膜蛋白的提取與分離

膜 蛋 白 的 提 取 與 分 離膜蛋白的分離一、簡(jiǎn)介：1細(xì)胞質(zhì)膜資料1895年,Overton 從研究細(xì)胞透性得出 "細(xì)胞膜由連續(xù)的脂類物質(zhì)組成"。1925年Gorter&Grendel:用脂單分子膜技術(shù)測(cè)定細(xì)胞膜中脂分子的總面積，提出："細(xì)胞膜是由雙層脂分子組成 "。1935年Danielli&Davson：從測(cè)定膜的表面張力得出細(xì)胞膜的 "三明治結(jié)構(gòu)模型"，即蛋白質(zhì)－脂-蛋白質(zhì)。1959年Robertson:用電鏡觀察生物膜提出 "單位膜模型"，將膜的分子結(jié)構(gòu)與超微機(jī)構(gòu)統(tǒng)一起來(lái)厚度：2(暗)+3.5(亮)+2（暗）=7.5細(xì)胞質(zhì)膜的主要功能概括如下：為細(xì)胞的生命活動(dòng)提供相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境;選擇性的物質(zhì)運(yùn)輸，包括代謝底物的輸入與代謝產(chǎn)物的排除，其中伴隨著能量的傳遞；提供細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，并完成細(xì)胞內(nèi)外信息跨膜傳遞；為多種酶提供結(jié)合位點(diǎn)，使酶促反應(yīng)高效而有序地進(jìn)行；介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)之間的連接;質(zhì)膜參與形成具有不同功能的細(xì)胞表面特化結(jié)構(gòu)。proeinmicroarray2膜蛋白雖動(dòng)物細(xì)胞主要有9種膜脂，而膜蛋白的種類繁多，多數(shù)膜蛋白分子數(shù)目較少，但卻賦予細(xì)胞膜非常重要的生物學(xué)功能。根據(jù)膜蛋白分離的難易及其與脂分子的結(jié)合方式，膜蛋白可分為兩大類型：外在膜蛋白、內(nèi)在膜蛋白。外在膜蛋白為水溶性蛋白，靠離子鍵或其它較弱的鍵與膜表面的蛋白質(zhì)分子或脂分子結(jié)合，因此只要改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度甚至提高溫度就可以從膜上分離下來(lái)，膜結(jié)構(gòu)并不被破壞。內(nèi)在膜蛋白與膜結(jié)合非常緊密，一般講只有用去垢劑(detergent)使膜解后才可分離出來(lái)。獲得大量有生物學(xué)活性的質(zhì)膜蛋白對(duì)我們顯得非常的重要。附注：使用分級(jí)抽提方法獲得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具備多跨膜區(qū)的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前為止，仍然是蛋白組學(xué)的一個(gè)瓶頸，不管采用２－Ｄ技術(shù)也好，ＩＣＡＴ乃至都還不能有效解決這一問(wèn)題。二、蛋白抽提三、談及蛋白分離，我們想到：超速離心，鹽析法、超濾法、凝膠過(guò)濾法、等電點(diǎn)沉淀法、離子交換層析、親和層析、吸附層析、逆流分溶、酶解法??有時(shí)這些方法常常組合到一起對(duì)特定的物質(zhì)進(jìn)行分離純化。由于蛋白質(zhì)種類繁多，不同的蛋白質(zhì)由于結(jié)構(gòu)和組成的差異，其溶解度也各不相同.根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解特性，同時(shí)可選擇不同的溶劑提取，分為水溶液提取和有機(jī)溶劑提取 .四、但是針對(duì)膜蛋白的提取與細(xì)胞質(zhì)蛋白，核蛋白提取不同之處在于它是嵌在膜中的，水溶性不好，基本方法就是用不同的離心速度去掉胞質(zhì)蛋白等，最后用去污劑把蛋白從膜中釋放出來(lái)。膜蛋白分離純化的重要步驟是選擇適當(dāng)?shù)脑鋈苡帽砻婊钚詣?，一般常用的有膽酸鹽，CHAPS(一種離子去污劑），Emulgen和Lubrol等表面活性劑。五、1、分離膜蛋白的方法（原則性）：六、1）先分離膜，然后提??；如選用冷熱交替法、反復(fù)凍融法、超聲破碎法、玻璃勻漿法、自溶法和酶處理法使得細(xì)胞破碎，然后通過(guò)剃度離心得到含有膜蛋白的粗組分。（例如：michael11 液氮研磨組織，加入勻漿緩沖液及蛋白酶抑制劑。差速離心。蔗糖密度梯度離心。收集37%與41%間的成分，即為質(zhì)膜部分。裂解即可收集膜蛋白）七、2）用特殊的去污劑選擇性的分離。從膜上提取蛋白有許多困難 .在多數(shù)情況下，都是采用去垢劑將疏水蛋白從其膜結(jié)構(gòu)中溶解下來(lái)，然后將蛋白質(zhì)穩(wěn)定.去垢劑的選擇通常是依據(jù)他對(duì)所需要蛋白質(zhì)的提取效率來(lái)確定，但在某些情況下，還要考慮到以后的純化步驟.雖然許多膜蛋白必須在去垢劑存在的情況下進(jìn)行純化，但最終仍可能需要除去去垢劑.這常常會(huì)引起蛋白質(zhì)失活，但如果蛋白質(zhì)是用于測(cè)序的，他將不是一個(gè)問(wèn)題.如果不是用于測(cè)序的，可考慮使用能夠黏附去垢劑的疏水珠.許多文獻(xiàn)和生化試劑供應(yīng)商的產(chǎn)品目錄中，都介紹有許多種不同的可用來(lái)溶解膜蛋白的去垢劑.然而，他們并不是普遍適用的.在設(shè)計(jì)膜蛋白溶解方案時(shí)，必須考慮某一去垢劑的特殊性質(zhì).如tritonX-100在280nm處有吸收，如果某蛋白質(zhì)的測(cè)試與280nm處的吸收有關(guān)，就應(yīng)避免使用這類去垢劑.八、將膜制劑與胞質(zhì)蛋白及細(xì)胞核分離后，再進(jìn)一步從細(xì)胞膜制劑中將所需的膜蛋白增溶下來(lái) .這種做法的好處是可以用強(qiáng)烈的去垢劑提取細(xì)胞骨架的相關(guān)蛋白，而無(wú)需考慮胞質(zhì)蛋白、細(xì)胞核成分或染色質(zhì)成分的混入.使用這種方法所獲得的膜蛋白，無(wú)論在種類上還是數(shù)量上，都比酸溶解法所得到的蛋白（ <5000Da）要多.一般提取的膜蛋白量往往只占膜蛋白總量的不足 0.1%，所以充分的膜蛋白的提取，無(wú)疑對(duì)于研究膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能都是非常重要的.第二種方法簡(jiǎn)單，可靠，但有時(shí)含有其他蛋白。一般的都是利用4度時(shí)所有的蛋白質(zhì)原則上都溶于TritonX114水溶液，在溫度超過(guò)20度時(shí)，此溶液分為水相和去污相；此時(shí)親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。利用此性質(zhì)可提取膜蛋白。九、3 ) 膜 蛋 白 色 譜 (Chromatography of MembraneProtein,CMP)CMP+分離強(qiáng)疏水性蛋白、多肽混合物的層析系統(tǒng)，一般有去垢劑（如SDS）溶解膜蛋白后形成 SDS-融膜蛋白，并由羥基磷灰石為固定相的柱子分離純化。羥基磷灰石柱具有陰離子磷酸基團(tuán)（P-端），又具有陽(yáng)離子鈣（C-端），與固定相結(jié)合主要決定于膜蛋白的大小、SDS結(jié)合量有關(guān)。利用原子散射法研究cAMP的分離機(jī)制發(fā)現(xiàn)，樣品與SDS結(jié)合后在離子交換柱上存在SDS分子、帶電荷氨基酸與固定相中帶電離子間的交換，從而達(dá)到分級(jí)分離的目的。十、層析柱提?。▍⒉襟E）十一、十二、4)順序抽提法：根據(jù)細(xì)胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進(jìn)行抽提的方法。用Tris堿溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白；把未溶解的pellet用標(biāo)準(zhǔn)液溶解提取高疏水性蛋白；最后用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液，最后可以再次抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白。十三、5)centrifugalproteinextraction .離心的原理：高滲的蛋白裂解液讓細(xì)胞溶漲破裂后，超高速離心評(píng)價(jià)：盡管分級(jí)(胞漿和胞膜)之間有清洗的步驟,但是可溶蛋白組分和膜蛋白組分之間仍然有不少重復(fù)的點(diǎn) .該方法相較MOLLOYMP教授在1998年electrophoresis上發(fā)表的分級(jí)抽提法減去了第一步 (用tris抽提水溶性蛋白)和最后一步(極難溶蛋白),在操作上也作了簡(jiǎn)化,總而言之是一種不錯(cuò)的方法。（codegreen）6)detergent-based：提取時(shí)先裂解液裂胞膜（選用不同的去污試劑是關(guān)鍵），梯度離心分離細(xì)胞器(ER)，然后分級(jí)抽提方法。例如，去掉細(xì)胞器之后的DEBRIS就是核膜，再裂解得到核膜蛋白。而膜蛋白是裂胞膜時(shí)不溶的部分?？偟母惺埽杭?xì)胞的量要很充足。之后的定性鑒定常用的方法有雙向免疫擴(kuò)散、免疫電泳及聚丙稀酰胺凝膠電泳等。純化蛋白質(zhì)濃度的定量測(cè)定可用雙縮脲法、酚試劑法或紫外光吸收法定量鑒定膜蛋白，方便迅速。到目前為止，提取膜蛋白仍然是蛋白學(xué)的一個(gè)瓶頸。2、分離膜蛋白的方法（操作）1）分離細(xì)胞膜蛋白的方法：1冰上刮下細(xì)胞后將細(xì)胞溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液A中，于室溫與液氮罐中反復(fù)凍融2次。5000轉(zhuǎn)4度離心，驅(qū)除核及未裂解的細(xì)胞。3取上清12000轉(zhuǎn)4度離心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液中。412000轉(zhuǎn)4度離心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液 C中提取后測(cè)蛋白濃度,SDS電泳，分裝后-20度保存?zhèn)溆谩ufferA:1mMkcl,5mMNacl,3mMMgcl2,50mMHepes,1mMDTT,0.5ug/mlLeupeptin,20uMpmsf(PH=7.4)bufferB:1mMkcl,5mMNacl,3mMMgcl2,50mMHepes,1mMDTT,0.5ug/mlLeupeptin,20uMpmsf(PH=7.4)1mMEGTAbufferC:0.5ug/mlLeupeptin,20uMpmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),2）分離細(xì)胞膜蛋白的方法：1、細(xì)胞放在冰上，去除上清，用 pH7。4的冷磷酸鹽緩沖液洗滌單層細(xì)胞兩次2、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min3、刮下單層細(xì)胞，4度下10000g5min離心4、溶液37度水浴10min以分離水相和去污劑相，然后 37度下2000g離心5min5、收集水相留作分析6、用500ul冰冷的bufferC溶解去污劑相沉淀，冰浴 2min后加溫，在按步驟6再次離心7、按步驟8再次抽提去污劑相，用 bufferC將洗滌后的去污劑相稀釋到初始體積8、用等量的bufferA分別稀釋水相與去污相，并進(jìn)行免疫沉淀實(shí)驗(yàn)試劑：1、2%tritonX114:2%TritonX114 、50mmol/LTrisHCl（pH7。5）、蛋白酶抑制劑2、緩沖液A（含0。5mol/LNaCl的RIPAbuffer）3、bufferC10mmol/LTrisHCl(pH7.5)150mmol/LNaCl5mmol/LEDTA(PH7.5)3）分離細(xì)胞膜蛋白的方法：7Murea2Mthiourea4%chaps2.5%sb3-101000000個(gè)細(xì)胞，可用此 buffer1ml。冰浴勻漿。冰上置30分鐘。4度高速低溫離心30min。取上清-20保存。4）分離組織膜蛋白的方法：1、取組織，加入10mlBufferA于冰上充分勻漿。2、J6-HC離心機(jī)800rpm，4℃離心10min后，所得上清液轉(zhuǎn)入超速離心管。3、100000g，4℃離心1hr。棄去上清，沉淀用適量的BufferB重懸，冰上孵育2hr后分裝至EP管，Eppendorf臺(tái)式離心機(jī)10000rpm，4℃離心30min。4、收集所得上清液即為膜組份。BufferA：0.32M蔗糖，5mMTris-HCl（PH7.5），120mMKCl，1mMEDTA,1mMEDTA,0.2mMPMSF,1ug/mlLeupeptin,1ug/mlPepstatinA,1ug/mlAprotinin。冰上預(yù)冷。BufferB：20mMHEPES（PH7.5），10%甘油，2%TritonX-100,1mMEDTA,1mMEDTA,0.2mMPMSF,1ug/mlLeupeptin,1ug/mlPepstatinA,1ug/mlAprotinin。冰上預(yù)冷。5）分離組織膜蛋白的方法：RIPA1XPBS1%NP400.5去氧膽酸鈉0.1%SDS以下用時(shí)加入10mg/mlPMSF異丙醇（終濃度10ul/ml）Aprotinin（30ul/ml）1000mMSodiumOrthovandate （10ul/ml）冰凍組織100mg/細(xì)胞1000000個(gè)，可用RIPAbuffer1ml。冰浴勻漿。冰上置30分鐘。4度高速離心30min，20000轉(zhuǎn)低溫離心最佳。取上清-20保存。6）分離細(xì)菌膜蛋白的方法：①于20ml營(yíng)養(yǎng)肉湯中過(guò)夜培養(yǎng)細(xì)菌， 37℃，200rpm。②10000g、20min、4℃離心，去上清。③20ml預(yù)冷的Tris-Mg緩沖液重懸，同樣條件離心，再重懸于預(yù)冷的Tris-Mg緩沖液。④超聲波破碎細(xì)菌。⑤3000g，10min、室溫下離心去除未破碎細(xì)菌。小心吸取上清（含有胞質(zhì)成分和細(xì)菌外被成分）。⑥超速離心I：100,000g，60min，4℃，去除上清（胞質(zhì)成分），收集細(xì)菌外被成分。⑦用10ml含2％的 SLS的Tris-Mg緩沖液重懸沉淀物，室溫溫育20-30min。⑧超速離心II：70,000g，60min，室溫沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含細(xì)胞質(zhì)膜）。重復(fù)⑦、⑧兩步。⑨充分吸除上清，并根據(jù)沉淀體積大小用0.1-0.2ml的ddH2O重懸沉淀物。根據(jù)公式：蛋白濃度 (mg/ml)=1.450D280-0.740D260 測(cè)定外膜蛋白濃度，調(diào)節(jié)蛋白濃度至 40ug/ul，該蛋白質(zhì)樣品-70℃貯存。試劑Tris-Mg緩沖液10mMTris-Cl5mMMgCl2pH7.3，4℃保存②2%(w/v)十二烷基肌氨酸鈉(SLS)7）來(lái)源于MethodsEnzymology(1974)1.取一定量酶處理的細(xì)胞，用勻漿器破碎，操作要溫和，使細(xì)胞膜保持完整。由于水與膜的疏水部分之間有反應(yīng)，因此要精確掌握分離介質(zhì)中的離心強(qiáng)度和滲透壓，以每克細(xì)胞濕重加 40ml介質(zhì)。2．用Potter-Elvehiem勻漿器，桿與壁間間隙0.5～0.6μm,14.4kr/min上下勻漿4～6次，每次5S。3．過(guò)濾勻漿液，150g離心10min，保留上清，沉淀部分加入 50μl介質(zhì)，用勻漿器1kr/min勻漿3次，150g離心10min，沉淀部分再加入上次勻漿的上清液。4．合并3次上清液，2kg離心10min，棄上清，沉淀部分溶于 100μl介質(zhì)，離心10min，棄上清，留沉淀。5．將沉淀部分加入70%蔗糖15份，然后分別置于三個(gè)離心管中，上面依次疊加54%、49%、45%，41%，37%蔗糖溶液各2、2、5、5、3份。6．700kg離心90min，分離介質(zhì)在1.16～1.18之間形成介面。7．收集 d為1.16～1.18g/ml 之間的細(xì)胞膜，加30倍的介質(zhì)以2.5kg離心10min，洗滌2次。8．保存于2.7mmol/L Tris-HClpH7.5緩沖液中，用于細(xì)胞膜的研究分析8）常用的制備粗制質(zhì)膜組分的方法：（所有操作都在4攝氏度下進(jìn)行）1.在冰冷的勻漿緩沖液中切碎組織塊，倒出血水。用勻漿緩沖液漂洗組織碎塊，并將它們置于冰上，重復(fù)上述操作，直至組織碎成 1mm3大小的碎片，且無(wú)可見(jiàn)的血。2.加入5倍（體積比）與組織塊體積的緩沖液，再置于冰浴的 Dounce氏玻璃勻漿器中，抽研10-20次，勻漿組織。3.勻漿4攝氏度600g離心10min，上清含細(xì)胞膜、線粒體和細(xì)胞溶膠。沉淀中有未破碎的細(xì)胞及細(xì)胞核。棄沉淀。4.上清4攝氏度8000g離心10min，沉淀線粒體。棄沉淀。5.上清4攝氏度10000g離心20min，棄上清。6.用勻漿緩沖液重懸沉淀，繼續(xù)勻漿，再次 4攝氏度，10000g離心20min，棄上清。7.用小體積的適宜緩沖液重新徹底勻漿沉淀。8.粗制的樣品可于干冰/乙醇中速凍，保存于-80攝氏度。9）用特殊的去污劑選擇性的分離。 簡(jiǎn)單，可靠，但有時(shí)含有其他蛋白。原理：4度時(shí)所有的蛋白質(zhì)原則上都溶于 TritonX114水溶液，但在37度時(shí)，此溶液分為水相和去污相；此時(shí)親水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污劑相中。/r