毒理學(xué)實驗三小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗

實驗三、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗

微核的產(chǎn)生與染色體損傷有關(guān)，是染色體或染色單體的無著絲點斷片或紡錘絲受損傷而丟失的整個染色體，在細(xì)胞分裂后期遺留在細(xì)胞質(zhì)中，末期之后，單獨形成一個或幾個規(guī)則的次核，包含在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，因比主核小，故稱微核。

微核(Micronucleus)的概念微核試驗(Micronucleustest，MNT)的概念

微核試驗是觀察受試物能否產(chǎn)生微核的試驗。主要可檢出DNA斷裂劑和非整倍體誘變劑(染色體損傷)。

傳統(tǒng)的微核試驗是體內(nèi)試驗,常用細(xì)胞小鼠骨髓多染紅細(xì)胞(PCE)

微核可以出現(xiàn)在多種細(xì)胞中，但在有核細(xì)胞中較難與正常核的分葉及核突出物相區(qū)別。由于紅細(xì)胞在成熟之前最后一次分離后數(shù)小時可將主核排出，而仍保留微核于PCE細(xì)胞中，因此通常計數(shù)PCE細(xì)胞中的微核。

實驗步驟1．實驗動物及處理2．骨髓液的制備和涂片3．固定4．染色5．觀察計數(shù)

6.結(jié)果分析與評價

1．試驗動物及處理

（1）動物選擇：小鼠，分為五組，每組8只（2）染毒途徑：腹腔注射（3）受試物：環(huán)磷酰胺（4）劑量設(shè)計：12.5、25、50、75、100mg/kg染毒次數(shù)及取樣時間：一般采用兩次染毒或多次染毒。

兩次染毒：第一次染毒后24小時進(jìn)行第二次染毒，

6小時后取樣；

多次染毒：每天染毒1次，連續(xù)染毒5天，末次染毒后24小時取樣。2．骨髓液的制備和涂片

處死：頸椎脫臼法處理：取股骨，去掉血污和肌肉，用彎止血鉗將骨髓擠于預(yù)先滴有生理鹽水的清潔載玻片上，混合均勻后推片

3．固定：

將推好晾干的骨髓片放進(jìn)染色缸中，甲醇固定15分鐘，取出晾干。4．染色(建成試劑盒Giemsa染液)

用染液一3滴，染色8min，再加染液二6滴，洗耳球混勻5min。細(xì)流水沖掉玻片染色液，晾干。5．觀察計數(shù)

先用低倍鏡觀察，選擇分布均勻的區(qū)域，再在油鏡下觀察計數(shù)。

PCE細(xì)胞呈灰藍(lán)色，正染紅細(xì)胞（NCE）桔黃色。細(xì)胞中的微核大半呈圓形，邊緣光滑，嗜色性與核質(zhì)一致，一個細(xì)胞內(nèi)可以出現(xiàn)一個或多個微核。計數(shù)1000個PCE中含微核的PCE數(shù)，并計算200個細(xì)胞中PCE/NCE的比值。6.結(jié)果分析與評價本試驗中只計數(shù)PCE中微核，微核率以千分率表示。PCE／NCE為評價細(xì)胞毒性的指標(biāo)。正常的PCE/NCE比值為1（0.6-1.2），如果＜0.1，則表示PCE形成受到嚴(yán)重抑制；如果＜0.05，則表示受試物劑量過大，結(jié)果不可靠。

注意事項：

1.注意不要把股骨剪斷

2.擠出骨髓處的肌肉要剔除干凈

3.滴到玻片上的生理鹽水不要太多，涂時要涂勻，以便推片

4.染色前可以先看一下整體涂片情況，細(xì)胞分散度是否良好