DB37-T 3824.4-2019 青貯飼料質量檢測與評價技術規(guī)范　第4部分：青貯飼料霉菌毒素檢測技術規(guī)程-（高清版）

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DB37山 東 省 地 方 標 準DB37/T3824.4—2019Technicalspecificationforsilagequalitytestingandevaluation—Part4:Technicalregulationofmycotoxindetectioninsilage2019Technicalspecificationforsilagequalitytestingandevaluation—Part4:Technicalregulationofmycotoxindetectioninsilage2019122420200124山東省市場監(jiān)督管理局發(fā)布前言DB37/T3824—2019《青貯飼料質量檢測與評價技術規(guī)范》分為4個部分：——第1部分：全株玉米制作青貯飼料機械揉搓質量評價技術規(guī)范；——第2部分：青貯玉米中可吸收淀粉含量的測定；——第3部分：多功能飼草粉碎機作業(yè)質量技術規(guī)范；——第4部分：青貯飼料霉菌毒素檢測技術規(guī)程。本部分為DB37/T3824—2019的第4部分。GB/T1.1—2009青貯飼料質量檢測與評價技術規(guī)范第4部分：青貯飼料霉菌毒素檢測技術規(guī)程范圍本標準適用于青貯飼料中的霉菌毒素的檢測。GB/T18980乳和乳粉中黃曲霉毒素M1的測定免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法GB/T28716飼料中玉米赤霉烯酮的測定免疫親和柱凈化-高壓液相色譜法GB/T28718飼料中T2毒素的測定免疫親和柱凈化-高壓液相色譜法下列術語和定義適用于本文件。3.1enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA3.2高效液相色譜法HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC3.5×104kPa試劑本標準所用試劑，凡未指明規(guī)格者，均為分析純，水為蒸餾水或同等純度的水。（TMB）4.1.8吐溫-204.1.930（30%H2O2）。T-2ELISAH9.6.59g（a2CO2.93gaHC1000mL0.05%吐溫-20pH7.4（PBS-T）（KH2PO4）0.2g（Na2HPO4?12H2O）2.9g（NaCl）8.0g（KCl）0.2g-200.5mL1000mLpH5.0——乙液：0.2mol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4），即稱取磷酸氫二鈉71.7g，加水至1000mL；——取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。4.2.450μLTMB（10mgTMB1mL——乙液：0.2mol/L磷酸氫二鈉（Na2HPO4），即稱取磷酸氫二鈉71.7g，加水至1000mL；——取甲液24.3mL，乙液25.7mL，加水至100mL，即可。4.2.450μLTMB（10mgTMB1mL＋10mL305霉菌毒素標準溶液用甲醇配成1mg/mL霉菌毒素貯備液，-20℃冰箱貯存。于檢測當天，精確吸取貯備液，用20%甲醇的PBS（配制方法PBS-T，不加吐溫-20即可）稀釋成制備標準曲線的所需濃度。6儀器所有玻璃器皿均用硫酸洗液浸泡，用自來水、蒸餾水沖洗。（4096。0.2mL10mL7測定步驟7.1提取2020g，置200mL8mL100mLh25mL90℃水浴上通風揮50mL250mL20（4：1）1.5min15min0.5g0.40.1g7.13mL3mL9520PBSELISAELISA100μL，433min100μL，37℃30min。1mol/L50μL450nm9計算試樣霉菌毒素濃度按式（1）計算：（ng/g33min100μL，37℃30min。1mol/L50μL450nm9計算試樣霉菌毒素濃度按式（1）計算：（ng/gCV1D1V2m (1)式中：C（ng）V1，mL；V2Dm――樣品質量，g。10精密度每個試樣稱取兩份進行平行測定,以其算術平均值為分析結果。其分析結果的相對相差應不大于20%。11高效液相色譜測定技術（HPLC）11.1試劑本標準所用試劑，凡未指明規(guī)格者，均為分析純，水為蒸餾水或同等純度的水。儀器（。C18150mm4.6mm5um365nm435nm11.3.3（25：75）流速：1.0mL/min20μL。取霉菌毒素標準品，用乙腈稀釋成0.5ug/mL的標準儲備液。根據(jù)使用需要，準確吸取10μL、20μL、50μL、100μL、200μL的霉菌毒素標準儲備液，置5mL的容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，配成相當于1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的標準工作液。取霉菌毒素標準品，用乙腈稀釋成0.5ug/mL的標準儲備液。根據(jù)使用需要，準確吸取10μL、20μL、50μL、100μL、200μL的霉菌毒素標準儲備液，置5mL的容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，配成相當于1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的標準工作液。稱取過20目篩粉碎的混勻試樣5g，置于50mL離心管中，加2mL水和30mL甲醇。將預提液用高速均質器在9500r/min，高速勻質5min，超聲提取30min。將勻質提取液在6000r/min下離心15min，收集上清液并移入250mL分液漏斗中。30mL2min50mL100mLmLmL分50mL506000r/min5min，注入將免疫親和柱連接于50mL玻璃注射器，準確移取50.0mL凈化測試溶液，注入玻璃注射器；將空氣壓力泵與注射器連接，調節(jié)壓力使測試溶液以約2mL/min～3mL/min流速緩慢通過免疫親和柱，直至2mL～3mL空氣通過柱體。沖洗更換10mL10mLmL/min洗脫mLmL/min～2mL/min2～42min30將收集的上清液用10%乙腈定容后上液相色譜儀測定。將收集的上清液用10%乙腈定容后上液相色譜儀測定。測定1ng/mL、ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL20uL精密量取供試品溶液20uL，注入液相色譜儀，測定峰面積，從標準曲線上讀出供試品中相當于霉菌毒素的量。12計算試樣霉菌毒素濃度按式（2）計算：（ng/gCV1/r/