?6H2O190.00mg，CuCl2?2H2O2.00mg，NiCl2?6H2O24.00mg，Na2MoO4?2H2O36.00mg，蒸餾水990.00ml首先，將FeCl2用鹽酸溶解，然后用水稀釋，再加其它鹽，最后定容至1000ml。厭氧微生物的分離培養(yǎng)一．實驗?zāi)康膶W(xué)習(xí)幾種厭氧微生物的培養(yǎng)方法。二.實驗器材1.菌種：巴氏固氮梭菌(Clostridiumpasteurianum)，解纖維梭菌（Clostridiumcellulolyticum）。2.培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，皰肉培養(yǎng)基(配制方法見本實驗步驟-2)，實驗十一中所配制的解纖維梭菌培養(yǎng)基。3.其他儀器及用品：焦性沒食子酸，10%NaOH，棉花，滅菌的石蠟凡士林(1:1)，1mg/ml的刃天青母液，厭氧罐，催化劑袋，氣體發(fā)生袋，指示劑袋，滅菌的帶橡皮塞或螺旋帽的大試管，滅菌的玻璃板（直徑比培養(yǎng)皿大3~4cm），滅菌的滴管，燒瓶，刀，亨蓋特滾管，厭氧瓶，微波爐，滅菌鍋。三.實驗步驟1．厭氧罐培養(yǎng)法（1）用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基倒平板，凝固干燥后，取兩個平板，以劃線的方法接種巴氏芽孢梭菌，將已接種的平皿置于厭氧罐的培養(yǎng)皿支架上，而后放入?yún)捬跖囵B(yǎng)罐內(nèi)。美藍(lán)指示條厭氧罐氣體袋美藍(lán)指示條厭氧罐氣體袋圖3厭氧罐外觀圖圖4厭氧罐內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖（2）剪開催化劑袋，將催化劑倒入?yún)捬豕奚w下面的多孔催化劑盒內(nèi)，擰緊催化劑盒的盒蓋。厭氧罐中的鈀或鉑催化劑在使用過程中會被培養(yǎng)環(huán)境中的水汽、硫化氫或一氧化碳污染，從而失去催化能力，因此在每次培養(yǎng)前，催化劑都必須在140~160℃的烘箱內(nèi)烘2h，以使其充分活化。（3）剪開氣體發(fā)生袋的切碎線處，并迅速將此氣體發(fā)生袋置罐內(nèi)金屬架的夾上，再向袋中加入約10ml水。同時，由另一人配合，剪開指示劑袋，將指示條暴露，立即放進(jìn)罐內(nèi)。必須在一切準(zhǔn)備工作就緒后再往氣體發(fā)生袋中注水，加