免疫學(xué)檢驗(yàn)與臨床-劉斌課件

免疫學(xué)檢驗(yàn)與臨床應(yīng)用

劉斌

南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科

免疫學(xué)檢測(cè)是指：借助免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等理論或方法，對(duì)免疫分子（抗原、抗體、補(bǔ)體、細(xì)胞因子等）和免疫細(xì)胞進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。概述

臨床上、免疫學(xué)檢測(cè)可用于疾病的診斷、病情監(jiān)測(cè)和療效評(píng)價(jià)等。2抗原抗體反應(yīng):指抗原與相應(yīng)抗體之間所發(fā)生的特異性結(jié)合反應(yīng)。抗原抗體反應(yīng)一：慨念二：抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn)1.特異性2.可逆性3.階段性4.比例性3（一）、特異性（specificity）特異性示意圖

概念：一種抗原分子通常只能與其刺激機(jī)體后產(chǎn)生的抗體結(jié)合，這種抗原與抗體結(jié)合反應(yīng)的專一性稱為特異性。4決定因素：由抗原決定簇和抗體分子超變區(qū)之間空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性決定的應(yīng)用：由于抗原抗體反應(yīng)具有高度特異性，故可用已知的抗原（抗體）來(lái)檢測(cè)相應(yīng)未知的抗體（或抗原）。5（二）、比例性（proportionality）1、比例性是指抗原與抗體發(fā)生可見(jiàn)反應(yīng)遵循一定的量比關(guān)系。2、以絮狀沉淀實(shí)驗(yàn)為例，受抗原抗體比例性的影響非常明顯。3、根據(jù)所形成的沉淀物及抗原抗體比例關(guān)系繪制反應(yīng)曲線。78抗原-抗體反應(yīng)的基本檢測(cè)方法1.凝集反應(yīng)2.沉淀反應(yīng)3.免疫標(biāo)記技術(shù)9我科現(xiàn)在用凝集反應(yīng)檢驗(yàn)的項(xiàng)目主要有FDP和RPR。主要特點(diǎn)是靈敏度比較低，需要人肉眼觀察結(jié)果，對(duì)檢驗(yàn)人員熟練程度有一定要求。10沉淀反應(yīng)當(dāng)可溶性抗原與相應(yīng)抗體特異結(jié)合，二者比例合適時(shí)，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液體出現(xiàn)濁度。利用現(xiàn)代光學(xué)測(cè)量?jī)x器對(duì)濁度進(jìn)行測(cè)定從而檢測(cè)抗原含量。檢測(cè)項(xiàng)目：IgG、A、M，C3、C4、ASO、

RF、PA、CRP、尿csf、NAG等。

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優(yōu)點(diǎn):

靈敏度高（高于單擴(kuò)法5-10倍），穩(wěn)定性好（CV﹤10%），操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確

不足:

①抗體用量較大；②溶液中的抗原-抗體復(fù)合物分子應(yīng)足夠大，分子太小阻擋不了光線的通過(guò)；數(shù)量要足夠多，否則溶液濁度變化太小，對(duì)光通量影響不大；對(duì)光度計(jì)的靈敏度要求高，這樣微小的濁度變化能引起透光率改變，因此通常要加增敏劑。靈敏度較散射比濁法低。

③增敏劑自凝出現(xiàn)非特異性凝集。透射比濁法方法評(píng)價(jià)(我們科室現(xiàn)在都是這種方法）13

粒子對(duì)光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后，微粒子對(duì)光線產(chǎn)生反射和折射而形成散射光。懸浮微粒對(duì)光散射形成的散射光強(qiáng)度與微粒的大小、數(shù)量、入射光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度、測(cè)量角度等因素密切相關(guān)，其公式如下：Iθ＝I0［4π2（dn/dc)2Mc(1+cosθ)］Nγ2λ4免疫散射比濁法(我們科馬上要引進(jìn)的特種蛋白儀所用技術(shù)）1415免疫標(biāo)記技術(shù)1.酶免疫技術(shù)2.化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)3.免疫熒光技術(shù)4.免疫印跡技術(shù)5.放射免疫技術(shù)16(1)酶免疫測(cè)定

(enzymeimmunoassay,EIA)酶免疫測(cè)定（EnzymeImmunoAssay,EIA）是指用酶（如HRP,AP）標(biāo)記抗原或抗體然后進(jìn)行反應(yīng)，將抗原－抗體反應(yīng)的特異性和酶促反應(yīng)的高效性相結(jié)合。17我們科常用酶免技術(shù)檢測(cè)的項(xiàng)目有：甲，乙，丙，丁，戊肝和HIV。1819HAV感染標(biāo)志物出現(xiàn)時(shí)間20HAV感染檢測(cè)標(biāo)志物HAV-IgM：一周內(nèi)陽(yáng)性占45%1～2周內(nèi)出現(xiàn)陽(yáng)性35%2～4周內(nèi)出現(xiàn)陽(yáng)性10%可用于甲型肝炎的明確診斷HAV-IgA分泌型抗體HAV-IgG出現(xiàn)較晚，幾乎終身存在，陽(yáng)性說(shuō)明曾有過(guò)感染，保護(hù)性抗體

HAV-Ag

急性感染發(fā)病前1～15天，糞中陽(yáng)性率為70%～85%，發(fā)病一周可降為一半左右，發(fā)病半個(gè)月后很難檢測(cè)到是特異性診斷指標(biāo)

HAV-RNA病毒存在的指標(biāo)2122乙肝“三對(duì)”乙肝表面抗原(HBsAg)：最早出現(xiàn)在血液中的病毒抗原乙肝表面抗體（抗HBs）：中和或保護(hù)抗體乙肝e抗原（HBeAg）：第二個(gè)出現(xiàn)在血液中的病毒抗原乙肝e抗體（抗HBe）乙肝核心抗體（抗HBc）：最早出現(xiàn)在血液中的抗體（IgM）乙肝核心抗體（抗HBc）：IgG23HBsAgHBsAg是S基因編碼的一個(gè)蛋白，容易發(fā)生變異。HBsAg有一個(gè)特異的共同抗原決定簇“a”和至少兩個(gè)亞型決定簇“dy”和“wr”血清型為adw、adr和ayw我國(guó)絕大多數(shù)地區(qū)以adr為主,adw次之，新疆、西藏、內(nèi)蒙古自治區(qū)的本地民族幾乎全為ayw。24HBsAg：ELISA方法檢測(cè)下限可達(dá)0·15ng/ml假陰性的可能因素：1、HBsAg含量低于所用方法的測(cè)定下限之下2、編碼HBsAg的HBVS基因的突變3、丙肝與丁肝重疊感染對(duì)HBsAg復(fù)制和表達(dá)的抑制作用4、試劑所用抗體對(duì)HBV不同基因型檢測(cè)敏感性的不同

25HBsAg的變異可致不常見(jiàn)的血清學(xué)標(biāo)志物模式

(1)單獨(dú)HBcAb陽(yáng)性(2)HBsAg陰性但HBeAg陽(yáng)性(3)HBsAg陰性但HBcAb和HBsAb陽(yáng)性(4)HBsAg(HBeAg)和HBsAb(大多為<100IU/ml的低滴度)同時(shí)存在(5)使用不同廠家的試劑盒得到的結(jié)果不一致2627HCV感染后血液中指標(biāo)的出現(xiàn)28抗-HCV檢測(cè)和結(jié)果報(bào)告程序29丁型肝炎病毒（HepatitisDVirus)HDV是一種缺陷病毒必需依賴HBV等嗜肝DNA病毒為其提供外殼，才能進(jìn)行復(fù)制。傳播方式：血源傳播感染方式：共同感染——預(yù)后良好重疊感染——1、自限性丁型肝炎

2、慢性進(jìn)行性丁型肝炎

3、HDV與重型肝炎

30急性期HIVRNAAnti-Ag潛伏期Anti-Ab艾滋病期Anti-gp41/120(anti-gp36)Anti-P24感染1周2周3周4周….1年2年3年…………….10年………..濃度窗口期31代次 抗原 方法 檢測(cè)時(shí)間

1 全病毒 間接 >2個(gè)月

2 重組或多肽 間接 3-4周

3 重組+多肽 夾心 2-3周

4 抗原+抗體 夾心 2周左右

HIV抗體試劑盒進(jìn)展32化學(xué)發(fā)光免疫分析

化學(xué)發(fā)光物標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光免疫分析是一種用化學(xué)發(fā)光物直接標(biāo)記抗體或抗原，測(cè)定反應(yīng)后抗原抗體復(fù)合物上的發(fā)光強(qiáng)度來(lái)了解抗原或抗原濃度的一類免疫分析法（故稱直接化學(xué)發(fā)光法）。該方法結(jié)合了化學(xué)發(fā)光技術(shù)和磁性微粒子分離技術(shù)，以細(xì)小的順磁性微粒為固相載體。其測(cè)定原理與雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法等相同。33發(fā)光YYY磁微粒被測(cè)抗原+抗體+帶丫啶酯標(biāo)記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后雙抗體夾心法直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理（1）加入酸性H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）34

內(nèi)分泌激素類、腫瘤標(biāo)志物類、肌鈣蛋白、梅毒lgG、治療性藥物濃度、生長(zhǎng)激素、骨代謝指標(biāo)和貧血類等方面的檢測(cè)。我們科用用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)的項(xiàng)目35

甲功檢測(cè)TT3

TT4

rT3

結(jié)合態(tài)(BT3)99.7%

結(jié)合態(tài)(BT4)99.97%

游離態(tài)(FT3)0.3%游離態(tài)(FT4)0.03%

與TBG（主要）TBPA、ALb結(jié)合發(fā)揮生物效應(yīng)的部分，能真正反映甲功情況一種無(wú)活性的甲狀腺激素，95%由T4轉(zhuǎn)化而來(lái)，僅5%由甲狀腺分泌，對(duì)調(diào)節(jié)T3、T4的最佳濃度水平發(fā)揮作用36

甲功檢測(cè)37模式分析：

1常規(guī)檢測(cè)與判定順序：

TSH>FT3>FT4>T3>T4（甲亢）

TSH=FT4>T4>FT3>T3（甲減）

2T3可作為判斷療效的可靠指標(biāo)，只有T3降至正常，才能表明甲亢患者痊愈。甲減時(shí)，T4的降低先于T3的降低，比T3可靠。

3甲狀腺素（T4）全部由甲狀腺分泌，而三碘甲腺原氨酸（T3）僅有20%直接來(lái)自甲狀腺，其余約80%在外周組織中由T4經(jīng)脫碘代謝轉(zhuǎn)化而來(lái)。T3是甲狀腺激素在組織實(shí)現(xiàn)生物作用的活性形式。

38梅毒血清學(xué)檢驗(yàn)1.非梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn):梅毒螺旋體破壞宿主細(xì)胞釋放以及其螺旋體細(xì)胞表面釋放的類脂物質(zhì)，刺激機(jī)體產(chǎn)生抗類脂抗體（反應(yīng)素）。在體外該抗體與心磷脂、卵磷脂和膽固醇組成的抗原反應(yīng)，形成凝集反應(yīng)。

方法：VDRL、USR、RPR、TRUST2.梅毒螺旋體抗原血清學(xué)試驗(yàn)：基于TP特異性抗原，檢測(cè)TP抗體

方法：FTA-ABS、TPHA、TPPA、ELISA、TP-RT、IgG39梅毒血清試驗(yàn)假陽(yáng)性因素：技術(shù)性：標(biāo)本的污染溶血操作失誤生物學(xué)假陽(yáng)性：某些疾?。航Y(jié)核、瘧疾、肝病、紅斑狼瘡、流感、肺炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕性心臟病、風(fēng)疹、系統(tǒng)性硬化癥等，疾病發(fā)展過(guò)程中釋放心磷脂到血液中假陽(yáng)性。生理機(jī)能發(fā)生變化：少數(shù)孕婦也可發(fā)生生物學(xué)假陽(yáng)性。40RPR梅毒lgG臨床意義

——初期梅毒早期或排出

++現(xiàn)癥梅毒

+—生物學(xué)假陽(yáng)性

—+梅毒經(jīng)治療后梅毒血清學(xué)實(shí)驗(yàn)方法學(xué)評(píng)價(jià)41自身免疫性疾病和自身抗體的檢測(cè)42/85常見(jiàn)的自身免疫性疾病系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）干燥綜合征（SS）多發(fā)性肌炎（PM）/皮肌炎（DM）硬皮病（Scleroderma,Scl）多發(fā)性硬化癥（MS）自身免疫性肝炎內(nèi)分泌系統(tǒng)自身免疫?。簶蚣籽?、Graves病、T1DM、Addison病等432022/11/843/85自身抗體一般特點(diǎn)和臨床價(jià)值自身抗體是自身免疫性疾病重要標(biāo)志各種自身免疫性疾病伴有特征性自身抗體譜高效價(jià)自身抗體是自身免疫性疾病的特點(diǎn)之一，也是臨床確診自身免疫性疾病重要依據(jù)測(cè)定自身抗體有助于疾病診斷、活動(dòng)程度、療效觀察、指導(dǎo)用藥自身抗體已經(jīng)納入某些自身免疫性疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)中：SLE：抗dsDNA、Sm抗體；ACL抗體與磷脂增綜合征；抗CCP抗體與RA。442022/11/8/85常見(jiàn)自身免疫性疾病的標(biāo)志抗體452022/11/8/85自身抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室方法首選IIF（間接免疫熒光法）：系統(tǒng)性自身免疫性疾病常選HEp-2細(xì)胞作為檢測(cè)基質(zhì)器官特異性自身免疫性疾病以特異性組織切片為基質(zhì)對(duì)自身免疫性疾病進(jìn)行抗原特異性區(qū)分，可選擇免疫印跡46自免肝抗體譜2022/11/8/85抗核抗體（AntinuclearAntibody，ANA）一組將自身細(xì)胞核成分作為靶抗原的自身抗體的總稱，主要是IgG型，無(wú)器官和種屬特異性，能與所有動(dòng)物的細(xì)胞核發(fā)生反應(yīng)，主要存在于血清中，也可存在于胸水、關(guān)節(jié)滑膜液和尿液中，是重要的篩查試驗(yàn)。間接免疫熒光法（IIF）：總ANA篩查試驗(yàn)，以人喉癌上皮細(xì)胞（HEp-2細(xì)胞系）作為基質(zhì)細(xì)胞，或聯(lián)合靈長(zhǎng)類肝細(xì)胞基質(zhì)檢測(cè)。常見(jiàn)ANA熒光圖形及臨床意義：均質(zhì)型、顆粒型、核膜型、核仁型472022/11/8/85均質(zhì)型細(xì)胞核均勻著染熒光抗ds-DNA抗體ssDNA抗體抗核小體抗體抗組蛋白抗體高滴度見(jiàn)于SLE低滴度見(jiàn)于RA、慢性肝病、傳單或藥物誘發(fā)的狼瘡患者482022/11/8/85顆粒型即斑點(diǎn)型，細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)顆粒狀熒光抗核糖體核蛋白抗體，如抗U-nRNP、LAP2、LBR、MAN1抗體高滴度見(jiàn)于MCTD，SLE,SS,硬化癥。492022/11/849/85核膜型即周邊型主要有：抗板層素核孔復(fù)合體內(nèi)膜抗體目前認(rèn)為高滴度主要見(jiàn)于原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)患者。502022/11/8/85核點(diǎn)型（DOTS）抗著絲點(diǎn)型51見(jiàn)于