在Lager酵母發(fā)酵產生二氧化硫過程中線粒體可能扮演的角色

在Lager酵母發(fā)酵產生二氧化硫過程中線粒體可能扮演的角色付臣譯自ASBCJ-2012-0828-01摘要：二氧化硫是釀造家尋求控制的Lager酵母主要的代謝產物之一，因為它對Lager啤酒的質量有多重復雜的影響。酵母細胞當在高葡萄糖麥汁中發(fā)酵時，易受影響而產生較高的二氧化硫已經被廣泛報道，但是確切的機理仍然沒有得到充分的了解，已知當酵母細胞利用葡萄糖作為初始碳源作為生長物質時，這會對線粒體進化產生負面影響，特別是在它的僅有的膜脂，雙磷脂酰甘油中。在本研究中，我們給出了一個用雙磷脂酰甘油合成促進劑L-甲狀腺氨酸和甘油）和抑制劑（肌糖），來針對改變雙磷脂酰甘油的形成和線粒體進化的培養(yǎng)試驗結果，這些結果證實在促進雙磷脂酰甘油形成的條件下以適應乙醇產生，有明顯低的亞硫酸鹽含量（P<0.05），另外，用呼吸缺陷型突變菌株發(fā)酵與其親代菌株對比，通過測量亞硫酸鹽產量與攝入的硫酸鹽數量之比，也顯示出呼吸缺陷型突變菌株有明顯低的亞硫酸鹽轉化效率（P<0.05）。這些發(fā)現暗示，這種被忽略的細胞器對亞硫酸鹽產生可能有至關重要的作用，我們推測它與一個關鍵的酶復合體輔基，亞硫酸鹽還原酶有關。這個輔基，也就是[4Fe-4S]鐵硫簇，提供了亞硫酸鹽還原酶電子的催化部位，以減少二氧化硫變成其它硫化物。假設線粒體ATP水平的限制，影響了[4Fe-4S]的簇狀構造或者由于胞液脫輔基蛋白的變化影響了簇的輸出。關鍵詞：雙磷脂酰甘油，鐵硫簇，線粒體，亞硫酸鹽還原酶，SO2導言二氧化硫（SO2）是酵母在發(fā)酵期間形成的一種重要的代謝物，它影響啤酒質量的許多特性，它作為啤酒中一種抗氧化劑的角色已經被證實，但是它在啤酒風味穩(wěn)定性方面的角色是引起爭議的，因為已經證明在發(fā)酵期間二氧化硫將鍵合風味活性羰基形成風味中性的a-羥基磺酸鹽，Dufour先生暗示這些化合物在發(fā)酵期間不能被酵母還原，但在包裝的成品酒中會被釋放，如此導致早期的風味敗壞。二氧化硫也提供了一個膠體穩(wěn)定性的角色，而且眾所周知在葡萄酒發(fā)酵中作為一個抗氧化劑的作用。但是，過了一個世紀后，知道通過人類挑戰(zhàn)實驗，二氧化硫的攝入能導致咽喉刺激、胃與腸刺激及嘔吐、頭痛、低色指數性貧血和其它方面的影響，因此許多國家的監(jiān)管機構都制定了一個包裝產品中的SO2法定限量。再者，已經報道二氧化硫與異味有關，因此懂得在釀造過程中二氧化硫形成的控制對釀造者來說是很重要的。在發(fā)酵麥汁中二氧化硫的形成已經被很好的描述過了。在硫的生物合成期間，包括氨基酸蛋氨酸和半胱氨酸，硫酸鹽被主動運輸穿過質膜，硫酸鹽通過NADPH直接還原成亞硫酸鹽是不可能發(fā)生的，因為這個反應要吸收很高的能量（△G°/=+45.2kJ/mol），但是這個反應能夠通過ATP硫酸化酶，通過硫酸鹽的腺嘌呤基化，使它的電位降低而完成。圖1中給出了相應的步驟，圖示說明了酸性亞硫酸鹽（HSO3-）如何形成，哪一個是還原h(huán)so3-為硫化物的亞硫酸鹽還原酶（SiR）的底物。盡管酵母對細胞內HSO3-的累積有一個基本的耐受性，但它可能是細胞毒素，因此通過SSU家族基因調節(jié)的防護機制存在以便向細胞外泵出有毒中間物。減少SIR活性將會使發(fā)酵麥汁中SO2含量提高已經被提出，目標對準MET

基因，尤其是MET1、MET5、MET8和MET10基因的基因控制研究已經證明對亞硫酸鹽產生有明顯的影響。釀酒酵母的SIR是一個604KDa的蛋白質，它有一個a2P2構造，也包含參與HSO3-還原的輔基，這些基團的其中兩個與基于細菌亞硫酸鹽還原酶同化力的此反應密切相關。siroheme（可能叫白亞鐵血紅素）分子（圖2A），一個包含四氫卟琳的鐵，和一個由一個［4Fe-4S］五環(huán)辛烷組成的硫簇鐵（ISC）（圖2B）合作，把推挽式的6個電子轉移到SIR催化部位的酸性亞硫酸鹽鍵上，這個所推薦的HSO3-完全還原是由Crane等人的研究提供的（圖3）,對于解釋一旦hso3-鍵合到催化部位上便沒有中間體被釋放出來是很重要的。因此，siroheme（可能叫白亞鐵血紅素）或ISC的效能和結構的任何改變都能導致SIR活性的降低，似乎是合理的。SulphateTrutispifrienCellWall\LASTATPADPSulphateTrutispifrienCellWall\LASTATPADPPAPSN.ADPH.I'rjt(njd1PAFSReductasePAP+NADP+Snip/irtePumpHSRPAPSN.ADPH.I'rjt(njd1PAFSReductasePAP+NADP+Snip/irtePumpHSR；-SulphiteReductase6EI..OTowardcysandmetbiosynthesis,^<***圖1.釀造酵母在硫酸鹽同化途徑過程中，亞硫酸鹽的形成和排出。圖2.亞硫酸鹽還原酶復合體的輔基siroheme（可能叫白亞鐵血紅素）（a）和［4Fe-4S］硫簇鐵（b）。研究者已經證明的一個現象是高葡萄糖含量麥汁的影響導致了亞硫酸鹽生成的增加，Gyllang等人建議，較高的亞硫酸鹽量是在糖酵解和酒精發(fā)酵期間，生成的乙醛和丙酮酸鹽在細胞內積累的結果，兩者都與亞硫酸鹽鍵合，這就阻止了SIR酶使其減少。從另一個角度看，通過后來O'Conner-Cox先生及同事對于釀造過程中酵母線粒體角色的開創(chuàng)性研究，知道了當酵母利用葡萄糖作為碳源時，酵母線粒體的發(fā)育被束縛，線粒體是包含兩個膜的細胞器，內膜和外膜，兩者都含有獨特的被稱作雙磷脂酰甘油（1,3-二［1',2'-二酰-3'磷?；?sn-甘油］-sn-甘油;CL）的脂類（圖4）。雙磷脂酰甘油的生物合成與三個相繼的反應有關（圖5），磷脂酰甘油磷酸（PGP）合成酶催化了通過核苷酸胞腚-5'-三磷酸-1,2-二脂酰甘油（CDP-DG）和甘油-3-磷酸轉化形成CL的關鍵步驟，通過PGP磷酸酯酶作用，PGP去磷酸作用形成磷脂酰甘油是中間步驟，最后的步驟與CL合成酶有關，在這個地方發(fā)生了磷脂?；鶑腃DP-DG轉移到PG上。一些最新的證據表明，葡萄糖抑制了雙磷脂酰甘油的形成，其它的研究也已經證實肌糖抑制了PGP合成酶的活性，這對于雙磷脂酰甘油的形成是一個關鍵步驟。許多研究也顯示甘油可能通過增強CRD1（結構基因編碼CL合成酶）的表達而提高了線粒體的發(fā)育，并且甲狀腺氨酸（甲狀線素）已經顯示出在老鼠心臟線粒體中對這些酶的活性起促進作用。CL和許多鍵合蛋白質的線粒體膜相互作用，它與呼吸鏈酶復合儂、III,IV和V（ATP合成酶）及腺嘌呤核苷酸轉運體（AdN轉移酶）相關聯，它也在蛋白質進入線粒體過程中起了到關重要的作用。再者，CL的缺乏會導致線粒體DNA的不穩(wěn)定、活力減小及在高溫下能起作用的呼吸細胞減少。在最近的研究中，研究的焦點是用改變酵母中CL的含量，產生呼吸缺陷型

酵母細胞，評價對發(fā)酵的影響來確定線粒體與亞硫酸鹽產生的相關性，測定到線粒體起了一個作用，機制與前面提到的一個關鍵的SIR輔基有關。尺口匚皿T11rti圖3.Crane等人推薦的酸性亞硫酸鹽還原成硫化物的反應。電子通過［4Fe-4S］簇被傳遞，siroheme（可能叫白亞鐵血紅素）鍵合到底物上，同時質子被轉移到釋放出的H夕中，氧原子被轉移到酸性亞硫酸鹽還原的6個電子上形成硫化物。圖4.圖示說明的4個不飽和酰基部分的雙磷脂酰甘油（心肌磷脂抗原，CL）結構。圖5.CL生物合成途徑材料和方法實驗室規(guī)模發(fā)酵發(fā)酵用安裝有膠塞并頂部用石蠟膜封口的500ml無菌真空厄倫美厄燒瓶，在15℃冰箱中完成，為了把氧的進入降到最低，橡膠管被連接到另一端浸入水中的真空口上，以允許CO2的逸出及阻止氧氣的進入。所有發(fā)酵都是控制可發(fā)酵性糖90%是葡萄糖，10%是麥芽糖，沒有麥芽三糖的17°P麥汁。發(fā)酵10天后，取樣分析，所有樣品都立即在溫度4℃,3,300義g速度下離心30min以去除酵母。離心后，嫩啤酒樣品轉入另一容器立即冷藏直到分析，如果進行H2s分析，樣品冷貯需要在24小時內分析。呼吸缺陷型酵母培養(yǎng)呼吸缺陷型（RD）酵母突變菌株收集自我們的常規(guī)酵母質量研究室RD平皿分析，一標準瓊脂培養(yǎng)基用于在30℃下有氧培養(yǎng)酵母96小時，雙倍的帶有瓊脂的磷酸緩沖液（6.1g的NaH2PO4,5.8g的Na2HPO4,15.0g的瓊脂同500mL的DI水混合）和雙倍的顏色指示劑（1.0g的2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）同500mlDI水混合）混合成等份的無菌混合物，傾倒在平皿上，平皿在室溫下面向上培養(yǎng)4小時，包含TTC（2.og/L）的溶化的軟瓊脂用做顏色指示劑覆蓋物。用無菌環(huán)從TTC覆蓋的與RD相關的顯示白色形態(tài)的兩個菌落中挑取酵母，接種到培養(yǎng)燒瓶中，用于培養(yǎng)的麥汁初始體積是50ml。麥汁和酵母被轉移到一個無菌的塑料厄倫美厄燒瓶中，放在一個軌道振蕩器中振蕩24小時，培養(yǎng)溫度要準確控制在25℃,酵母要在同樣的條件下使用250ml和1000ml更大規(guī)模的分別培養(yǎng)48小時和72小時，一旦足夠的酵母數量產生，酵母就要再接種三次，以便增殖有氧生長的突變體，從每三次培養(yǎng)中收集啤酒樣品，分析酒精、外觀發(fā)酵度、CO2和殘余的蛋氨酸和硫酸鹽。RD酵母實驗在添加酵母之前，收自于生產初始狀態(tài)一系列控制發(fā)酵的健康新鮮酵母（活力97.2%）以與RD酵母進行對比，RD酵母和控制酵母菌落的細胞濃度用血球計分析以測定接種比例，目標是細胞濃度達到19.0義106個細胞/mL,麥汁用一個無菌氣體分散裝置充氣，使氧氣達到飽和度（8-10mg/L）,使用簡單的完全隨機化的設計，使每一個酵母實驗都被接種三次。CL變更實驗為了改變CL的形成，酵母在三個不同條件下培養(yǎng)，酵母泥以7ml的等分部分用上述討論的各種處理方式在40ml的無菌水中培養(yǎng)18小時，以改變雙磷脂酰甘油的形成：肌糖（1mg/mL）、甘油（40%體積）、15.0Pg/mL的甲狀腺素、和無菌水。培養(yǎng)的酵母泥添加到氧氣含量為12.0mg/L的麥汁中。肌糖購買于本地的小賣部，甘油從Sigma-Aldrich公司獲得（純度99.5%光譜測量級），甲狀腺素（左旋甲狀腺氨酸鈉）藥片從VirbacAH有限責任公司獲得，作為完全的隨機化設計，所有的實驗都被接種三次。H2s分析啤酒中的硫化氫含量用氣相色譜（GC）（安捷倫6890A）測量，氣相色譜柱是一個MXT-1（100%二甲基聚硅氧烷交聯），60m,0.53mmID,7pm膜厚度，編目號#70193,一個安捷倫頂空自動進樣器（安捷倫G1888）用于凈化和分離樣品，一個Sievers355硫化學發(fā)光檢測器（SCD）用于區(qū)分硫種類，發(fā)酵結束后離心的樣品被冷貯（大約6℃）在干凈的40ml的玻璃小瓶中（安捷倫頂空螺旋蓋）直至分析。氣相色譜灶溫條件如下：初始溫度50℃,以10℃/min的升溫速率升到80℃,接著以10℃/min的升溫速率220℃,運行9min。氨基酸用帶有可編程熒光檢測器和有柱前衍生化的四個一組泵的安捷倫1100系列的高效液相色譜儀（HPLC）測定氨基酸，首先用苯二醛和3-巰基丙酸控制伯氨基酸的衍生，然后仲氨基酸用9-熒光尼龍甲氧氯甲酸酯衍生，然后衍生物在一個反相ZorbaxEclipseAAA柱（安捷倫分析柱，4.6X150mm,3.5^m）上分離，并且用安捷倫1100系列可編程熒光檢測器進行熒光檢測，蛋氨酸是令人感興趣的伯氨基酸，半胱氨酸不能用這個方法檢測。無機離子和有機酸在本實驗中硫酸鹽是感興趣的主要無機離子，DionexCDMII電導檢測器，IonPacAS11柱，IonPacAS11加裝防護柱，和ATC-3前置柱及ASRSUltraII自回收干擾抑制器被使用。二氧化硫總二氧化硫用通過流動進樣分析改良的副品紅化學法測定，Skalar系列設備用于分析，包括SA1000自動取樣器、SA5000化學裝置單元，及Skalar反應器和控制器。比重、酒精、濃度和PH使用帶有AlcolyzerPlus酒精分析儀的安東帕DMA5000比重計和VarianCary50分光光度計測量麥汁和發(fā)酵樣品的比重、酒精、外觀濃度和實濃。PH測量用Altexm70pH計進行。菌量在實驗室發(fā)酵期間生產的菌量總濕重，在嫩啤酒被輕輕從厄倫美厄發(fā)酵燒瓶中轉入另一容器之后被測定，在酵母再懸浮前，酵母和燒瓶中殘存的啤酒混合并補足去離子水，然后轉移到預先稱重的離心管中，酵母泥在4,000RPM下4℃離心30min,當離心完，啤酒被轉入另一容器，讓酵母留在離心管中，測量此酵母和離心管的重量便是總濕重，用總濕重減去離心管的重量便是一共產生的生物量，再減去接種的量，以確定后形成的菌量。統(tǒng)計分析方差分析（ANOVA）法被使用來分析實驗數據，詳細方法可在別處找到，所有分析都用版本15的Minitab軟件來完成。結果和討論呼吸缺陷型酵母的培養(yǎng)在酵母轉移到隨后的燒瓶中期間，完成培養(yǎng)過程后，啤酒樣品就被收集以分析5。2、酒精、PH和殘存的蛋氨酸和硫酸鹽（表1）,每一個連續(xù)的培養(yǎng)都使用同樣的麥汁樣品，此麥汁樣品是無菌的、冷貯的（4℃）直到使用。數據檢測提示了一個有趣的情況，經過培養(yǎng)，隨著蛋氨酸利用的降低和硫酸鹽攝入的增加，SO2含量升高，人們普遍認為提高麥汁溶解氧將導致較低的亞硫酸鹽產生，在培養(yǎng)期間使用給定的有氧條件，這些亞硫酸鹽含量顯示出相當高，并且硫酸鹽攝入的增加優(yōu)先于蛋氨酸的利用，暗示RD酵母細胞通過硫酸鹽的同化途徑正在合成S-氨基酸和其它的硫化合物。硫酸鹽的攝入被兩個硫酸鹽轉運體（高親和力和低親和力硫酸鹽轉運體，圖1）促進，控制這些蛋白質的基因表達通過細胞內的S-腺苷蛋氨酸（SAM）含量緊密調節(jié)，這樣，SAM細胞內的含量在硫酸鹽同化途徑中，在酵母繁殖期間能被耗盡，給出了升高的SO2含量，在亞硫酸鹽形成之后這種堵塞可能發(fā)生。RD酵母發(fā)酵實驗終結發(fā)酵（EOF）的啤酒化學參數的結果提供在表2中，實驗的目標是評價如果RD突變體與它們的親代相比是否產生較高含量的SO2，這些研究結果與這個研究假說相矛盾，但是值得注意的是RD酵母發(fā)酵甚至不比親代弱，在別處也報道過這樣的發(fā)現。再者，控制酵母比RD突變體利用了更多的硫酸鹽，對于解釋這些結果，一個非傳統(tǒng)的方式是比較亞硫酸鹽產生的水平與硫酸鹽利用的數量，它將在酵母同化硫酸鹽，生物合成生長必須的S-氨基酸和SAM的效率程度方面提供一個尺度，從方差分析結果（表3）顯示，在轉化過程中RD酵母效率低（P<0.05）（圖.6）。為了定量在這個實驗期間RD酵母增殖培養(yǎng)后的純度，買到了一個添加酵母泥的樣品以備呼吸缺陷型分析，標準的TTC覆蓋用于找出呼吸缺陷型和呼吸充足型酵母之間的微小差別（圖7）。基于這些結果，增殖培養(yǎng)產生了大約29%RD酵母的混合物，對于作者的了解，這是第一個與RD酵母影響SO2生成的相關報道。很清楚，額外的研究需要準確地定量這個影響是什么，但是在這個實驗中已經證實RD酵母妨礙了硫酸鹽的同化效率，確切的機制是什么仍然需要被研究，但已經證明crdlA突變體更易于有呼吸缺陷的傾向，因此可能這與唯一的線粒體脂質，CL有關。雙磷脂酰甘油改變實驗來自實驗的結果顯示在表4中，此實驗中CL的促進物和抑制物都被用于培養(yǎng)實驗中。SO2檢驗的結果突出顯示了富含肌糖的培養(yǎng)酵母泥的影響，并且假定這些培養(yǎng)酵母細胞的雙磷脂酰甘油的發(fā)育被抑制，這就暗示了一個與線粒相關的作用。本來預計酵母用L-甲狀腺素培養(yǎng)的發(fā)酵，應該產生較低的SO2含量，可是這些發(fā)酵有了一個更高程度的衰減，在這些發(fā)酵中，對于S-氨基酸和SAM的需求會更高是合乎邏輯的，所以要分析數據的另一種方法是使酒精發(fā)酵過程中產生的SO2標準化，這些對比顯示的表5中，證明了在肌糖和L-甲狀腺素培養(yǎng)實驗之間處理方式上的明顯差別（P<0.05）（圖8），另外為了支撐增強CL發(fā)育將導致亞硫酸鹽形成的減少這個想法，通過了一個更有效的硫酸鹽同化途徑，我們能看到酵母細胞用甲狀腺素培養(yǎng)的實驗中，蛋氨酸的充分利用（麥汁蛋氨酸是45.9mg/L）伴隨著硫酸鹽較高攝入的發(fā)生（表4）。酵母細胞用肌糖培養(yǎng)的發(fā)酵有較高的SO2含量，有適度的硫酸鹽攝入量和生物量形成（圖9）?？吹降牧硪粋€有趣的相關模式是在L-甲狀腺素實驗中發(fā)現了較高的H2s含量，可能意味著SO2形成后通過硫酸鹽同化途徑硫酸鹽流出的較多，硫酸鹽和蛋氨酸利用的相似模式在一個用缺乏脂質和富含脂質的對比發(fā)酵研究中也報道過。雙磷脂酰甘油也與另一個硫化合物，二甲基硫（DMS）通過線粒體蛋氨酸亞砜還原酶活性相關聯，Anness和Bamforth提出，在蛋氨酸亞砜和亞硫酸鹽還原酶之間，可能通過和硫氧還蛋白和它的酶的競爭存在一個關系，但是酵母亞硫酸鹽還原酶復合體不含有也不和硫氧還蛋白相互作用，然而Samp等人證實基于目前的結果，如果雙磷脂酰甘油的形成被加強，DMS生成將增加，SO2的生成將減少，這個明顯的負相關將在以后詳細闡明。與SIR中ISC缺乏相關的可能機制已經提出SIR的缺陷導致在發(fā)酵麥汁中亞硫酸鹽的積累，看一下酸性亞硫酸鹽是如何需要6個電子轉移到SIR催化腔內的硫酸鹽鍵上（圖3），如果[4Fe-4S]輔基在siroheme（可能叫白亞鐵血紅素）末端的普羅米克斯（乙烯系單體與蛋白質共聚物纖維）上失去，那么此反應將被阻礙。盡管ISC的形成和脫輔基蛋白的成熟機制今天已被闡明，但這些［4Fe-4S］簇在線粒體內合成的觀點已經建立，也已知線粒體ATP被需要去執(zhí)行這些步驟，例如，已經顯示不久后在線粒體內形成的伴侶蛋白質，Ssq1,與Fe-S簇密切相關，ATP耗盡將導致Fe-S蛋白質形成的完全崩潰。人們認為SIR是一種胞液蛋白，線粒體內膜ATP鍵合轉運體，Atm1蛋白質與成熟的SIR輸出機構有關，如此線粒體ATP對于完成ISC輸出到胞液是必須的。另外，來自Hausmann等人的結果證實，ISC胞液裝配蛋白例如Nbp35P的缺陷，導致SUL1基因2.7倍的誘發(fā)，并且證明通過減低成熟的SIR復合體的Fe-S簇，使亞硫酸鹽還原酶活性缺失，是硫酸鹽攝入量增加的原因。Seki等人證實siroheme（可能叫白亞鐵血紅素）自身能還原酸性亞硫酸鹽，但是速率較慢，所以在這種條件下，細胞內酸性亞硫酸鹽的累積將發(fā)生。那么線粒體ATP來源于什么地方呢？通過F0-F1ATP合成酶復合體的氧化磷酸化作用不可能是厭氧條件下發(fā)酵的原因，再者，克勒勃屈利效應（葡萄糖效應）保證了在此研究中麥汁中較高的葡萄糖含量及有氧條件將不會形成線粒體ATP，因此胞液ATP只是能流的來源，而且必須通過AdN轉移酶遞交，已經顯示CL以6：1的比率緊密地鍵合到AdN轉移酶上，并且知道CRDKCL合成酶）突變體有缺陷的AdN轉移酶。來自于RD酵母發(fā)酵，亞硫酸鹽與硫酸鹽的比率較高，意味著RD酵母缺乏CL的正常發(fā)育，于是線粒體ATP受到了限制。相反地，L-甲狀腺素實驗顯示了較低的，正?；膩喠蛩猁}生成，這是提高了雙磷脂酰甘油形成量，導致較高數量的線粒體ATP的結果。已知甘油促進了CRD1的表達，但是也證實在暴露在葡萄糖環(huán)境中，CRD1的表達幾乎完全被抑制。不幸的是，因為這些實驗中的麥汁含有較高濃度的葡萄糖，在甘油培養(yǎng)酵母實驗中，一旦細胞被接入富含葡萄糖的麥汁后，CRD1的表達可能立即被抑制。線粒體ATP的限制束縛了生長，許多作者都已經用圖解說明了亞硫酸鹽形成和生物菌量形成的負相關，在相關的研究中都把目標對準了低含量的線粒體ATP上，O’Connor-Cox等人把細胞暴露于米酵菌酸中，抑制了AdN轉移酶系統(tǒng)，發(fā)現亞硫酸鹽積累明顯升高，Lodoloetal等人指導的，用羰基氰化間氯苯腙（CCCP）做的相似實驗也顯示減少了CL合成酶的活性，同時這些報告說明遲緩發(fā)酵產生較高的SO2，遺憾的是在這些實驗中SO2沒有被檢測。在發(fā)酵過程中DMS和SO2生成的負相關可能與CL形成有關，已經提出很可能通過蛋白質進入功能影響線粒體內部的蛋氨酸亞砜還原酶活性，由于雙磷脂酰甘油的形成被增強，線粒體ATP的有效性被提高，及亞硫酸鹽還原酶復合體的支撐物［4Fe-4S］成熟，因此硫酸鹽的有效轉化發(fā)生導致較低的SO2生成，同時蛋氨酸亞砜還原酶還原二甲亞砜為DMS似乎是合理的。結論有證據支持了在發(fā)酵期間線粒體在二氧化硫生成中的作用，如果酵母線粒體膜的CL含量被降低，那么膜有功能將被改變，由于CL緊密地鍵合到AdN轉移酶蛋白上，蛋白又牢牢地嵌入膜中（圖10），因此線粒體ATP的受限制將發(fā)生，由于［4Fe-4S］的合成，這些簇的形成（圖2B）需要ATP，于是一個SIR中的重要輔基將被限制。再者，通過Atm1蛋白進行的伴侶ISC的輸出到胞液中由于需要ATP也會受到影響。也有一個可能性是CL能與Atm1蛋白相互作用，如此帶有［4Fe-4S］簇的細胞溶質sir復合體將完全不成熟，因此當電子轉移以還原酸性亞硫酸鹽時催化部位將不起作用。由于一旦HSO3-鍵合到SIR上，就沒有中間物被釋放，這使亞硫酸鹽還原形成堵塞，導致在細胞內積累，假定存在的亞硫酸鹽

泵由于細胞內HSO3-累積會將HSO3-排出細胞外進入發(fā)酵麥汁中，同時細胞內SAM的耗盡導致更多硫酸鹽的攝入。表1.每一個培養(yǎng)結束后的啤酒樣品的化學結果參數培養(yǎng)1培養(yǎng)2培養(yǎng)3總SO2(mg/L)11.828.638.1酒精(％w/w)3.476.126.74蛋氨酸(mg/L)14.519.025.2硫酸鹽(mg/L)92.168.952.7表2.RD酵母實驗的EOF啤酒化學結果實驗總SO2(mg/L)酒精(％wt/wt)濕濃度(mg/L)SO42■攝入(mg/L)AE(°P)EOFpHRD酵母23.55.0820.222.55.514.37RD酵母24.55.0919.617.05.284.37RD酵母22.65.1520.917.05.374.37控制酵母29.45.8424.341.53.994.49控制酵母32.36.0323.944.83.574.45控制酵母30.26.1324.942.33.334.47表3.RD酵母實驗中亞硫酸鹽生成與硫酸鹽消耗比率的方差分析表變異來源Df平方和均方F-比P值酵母類型10.46440.464422.170.009誤差40.08380.0209總計50.5482

總SO2(mg/L)酒精(%wt/wt)濕濃度(mg/L)SO42-攝入(mg/L)生物量(g)EOFpHH2s(Mg/L)控制123.35.5930.341.16.714.494.5控制225.45.7333.345.77.454.463.1控制323.35.7229.141.58.864.4610.6甘油122.75.3333.043.28.504.463.2甘油221.8