DB37-T 3824.4-2019 青貯飼料質(zhì)量檢測(cè)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范　第4部分：青貯飼料霉菌毒素檢測(cè)技術(shù)規(guī)程-（高清版）

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DB37山 東 省 地 方 標(biāo) 準(zhǔn)DB37/T3824.4—2019Technicalspecificationforsilagequalitytestingandevaluation—Part4:Technicalregulationofmycotoxindetectioninsilage2019Technicalspecificationforsilagequalitytestingandevaluation—Part4:Technicalregulationofmycotoxindetectioninsilage2019122420200124山東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布前言DB37/T3824—2019《青貯飼料質(zhì)量檢測(cè)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》分為4個(gè)部分：——第1部分：全株玉米制作青貯飼料機(jī)械揉搓質(zhì)量評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范；——第2部分：青貯玉米中可吸收淀粉含量的測(cè)定；——第3部分：多功能飼草粉碎機(jī)作業(yè)質(zhì)量技術(shù)規(guī)范；——第4部分：青貯飼料霉菌毒素檢測(cè)技術(shù)規(guī)程。本部分為DB37/T3824—2019的第4部分。GB/T1.1—2009青貯飼料質(zhì)量檢測(cè)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范第4部分：青貯飼料霉菌毒素檢測(cè)技術(shù)規(guī)程范圍本標(biāo)準(zhǔn)適用于青貯飼料中的霉菌毒素的檢測(cè)。GB/T18980乳和乳粉中黃曲霉毒素M1的測(cè)定免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法GB/T28716飼料中玉米赤霉烯酮的測(cè)定免疫親和柱凈化-高壓液相色譜法GB/T28718飼料中T2毒素的測(cè)定免疫親和柱凈化-高壓液相色譜法下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA3.2高效液相色譜法HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC3.5×104kPa試劑本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑，凡未指明規(guī)格者，均為分析純，水為蒸餾水或同等純度的水。（TMB）4.1.8吐溫-204.1.930（30%H2O2）。T-2ELISAH9.6.59g（a2CO2.93gaHC1000mL0.05%吐溫-20pH7.4（PBS-T）（KH2PO4）0.2g（Na2HPO4?12H2O）2.9g（NaCl）8.0g（KCl）0.2g-200.5mL1000mLpH5.0——乙液：0.2mol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4），即稱取磷酸氫二鈉71.7g，加水至1000mL；——取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。4.2.450μLTMB（10mgTMB1mL——乙液：0.2mol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4），即稱取磷酸氫二鈉71.7g，加水至1000mL；——取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。4.2.450μLTMB（10mgTMB1mL＋10mL305霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇配成1mg/mL霉菌毒素貯備液，-20℃冰箱貯存。于檢測(cè)當(dāng)天，精確吸取貯備液，用20%甲醇的PBS（配制方法PBS-T，不加吐溫-20即可）稀釋成制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的所需濃度。6儀器所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自來(lái)水、蒸餾水沖洗。（4096。0.2mL10mL7測(cè)定步驟7.1提取2020g，置200mL8mL100mLh25mL90℃水浴上通風(fēng)揮50mL250mL20（4：1）1.5min15min0.5g0.40.1g7.13mL3mL9520PBSELISAELISA100μL，433min100μL，37℃30min。1mol/L50μL450nm9計(jì)算試樣霉菌毒素濃度按式（1）計(jì)算：（ng/g33min100μL，37℃30min。1mol/L50μL450nm9計(jì)算試樣霉菌毒素濃度按式（1）計(jì)算：（ng/gCV1D1V2m (1)式中：C（ng）V1，mL；V2Dm――樣品質(zhì)量，g。10精密度每個(gè)試樣稱取兩份進(jìn)行平行測(cè)定,以其算術(shù)平均值為分析結(jié)果。其分析結(jié)果的相對(duì)相差應(yīng)不大于20%。11高效液相色譜測(cè)定技術(shù)（HPLC）11.1試劑本標(biāo)準(zhǔn)所用試劑，凡未指明規(guī)格者，均為分析純，水為蒸餾水或同等純度的水。儀器（。C18150mm4.6mm5um365nm435nm11.3.3（25：75）流速：1.0mL/min20μL。取霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈稀釋成0.5ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。根據(jù)使用需要，準(zhǔn)確吸取10μL、20μL、50μL、100μL、200μL的霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置5mL的容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，配成相當(dāng)于1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。取霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈稀釋成0.5ug/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。根據(jù)使用需要，準(zhǔn)確吸取10μL、20μL、50μL、100μL、200μL的霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置5mL的容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，配成相當(dāng)于1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。稱取過(guò)20目篩粉碎的混勻試樣5g，置于50mL離心管中，加2mL水和30mL甲醇。將預(yù)提液用高速均質(zhì)器在9500r/min，高速勻質(zhì)5min，超聲提取30min。將勻質(zhì)提取液在6000r/min下離心15min，收集上清液并移入250mL分液漏斗中。30mL2min50mL100mLmLmL分50mL506000r/min5min，注入將免疫親和柱連接于50mL玻璃注射器，準(zhǔn)確移取50.0mL凈化測(cè)試溶液，注入玻璃注射器；將空氣壓力泵與注射器連接，調(diào)節(jié)壓力使測(cè)試溶液以約2mL/min～3mL/min流速緩慢通過(guò)免疫親和柱，直至2mL～3mL空氣通過(guò)柱體。沖洗更換10mL10mLmL/min洗脫mLmL/min～2mL/min2～42min30將收集的上清液用10%乙腈定容后上液相色譜儀測(cè)定。將收集的上清液用10%乙腈定容后上液相色譜儀測(cè)定。測(cè)定1ng/mL、ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL20uL精密量取供試品溶液20uL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中相當(dāng)于霉菌毒素的量。12計(jì)算試樣霉菌毒素濃度按式（2）計(jì)算：（ng/gCV1/r/