微生物發(fā)酵工藝

微生物發(fā)酵工藝微生物發(fā)酵工藝微生物發(fā)酵工藝V:1.0精細(xì)整理，僅供參考微生物發(fā)酵工藝日期：20xx年X月第六章微生物發(fā)酵制藥工藝

6.1微生物發(fā)酵與制藥

6.2微生物生長與生產(chǎn)的關(guān)系

6.3微生物生產(chǎn)菌種建立6.4發(fā)酵培養(yǎng)基制備

6.4發(fā)酵培養(yǎng)基制備

?概念（medium）供微生物生長繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要

的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。

?培養(yǎng)基的組成和比例是否恰當(dāng)，直接影響微生物的生長、生產(chǎn)和工藝選擇、產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。

6.4.1培養(yǎng)基的成分

碳源

氮源無機(jī)鹽水生長因子

前體與促進(jìn)劑

消泡劑

1、碳源(carbonsources)

概念：

構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳素的營養(yǎng)物質(zhì)。作用：為正常生理活動(dòng)和過程提供能量來源，為細(xì)胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的合成提供碳骨架。

碳源種類

糖類：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜

脂肪：豆油、棉籽油和豬油醇類：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白類：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖類、有機(jī)酸

遲效碳源：酪蛋白水解產(chǎn)生的脂肪酸

2、氮源（nitrogensources）

概念：構(gòu)成微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中氮素的營養(yǎng)物質(zhì)。

作用：為生長和代謝主要提供氮素來源。種類：無機(jī)氮源、有機(jī)氮源

有機(jī)氮源

幾乎所有微生物都能利用有機(jī)氮源

黃豆餅粉、花生餅粉

棉籽餅粉、玉米漿、蛋白\胨、酵母粉、尿素

無機(jī)氮源

氨水、銨鹽和硝酸鹽等。氨鹽比硝酸鹽更快被利用。

工業(yè)應(yīng)用：主要氮源或輔助氮源；調(diào)節(jié)pH值生理酸性物質(zhì)：代謝后能產(chǎn)生酸性殘留物質(zhì)。

（NH4）2SO4利用后，產(chǎn)生硫酸

生理堿性物質(zhì)：代謝后能產(chǎn)生堿性殘留物質(zhì)。硝酸鈉利用后，產(chǎn)生氫氧化鈉。

3、無機(jī)鹽和微量元素

?概念：組成生理活性物質(zhì)或具有生理調(diào)節(jié)作用礦物質(zhì)

?作用方式：低濃度起促進(jìn)作用，高濃度起抑制作用。?種類：鹽離子

磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣，常常添加

鐵、鋅、銅、鉬、鈷、錳、氯，一般不加。

4、水

菌體細(xì)胞的主要成分。

營養(yǎng)傳遞的介質(zhì)。良好導(dǎo)體，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長環(huán)境溫度。培養(yǎng)基的主要成分之一。

5、生長因子（growthfactor）

概念：

維持微生物生長所必需的微量有機(jī)物，不起碳源和

氮源作用。

種類：

維生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分中含有：一般無需添加。營養(yǎng)缺陷型菌株：必需添加。

6、前體(precursor)

?概念：

加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化合物，被直接結(jié)合到目標(biāo)產(chǎn)物分子中，而自身的結(jié)構(gòu)無多大的變化。?使用：添加前體是提高抗生素產(chǎn)量的重要措施。

多次少量流加的工藝。

6、促進(jìn)劑(accelerant)

?概念：

促進(jìn)產(chǎn)物生成的物質(zhì)，但不是營養(yǎng)物，也不是前體的一類化合物。

?種類：

氯化物有利于灰黃霉素、金霉素合成。

表面活性劑吐溫、清洗劑，脂溶性小分子化合物等，

起誘導(dǎo)作用。

7、消沫劑（defoamingagent）

?概念：降低泡沫的液膜強(qiáng)度和表面黏度，使泡沫破裂的化合物。?種類：表面活性劑，低表面張力。天然動(dòng)植物油脂類、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯類、聚醚類、硅酮類）。?作用：消除泡沫，防止逃液和染菌。

6.4.2培養(yǎng)基種類及其質(zhì)量控制技術(shù)

培養(yǎng)基的種類

按用途：選擇性、鑒別性、富營養(yǎng)培養(yǎng)基等按物理性質(zhì)：固體，半固體、液體培養(yǎng)基

按化學(xué)組成：合成、半合成、天然培養(yǎng)基

按發(fā)酵過程中所處位置和作用：斜面或平板固體、

種子、發(fā)酵和補(bǔ)料培養(yǎng)基。

1、固體培養(yǎng)基

?概念：（solidmedium）

細(xì)菌和酵母的固體斜面或平板培養(yǎng)基，鏈霉菌和絲狀真菌的孢子培養(yǎng)基。

?制備：

液體培養(yǎng)基添加1.0-2.0%瓊脂粉。

?作用：

提供菌體的生長繁殖，形成孢子。

1、固體培養(yǎng)基－要求與質(zhì)量控制

?單細(xì)胞培養(yǎng)基：

營養(yǎng)豐富，滿足菌體生長迅速，不能引起變異。?孢子培養(yǎng)基：基質(zhì)濃度較低，無

機(jī)鹽濃度適量，以利于孢子形成。

營養(yǎng)不宜太豐富，否則不易產(chǎn)生孢

子。

2、種子培養(yǎng)基

?概念：（seedmedium）供孢子發(fā)芽和菌體生長繁殖，搖瓶和

作用：

種子罐培養(yǎng)基,為液

體。

使種子擴(kuò)大培養(yǎng)，增加細(xì)胞數(shù)目，生長形成強(qiáng)壯、健康和高活性的種子。

2、種子培養(yǎng)基－要求與質(zhì)量控制

用速效性、容易被利用的碳、

培養(yǎng)基成分必需完全，營養(yǎng)豐富。氮源和無機(jī)鹽等物質(zhì)，但濃度

不宜高。

種子培養(yǎng)基要與發(fā)酵培養(yǎng)基相適應(yīng)，主要成分接近，不能差異太大。

縮短發(fā)酵的延滯期。

3、發(fā)酵培養(yǎng)基

?概念：

(fermentationmedium)提供微生物生長、目標(biāo)

產(chǎn)物生成的

生產(chǎn)用培養(yǎng)基。

作用：不僅要滿足菌體的生長和繁殖，還要滿足菌體合成目標(biāo)產(chǎn)物，是發(fā)酵生產(chǎn)中最關(guān)鍵和最重要的培養(yǎng)基。

要求?營養(yǎng)物質(zhì)濃度和粘度適中

?組成上豐富完整

?不同菌種和不同產(chǎn)物，對培養(yǎng)基

的要求差異很大，

組成和配方需要優(yōu)化

4、補(bǔ)料培養(yǎng)基(fedmedium）

?概念：發(fā)酵過程中添加補(bǔ)充的培養(yǎng)基。?作用：穩(wěn)定工藝條件，延長發(fā)酵周期，提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量?組成：各種必要的營養(yǎng)物質(zhì)，碳源、氮源、前體

?制備：按單一成分配制，各自獨(dú)立控制，或按一

定比例制成復(fù)合補(bǔ)料培養(yǎng)基。

5、控制發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量

（1）控制水質(zhì)：

恒定水源和恒定的水質(zhì)。地下深層井水，對水質(zhì)定期化驗(yàn)檢查，使用符合要求的水質(zhì)配制各種培養(yǎng)基

措施：檢測與控制水質(zhì)參數(shù)

pH、溶解氧、可溶性固體、污染程度、各種礦物，特別是重金屬的種類和含量。

（2）控制培養(yǎng)基原料的質(zhì)量：

來源與種類的選擇農(nóng)產(chǎn)副品：因品種、產(chǎn)地、加工、貯存條件不同而質(zhì)量差異較大。

化學(xué)原料：雜質(zhì)含量也不相同。

措施：保持穩(wěn)定的原料來源。更換原料時(shí)，必需再進(jìn)行一系列試驗(yàn)，確保產(chǎn)量和質(zhì)量的控制和穩(wěn)定性。

原料的選擇試驗(yàn)：

不同碳源、氮源對菌種生長的能力和產(chǎn)物的生產(chǎn)能力很不相同。對原料進(jìn)行試驗(yàn)，選擇滿足發(fā)酵要求的來源。

注意：

????????????碳氮濃度與配比：適宜

??????速效和緩效成分相互配合，發(fā)揮綜合優(yōu)勢

pH：配制時(shí)加入酸堿性物質(zhì)搭配，甚至使用緩劑。

（3）控制培養(yǎng)基的黏度：

對發(fā)酵的影響：?高黏度的培養(yǎng)基，不易徹底滅菌?影響發(fā)酵的通氣攪拌等物理過程?直接影響菌體對營養(yǎng)的利用?目標(biāo)產(chǎn)物的分離提取造成困難

措施：固體不溶性成分，淀粉、黃豆粉等增加培養(yǎng)基的黏度，酶水解，降低大分子物質(zhì)

（4）控制滅菌操作：

高壓蒸氣滅菌影響培養(yǎng)基的有效成分甚至是活性。較高溫度下長時(shí)間滅菌，營養(yǎng)成分會(huì)破壞，甚至產(chǎn)生有毒物質(zhì)。磷酸鹽與碳酸鈣、鎂鹽、銨鹽也能反應(yīng)，生成沉淀或絡(luò)合物，降低利用度。維生素等不耐高溫分解破壞、失活。

6.4.3制藥生產(chǎn)用培養(yǎng)基的配制

一般設(shè)計(jì)原則

設(shè)計(jì)思路計(jì)算與定量配制優(yōu)化

1、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)一般原則

?生物學(xué)原則：根據(jù)不同微生物營養(yǎng)和反應(yīng)需求設(shè)計(jì)。營養(yǎng)物質(zhì)組成：較豐富，濃度適當(dāng)。成分之間比例：恰當(dāng)，C/N比適宜，有機(jī)和無機(jī)氮原料之間：不能產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。適宜的pH和滲透壓?工藝原則：不影響通氣攪拌、分離精制和廢物處理，過程容易控制。?低成本原則：原料來源方便，質(zhì)量穩(wěn)定，質(zhì)優(yōu)價(jià)廉。?高效經(jīng)濟(jì)原則：滿足菌體生長和合成產(chǎn)物的需求，最高得率，最小副產(chǎn)物。

2、培養(yǎng)基設(shè)計(jì)基本思路

?起始培養(yǎng)基：根據(jù)他人的經(jīng)驗(yàn)和使用。?單因素實(shí)驗(yàn)：確定最適宜的培養(yǎng)基成分。?多因素實(shí)驗(yàn)：各成分之間最佳配比和濃度優(yōu)化。?中試放大試驗(yàn)：搖瓶、小型發(fā)酵罐，到中試，最后放大到生產(chǎn)罐。?綜合考慮各種因素，產(chǎn)量、純度、成本等后，確定一個(gè)適宜的生產(chǎn)配方。

3、理論計(jì)算與定量配制

?微生物生長和生產(chǎn)可用下列表達(dá)式表示：

碳源和能源＋氮源＋其他營養(yǎng)物質(zhì)→細(xì)胞＋產(chǎn)

物＋CO2＋H2O＋熱量

?單位細(xì)胞生物量所需最小的營養(yǎng)物質(zhì):?單位產(chǎn)量的最小底物濃度:

碳源和氮源進(jìn)行轉(zhuǎn)化率計(jì)算和分析

?初步計(jì)算：參考微生物的化學(xué)和元素組成。

?轉(zhuǎn)化率：單位質(zhì)量原料生產(chǎn)的產(chǎn)物量或細(xì)胞量。

?理論轉(zhuǎn)化率：根據(jù)代謝途徑的物料衡算

?實(shí)際轉(zhuǎn)化率：發(fā)酵過程中實(shí)際測量數(shù)值計(jì)算。?目標(biāo)：使實(shí)際轉(zhuǎn)化率靠近理論轉(zhuǎn)化率。

無法從生化反應(yīng)原理來推斷和計(jì)算出最佳培養(yǎng)基配方根據(jù)生理學(xué)和生物化學(xué)理論參照前人所用的經(jīng)驗(yàn)培養(yǎng)基

結(jié)合菌的特殊生物學(xué)和產(chǎn)品特征要求

進(jìn)行大量細(xì)致和周密的試驗(yàn)研究

小結(jié)

培養(yǎng)基組成與作用：C、N、無機(jī)鹽、水、生長因

子、前體與促進(jìn)劑、消泡劑

培養(yǎng)基制備與質(zhì)量控制：固體、種子、發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)用培養(yǎng)基制備：原則、思路、優(yōu)化

思考題

（1）培養(yǎng)基組成成分有哪些，有何作用（2）固體培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基的組成特點(diǎn)及其如何銜接（3）如何研制生產(chǎn)用培養(yǎng)基第六章微生物發(fā)酵制藥工藝

6.1微生物發(fā)酵與制藥

6.2微生物生長與生產(chǎn)的關(guān)系

6.3制藥微生物生產(chǎn)菌種建立

6.4培養(yǎng)基制備

6.5滅菌工藝

6.5滅菌工藝

滅菌方法與原理

培養(yǎng)基滅菌工藝

空氣除菌工藝

幾個(gè)概念

雜菌：除生產(chǎn)菌以外的任何微生物。污染：感染雜菌的培養(yǎng)或發(fā)酵體系。

?消毒：殺滅或清除病原微生物，達(dá)到無害化程

度，殺滅率99.9%以上。

?殺菌：殺滅或清除一切微生物，達(dá)到無活微生

物存在的過程，殺滅率99.9999%以上。?滅菌：微生物殺滅率99.999999%以上。

6.5.1滅菌方法與原理

1、化學(xué)滅菌2、物理滅菌

1、化學(xué)滅菌

用化學(xué)物質(zhì)殺滅微生物的滅菌操作。

?化學(xué)滅菌劑：

氧化劑類等，鹵化物類，有機(jī)化合物等。

細(xì)胞死亡。?應(yīng)用：皮膚表面、器具、實(shí)驗(yàn)室和工廠的無菌區(qū)域的臺面、地面、墻壁及空間的滅菌。

?機(jī)理：蛋白質(zhì)變性，酶失活，破壞細(xì)胞膜透性，

2、物理滅菌

各種物理?xiàng)l件如高溫、輻射、超聲波及過濾等進(jìn)行滅菌?紫外線等射線：局部空間?干熱滅菌：實(shí)驗(yàn)室器皿

?蒸汽滅菌：培養(yǎng)基

效果好，操作方便，廣泛使用。

6.5.2培養(yǎng)基滅菌

1、微生物高溫死亡動(dòng)力學(xué)與滅菌的關(guān)系微生物受熱死亡過程的一級動(dòng)力學(xué)反應(yīng)：

－dX/dt=kdX

微生物濃度與滅菌時(shí)間成正比，濃度越高，滅

菌時(shí)間越長。

滅菌時(shí)間與比死亡速率之間的關(guān)系

kd與微生物種類、生理狀態(tài)、滅菌溫度有關(guān)以殺死芽孢的溫度和時(shí)間為指標(biāo)。確保徹底滅菌，實(shí)際操作中增加50％的保險(xiǎn)系數(shù)。

2、培養(yǎng)基滅菌的操作方式

(1)分批滅菌操作，間歇滅菌,實(shí)罐滅菌：配制好培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐內(nèi)，直接蒸汽加熱，達(dá)到

滅菌要求的溫度和壓力后維持一段時(shí)間，再冷卻至

發(fā)酵要求的溫度。?特點(diǎn)：不需其他的附屬設(shè)備，操作簡便，手動(dòng)。?缺點(diǎn)：加熱和冷卻時(shí)間較長。營養(yǎng)成分損失較多，罐利用率低。適合小批量生產(chǎn)規(guī)模。

分批操作的滅菌過程

?加熱升溫：?維持滅菌溫度：15－30min，121℃；0.09－0.10MPa?冷卻降溫：每段對滅菌的貢獻(xiàn)于取決時(shí)間長短。

分批滅菌的操作過程

通入蒸汽：空氣管、夾套通入蒸汽。

加熱升溫：70℃，取樣管、放料管通入蒸汽。

維持保溫：120℃，罐壓0.1MPa，排氣。調(diào)節(jié)進(jìn)

汽和排氣量，維持30min。冷卻降溫：依次關(guān)閉排氣、進(jìn)汽閥。罐壓低于空氣壓力后，通入無菌空氣，夾套通入冷卻水降溫。

（2）連續(xù)滅菌操作

高溫短時(shí)滅菌操作，連消：

培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外經(jīng)過一套滅菌設(shè)備連續(xù)的加熱

滅菌，冷卻后送入已滅菌的發(fā)酵罐內(nèi)的工藝過程。

加熱升溫、維持滅菌溫度和冷卻降溫三個(gè)階段由不同的設(shè)備執(zhí)行：加熱器，保溫設(shè)備，冷卻器。

（2）連續(xù)滅菌操作－流程圖培養(yǎng)基與高壓蒸汽直接混勻，達(dá)到滅菌溫度（130－140℃）

（2）連續(xù)滅菌－操作過程

配料：配料罐，配制培養(yǎng)基。預(yù)熱罐：定容和預(yù)加熱。70－90℃。加熱器：培養(yǎng)基與蒸汽混合，快速升到130－140℃。維持罐：維持滅菌時(shí)間,5－7分鐘。冷卻管：培養(yǎng)基經(jīng)過冷卻水管冷卻。40－50℃。輸入滅菌的發(fā)酵罐中。

連續(xù)滅菌的特點(diǎn)

1）高溫快速滅菌工藝，營養(yǎng)成分破壞的少；

2）熱能利用合理，易于自動(dòng)化控制；

3）不適合粘度大或固形物含量高的培養(yǎng)基滅菌；

4）增加了連續(xù)滅菌設(shè)備及操作環(huán)節(jié)，增加染菌幾率。5）對壓力要求高，一般為0.45-0.8MPa。

6.5.3空氣除菌操作工藝

1、發(fā)酵對空氣的要求

好氧微生物需要氧氣供應(yīng)，通入空氣。連續(xù)一定流量的壓縮無菌空氣。空氣流量：一般0.1-2.0。壓強(qiáng)：0.2-0.4MPa。

空氣質(zhì)量：相對濕度小于70％；比培養(yǎng)溫度高

10－30℃；潔凈度100級，或失敗率10－3。

2、工業(yè)制備大量空氣的方法

加熱滅菌：利用空氣壓縮時(shí)所產(chǎn)生的熱量除

菌，無菌化程度不高的發(fā)酵過程。靜電除菌：通過高壓電流場，帶電粒子被吸附。介質(zhì)過濾：捕集粒子及各種微生物。發(fā)酵工業(yè)采用。

3、空氣除菌原理

空氣中附著在塵埃上的微生物大小為0.5-5um。離心場作用：顆粒及其微生物沉降

直接被截留：顆粒慣性碰撞，相互集聚成大顆

粒。氣流速度越大，慣性越大，截留效果越好。靜電引力：有一定作用。

4、空氣過濾介質(zhì)

膜過濾介質(zhì)：孔徑小于被截留微生物體積

硝酸纖維酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龍膜，四氟乙烯、

纖維素樹脂微孔濾膜。0.1-0.5um

深層過濾介質(zhì)：空隙大于被截留微生物體積。纖維狀或顆粒狀：棉花(50um)、玻璃纖維、活性炭

過濾紙：超細(xì)玻璃纖維紙(1-1.5um)

金屬燒結(jié)管：單根或幾十根甚至上百根金屬微孔濾

管安裝在過濾器內(nèi)。

5、空氣滅菌工藝過程

小結(jié)

滅菌方法與原理：化學(xué)、物理培養(yǎng)基滅菌：間歇式，連續(xù)操作空氣除菌：過濾除菌工藝

思考題

（1）與滅菌相關(guān)的幾個(gè)概念有何不同

（2）比較分析培養(yǎng)基的間歇和連續(xù)滅菌工

藝的優(yōu)缺點(diǎn)及操作要點(diǎn)。

（3）空氣過濾滅菌的工藝過程及其主要關(guān)鍵點(diǎn)是是什么

第六章微生物發(fā)酵制藥工藝

6.1微生物發(fā)酵與制藥

6.2微生物生長與生產(chǎn)的關(guān)系

6.3微生物菌種建立

6.4培養(yǎng)基制備6.5滅菌工藝

6.6培養(yǎng)技術(shù)

6.6發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)

選擇合適的培養(yǎng)基；提供適宜的環(huán)境條件

微生物發(fā)酵工藝過程的三個(gè)工段：種子制備接種發(fā)酵培養(yǎng)

6.6.1種子制備

種子的制備：

種子的逐級擴(kuò)大培養(yǎng)過程。

獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。

1．孢子制備

種子活化：將保存菌種接種在固體培養(yǎng)基上，

在適宜條件下培養(yǎng)，恢復(fù)其固有生物特性。放線菌孢子：采用瓊脂斜面培養(yǎng)基。霉菌孢子：大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。

細(xì)菌：采用碳源有限而氮源

豐富的配方。

2．生產(chǎn)種子制備

搖瓶種子制備：母瓶、子瓶。

種子罐種子制備：一級、二級、三級種子。種子罐級數(shù)：制備種子需逐級擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)確定種子級數(shù)的因素:1、菌種生長特性及菌體繁殖速度：生長快，少

2、發(fā)酵罐的容積：越大，多

3、產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模：越大，多4、所選用工藝條件：有利于生長的工藝，少

種子擴(kuò)大培養(yǎng)罐

發(fā)酵類型的定義

一級發(fā)酵：將孢子或菌絲接入直接發(fā)酵罐

二級發(fā)酵：經(jīng)過一級種子罐，再到發(fā)酵罐；

谷氨酸生產(chǎn)三級發(fā)酵：二級種子擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)過二次種子罐，再接入發(fā)酵罐。青霉素生產(chǎn)

四級發(fā)酵：三級種子擴(kuò)

大培養(yǎng)，經(jīng)過三級種子罐，再到發(fā)酵罐。鏈霉素生產(chǎn)菌

接種方式

單種法：一只種子罐接種一只發(fā)酵罐。

雙種法：兩只種子罐接種一只發(fā)酵罐。倒種法：從發(fā)酵罐中取出一定量發(fā)酵液，接種到另一個(gè)發(fā)酵罐。

6.6.2培養(yǎng)技術(shù)

1、固體表面培養(yǎng)技術(shù)：Solidsurfaceculture原始，最早采用。2、液體深層培養(yǎng)：Liquidsubmergedculture

主要的發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)

3、高密度培養(yǎng)（highcelldensityculture）

概念：菌體濃度（干重）至少達(dá)到50g/L以上的一種理想培養(yǎng)，發(fā)酵工藝目標(biāo)和方向明確。

優(yōu)點(diǎn):

縮小發(fā)酵體積增加表達(dá)量成本低，生產(chǎn)率高。

6.6.3發(fā)酵培養(yǎng)的操作方式

1、分批式操作；間歇式操作；不連續(xù)操作2、流加式操作，補(bǔ)料－分批式操作3、半連續(xù)式操作，反復(fù)分批式或換液培養(yǎng)4、連續(xù)式操作，衡態(tài)操作

5、灌流式操作，不斷灌注新