微生物發(fā)酵工藝

微生物發(fā)酵工藝微生物發(fā)酵工藝微生物發(fā)酵工藝V:1.0精細整理，僅供參考微生物發(fā)酵工藝日期：20xx年X月第六章微生物發(fā)酵制藥工藝

6.1微生物發(fā)酵與制藥

6.2微生物生長與生產(chǎn)的關系

6.3微生物生產(chǎn)菌種建立6.4發(fā)酵培養(yǎng)基制備

6.4發(fā)酵培養(yǎng)基制備

?概念（medium）供微生物生長繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要

的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。

?培養(yǎng)基的組成和比例是否恰當，直接影響微生物的生長、生產(chǎn)和工藝選擇、產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量。

6.4.1培養(yǎng)基的成分

碳源

氮源無機鹽水生長因子

前體與促進劑

消泡劑

1、碳源(carbonsources)

概念：

構成微生物細胞和代謝產(chǎn)物中碳素的營養(yǎng)物質(zhì)。作用：為正常生理活動和過程提供能量來源，為細胞物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的合成提供碳骨架。

碳源種類

糖類：葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜

脂肪：豆油、棉籽油和豬油醇類：甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇蛋白類：蛋白胨、酵母膏速效碳源：糖類、有機酸

遲效碳源：酪蛋白水解產(chǎn)生的脂肪酸

2、氮源（nitrogensources）

概念：構成微生物細胞和代謝產(chǎn)物中氮素的營養(yǎng)物質(zhì)。

作用：為生長和代謝主要提供氮素來源。種類：無機氮源、有機氮源

有機氮源

幾乎所有微生物都能利用有機氮源

黃豆餅粉、花生餅粉

棉籽餅粉、玉米漿、蛋白\胨、酵母粉、尿素

無機氮源

氨水、銨鹽和硝酸鹽等。氨鹽比硝酸鹽更快被利用。

工業(yè)應用：主要氮源或輔助氮源；調(diào)節(jié)pH值生理酸性物質(zhì)：代謝后能產(chǎn)生酸性殘留物質(zhì)。

（NH4）2SO4利用后，產(chǎn)生硫酸

生理堿性物質(zhì)：代謝后能產(chǎn)生堿性殘留物質(zhì)。硝酸鈉利用后，產(chǎn)生氫氧化鈉。

3、無機鹽和微量元素

?概念：組成生理活性物質(zhì)或具有生理調(diào)節(jié)作用礦物質(zhì)

?作用方式：低濃度起促進作用，高濃度起抑制作用。?種類：鹽離子

磷、硫、鉀、鈉、鎂、鈣，常常添加

鐵、鋅、銅、鉬、鈷、錳、氯，一般不加。

4、水

菌體細胞的主要成分。

營養(yǎng)傳遞的介質(zhì)。良好導體，調(diào)節(jié)細胞生長環(huán)境溫度。培養(yǎng)基的主要成分之一。

5、生長因子（growthfactor）

概念：

維持微生物生長所必需的微量有機物，不起碳源和

氮源作用。

種類：

維生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸等。天然成分中含有：一般無需添加。營養(yǎng)缺陷型菌株：必需添加。

6、前體(precursor)

?概念：

加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中的某些化合物，被直接結合到目標產(chǎn)物分子中，而自身的結構無多大的變化。?使用：添加前體是提高抗生素產(chǎn)量的重要措施。

多次少量流加的工藝。

6、促進劑(accelerant)

?概念：

促進產(chǎn)物生成的物質(zhì)，但不是營養(yǎng)物，也不是前體的一類化合物。

?種類：

氯化物有利于灰黃霉素、金霉素合成。

表面活性劑吐溫、清洗劑，脂溶性小分子化合物等，

起誘導作用。

7、消沫劑（defoamingagent）

?概念：降低泡沫的液膜強度和表面黏度，使泡沫破裂的化合物。?種類：表面活性劑，低表面張力。天然動植物油脂類、高分子化合物（高碳醇脂肪酸和酯類、聚醚類、硅酮類）。?作用：消除泡沫，防止逃液和染菌。

6.4.2培養(yǎng)基種類及其質(zhì)量控制技術

培養(yǎng)基的種類

按用途：選擇性、鑒別性、富營養(yǎng)培養(yǎng)基等按物理性質(zhì)：固體，半固體、液體培養(yǎng)基

按化學組成：合成、半合成、天然培養(yǎng)基

按發(fā)酵過程中所處位置和作用：斜面或平板固體、

種子、發(fā)酵和補料培養(yǎng)基。

1、固體培養(yǎng)基

?概念：（solidmedium）

細菌和酵母的固體斜面或平板培養(yǎng)基，鏈霉菌和絲狀真菌的孢子培養(yǎng)基。

?制備：

液體培養(yǎng)基添加1.0-2.0%瓊脂粉。

?作用：

提供菌體的生長繁殖，形成孢子。

1、固體培養(yǎng)基－要求與質(zhì)量控制

?單細胞培養(yǎng)基：

營養(yǎng)豐富，滿足菌體生長迅速，不能引起變異。?孢子培養(yǎng)基：基質(zhì)濃度較低，無

機鹽濃度適量，以利于孢子形成。

營養(yǎng)不宜太豐富，否則不易產(chǎn)生孢

子。

2、種子培養(yǎng)基

?概念：（seedmedium）供孢子發(fā)芽和菌體生長繁殖，搖瓶和

作用：

種子罐培養(yǎng)基,為液

體。

使種子擴大培養(yǎng)，增加細胞數(shù)目，生長形成強壯、健康和高活性的種子。

2、種子培養(yǎng)基－要求與質(zhì)量控制

用速效性、容易被利用的碳、

培養(yǎng)基成分必需完全，營養(yǎng)豐富。氮源和無機鹽等物質(zhì)，但濃度

不宜高。

種子培養(yǎng)基要與發(fā)酵培養(yǎng)基相適應，主要成分接近，不能差異太大。

縮短發(fā)酵的延滯期。

3、發(fā)酵培養(yǎng)基

?概念：

(fermentationmedium)提供微生物生長、目標

產(chǎn)物生成的

生產(chǎn)用培養(yǎng)基。

作用：不僅要滿足菌體的生長和繁殖，還要滿足菌體合成目標產(chǎn)物，是發(fā)酵生產(chǎn)中最關鍵和最重要的培養(yǎng)基。

要求?營養(yǎng)物質(zhì)濃度和粘度適中

?組成上豐富完整

?不同菌種和不同產(chǎn)物，對培養(yǎng)基

的要求差異很大，

組成和配方需要優(yōu)化

4、補料培養(yǎng)基(fedmedium）

?概念：發(fā)酵過程中添加補充的培養(yǎng)基。?作用：穩(wěn)定工藝條件，延長發(fā)酵周期，提高目標產(chǎn)物產(chǎn)量?組成：各種必要的營養(yǎng)物質(zhì)，碳源、氮源、前體

?制備：按單一成分配制，各自獨立控制，或按一

定比例制成復合補料培養(yǎng)基。

5、控制發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量

（1）控制水質(zhì)：

恒定水源和恒定的水質(zhì)。地下深層井水，對水質(zhì)定期化驗檢查，使用符合要求的水質(zhì)配制各種培養(yǎng)基

措施：檢測與控制水質(zhì)參數(shù)

pH、溶解氧、可溶性固體、污染程度、各種礦物，特別是重金屬的種類和含量。

（2）控制培養(yǎng)基原料的質(zhì)量：

來源與種類的選擇農(nóng)產(chǎn)副品：因品種、產(chǎn)地、加工、貯存條件不同而質(zhì)量差異較大。

化學原料：雜質(zhì)含量也不相同。

措施：保持穩(wěn)定的原料來源。更換原料時，必需再進行一系列試驗，確保產(chǎn)量和質(zhì)量的控制和穩(wěn)定性。

原料的選擇試驗：

不同碳源、氮源對菌種生長的能力和產(chǎn)物的生產(chǎn)能力很不相同。對原料進行試驗，選擇滿足發(fā)酵要求的來源。

注意：

????????????碳氮濃度與配比：適宜

??????速效和緩效成分相互配合，發(fā)揮綜合優(yōu)勢

pH：配制時加入酸堿性物質(zhì)搭配，甚至使用緩劑。

（3）控制培養(yǎng)基的黏度：

對發(fā)酵的影響：?高黏度的培養(yǎng)基，不易徹底滅菌?影響發(fā)酵的通氣攪拌等物理過程?直接影響菌體對營養(yǎng)的利用?目標產(chǎn)物的分離提取造成困難

措施：固體不溶性成分，淀粉、黃豆粉等增加培養(yǎng)基的黏度，酶水解，降低大分子物質(zhì)

（4）控制滅菌操作：

高壓蒸氣滅菌影響培養(yǎng)基的有效成分甚至是活性。較高溫度下長時間滅菌，營養(yǎng)成分會破壞，甚至產(chǎn)生有毒物質(zhì)。磷酸鹽與碳酸鈣、鎂鹽、銨鹽也能反應，生成沉淀或絡合物，降低利用度。維生素等不耐高溫分解破壞、失活。

6.4.3制藥生產(chǎn)用培養(yǎng)基的配制

一般設計原則

設計思路計算與定量配制優(yōu)化

1、培養(yǎng)基設計一般原則

?生物學原則：根據(jù)不同微生物營養(yǎng)和反應需求設計。營養(yǎng)物質(zhì)組成：較豐富，濃度適當。成分之間比例：恰當，C/N比適宜，有機和無機氮原料之間：不能產(chǎn)生化學反應。適宜的pH和滲透壓?工藝原則：不影響通氣攪拌、分離精制和廢物處理，過程容易控制。?低成本原則：原料來源方便，質(zhì)量穩(wěn)定，質(zhì)優(yōu)價廉。?高效經(jīng)濟原則：滿足菌體生長和合成產(chǎn)物的需求，最高得率，最小副產(chǎn)物。

2、培養(yǎng)基設計基本思路

?起始培養(yǎng)基：根據(jù)他人的經(jīng)驗和使用。?單因素實驗：確定最適宜的培養(yǎng)基成分。?多因素實驗：各成分之間最佳配比和濃度優(yōu)化。?中試放大試驗：搖瓶、小型發(fā)酵罐，到中試，最后放大到生產(chǎn)罐。?綜合考慮各種因素，產(chǎn)量、純度、成本等后，確定一個適宜的生產(chǎn)配方。

3、理論計算與定量配制

?微生物生長和生產(chǎn)可用下列表達式表示：

碳源和能源＋氮源＋其他營養(yǎng)物質(zhì)→細胞＋產(chǎn)

物＋CO2＋H2O＋熱量

?單位細胞生物量所需最小的營養(yǎng)物質(zhì):?單位產(chǎn)量的最小底物濃度:

碳源和氮源進行轉化率計算和分析

?初步計算：參考微生物的化學和元素組成。

?轉化率：單位質(zhì)量原料生產(chǎn)的產(chǎn)物量或細胞量。

?理論轉化率：根據(jù)代謝途徑的物料衡算

?實際轉化率：發(fā)酵過程中實際測量數(shù)值計算。?目標：使實際轉化率靠近理論轉化率。

無法從生化反應原理來推斷和計算出最佳培養(yǎng)基配方根據(jù)生理學和生物化學理論參照前人所用的經(jīng)驗培養(yǎng)基

結合菌的特殊生物學和產(chǎn)品特征要求

進行大量細致和周密的試驗研究

小結

培養(yǎng)基組成與作用：C、N、無機鹽、水、生長因

子、前體與促進劑、消泡劑

培養(yǎng)基制備與質(zhì)量控制：固體、種子、發(fā)酵培養(yǎng)基生產(chǎn)用培養(yǎng)基制備：原則、思路、優(yōu)化

思考題

（1）培養(yǎng)基組成成分有哪些，有何作用（2）固體培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基的組成特點及其如何銜接（3）如何研制生產(chǎn)用培養(yǎng)基第六章微生物發(fā)酵制藥工藝

6.1微生物發(fā)酵與制藥

6.2微生物生長與生產(chǎn)的關系

6.3制藥微生物生產(chǎn)菌種建立

6.4培養(yǎng)基制備

6.5滅菌工藝

6.5滅菌工藝

滅菌方法與原理

培養(yǎng)基滅菌工藝

空氣除菌工藝

幾個概念

雜菌：除生產(chǎn)菌以外的任何微生物。污染：感染雜菌的培養(yǎng)或發(fā)酵體系。

?消毒：殺滅或清除病原微生物，達到無害化程

度，殺滅率99.9%以上。

?殺菌：殺滅或清除一切微生物，達到無活微生

物存在的過程，殺滅率99.9999%以上。?滅菌：微生物殺滅率99.999999%以上。

6.5.1滅菌方法與原理

1、化學滅菌2、物理滅菌

1、化學滅菌

用化學物質(zhì)殺滅微生物的滅菌操作。

?化學滅菌劑：

氧化劑類等，鹵化物類，有機化合物等。

細胞死亡。?應用：皮膚表面、器具、實驗室和工廠的無菌區(qū)域的臺面、地面、墻壁及空間的滅菌。

?機理：蛋白質(zhì)變性，酶失活，破壞細胞膜透性，

2、物理滅菌

各種物理條件如高溫、輻射、超聲波及過濾等進行滅菌?紫外線等射線：局部空間?干熱滅菌：實驗室器皿

?蒸汽滅菌：培養(yǎng)基

效果好，操作方便，廣泛使用。

6.5.2培養(yǎng)基滅菌

1、微生物高溫死亡動力學與滅菌的關系微生物受熱死亡過程的一級動力學反應：

－dX/dt=kdX

微生物濃度與滅菌時間成正比，濃度越高，滅

菌時間越長。

滅菌時間與比死亡速率之間的關系

kd與微生物種類、生理狀態(tài)、滅菌溫度有關以殺死芽孢的溫度和時間為指標。確保徹底滅菌，實際操作中增加50％的保險系數(shù)。

2、培養(yǎng)基滅菌的操作方式

(1)分批滅菌操作，間歇滅菌,實罐滅菌：配制好培養(yǎng)基輸入發(fā)酵罐內(nèi)，直接蒸汽加熱，達到

滅菌要求的溫度和壓力后維持一段時間，再冷卻至

發(fā)酵要求的溫度。?特點：不需其他的附屬設備，操作簡便，手動。?缺點：加熱和冷卻時間較長。營養(yǎng)成分損失較多，罐利用率低。適合小批量生產(chǎn)規(guī)模。

分批操作的滅菌過程

?加熱升溫：?維持滅菌溫度：15－30min，121℃；0.09－0.10MPa?冷卻降溫：每段對滅菌的貢獻于取決時間長短。

分批滅菌的操作過程

通入蒸汽：空氣管、夾套通入蒸汽。

加熱升溫：70℃，取樣管、放料管通入蒸汽。

維持保溫：120℃，罐壓0.1MPa，排氣。調(diào)節(jié)進

汽和排氣量，維持30min。冷卻降溫：依次關閉排氣、進汽閥。罐壓低于空氣壓力后，通入無菌空氣，夾套通入冷卻水降溫。

（2）連續(xù)滅菌操作

高溫短時滅菌操作，連消：

培養(yǎng)基在發(fā)酵罐外經(jīng)過一套滅菌設備連續(xù)的加熱

滅菌，冷卻后送入已滅菌的發(fā)酵罐內(nèi)的工藝過程。

加熱升溫、維持滅菌溫度和冷卻降溫三個階段由不同的設備執(zhí)行：加熱器，保溫設備，冷卻器。

（2）連續(xù)滅菌操作－流程圖培養(yǎng)基與高壓蒸汽直接混勻，達到滅菌溫度（130－140℃）

（2）連續(xù)滅菌－操作過程

配料：配料罐，配制培養(yǎng)基。預熱罐：定容和預加熱。70－90℃。加熱器：培養(yǎng)基與蒸汽混合，快速升到130－140℃。維持罐：維持滅菌時間,5－7分鐘。冷卻管：培養(yǎng)基經(jīng)過冷卻水管冷卻。40－50℃。輸入滅菌的發(fā)酵罐中。

連續(xù)滅菌的特點

1）高溫快速滅菌工藝，營養(yǎng)成分破壞的少；

2）熱能利用合理，易于自動化控制；

3）不適合粘度大或固形物含量高的培養(yǎng)基滅菌；

4）增加了連續(xù)滅菌設備及操作環(huán)節(jié)，增加染菌幾率。5）對壓力要求高，一般為0.45-0.8MPa。

6.5.3空氣除菌操作工藝

1、發(fā)酵對空氣的要求

好氧微生物需要氧氣供應，通入空氣。連續(xù)一定流量的壓縮無菌空氣。空氣流量：一般0.1-2.0。壓強：0.2-0.4MPa。

空氣質(zhì)量：相對濕度小于70％；比培養(yǎng)溫度高

10－30℃；潔凈度100級，或失敗率10－3。

2、工業(yè)制備大量空氣的方法

加熱滅菌：利用空氣壓縮時所產(chǎn)生的熱量除

菌，無菌化程度不高的發(fā)酵過程。靜電除菌：通過高壓電流場，帶電粒子被吸附。介質(zhì)過濾：捕集粒子及各種微生物。發(fā)酵工業(yè)采用。

3、空氣除菌原理

空氣中附著在塵埃上的微生物大小為0.5-5um。離心場作用：顆粒及其微生物沉降

直接被截留：顆粒慣性碰撞，相互集聚成大顆

粒。氣流速度越大，慣性越大，截留效果越好。靜電引力：有一定作用。

4、空氣過濾介質(zhì)

膜過濾介質(zhì)：孔徑小于被截留微生物體積

硝酸纖維酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龍膜，四氟乙烯、

纖維素樹脂微孔濾膜。0.1-0.5um

深層過濾介質(zhì)：空隙大于被截留微生物體積。纖維狀或顆粒狀：棉花(50um)、玻璃纖維、活性炭

過濾紙：超細玻璃纖維紙(1-1.5um)

金屬燒結管：單根或幾十根甚至上百根金屬微孔濾

管安裝在過濾器內(nèi)。

5、空氣滅菌工藝過程

小結

滅菌方法與原理：化學、物理培養(yǎng)基滅菌：間歇式，連續(xù)操作空氣除菌：過濾除菌工藝

思考題

（1）與滅菌相關的幾個概念有何不同

（2）比較分析培養(yǎng)基的間歇和連續(xù)滅菌工

藝的優(yōu)缺點及操作要點。

（3）空氣過濾滅菌的工藝過程及其主要關鍵點是是什么

第六章微生物發(fā)酵制藥工藝

6.1微生物發(fā)酵與制藥

6.2微生物生長與生產(chǎn)的關系

6.3微生物菌種建立

6.4培養(yǎng)基制備6.5滅菌工藝

6.6培養(yǎng)技術

6.6發(fā)酵培養(yǎng)技術

選擇合適的培養(yǎng)基；提供適宜的環(huán)境條件

微生物發(fā)酵工藝過程的三個工段：種子制備接種發(fā)酵培養(yǎng)

6.6.1種子制備

種子的制備：

種子的逐級擴大培養(yǎng)過程。

獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。

1．孢子制備

種子活化：將保存菌種接種在固體培養(yǎng)基上，

在適宜條件下培養(yǎng)，恢復其固有生物特性。放線菌孢子：采用瓊脂斜面培養(yǎng)基。霉菌孢子：大米、小米、玉米、麩皮、麥粒等天然農(nóng)產(chǎn)品為培養(yǎng)基。

細菌：采用碳源有限而氮源

豐富的配方。

2．生產(chǎn)種子制備

搖瓶種子制備：母瓶、子瓶。

種子罐種子制備：一級、二級、三級種子。種子罐級數(shù)：制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)確定種子級數(shù)的因素:1、菌種生長特性及菌體繁殖速度：生長快，少

2、發(fā)酵罐的容積：越大，多

3、產(chǎn)物的品種及生產(chǎn)規(guī)模：越大，多4、所選用工藝條件：有利于生長的工藝，少

種子擴大培養(yǎng)罐

發(fā)酵類型的定義

一級發(fā)酵：將孢子或菌絲接入直接發(fā)酵罐

二級發(fā)酵：經(jīng)過一級種子罐，再到發(fā)酵罐；

谷氨酸生產(chǎn)三級發(fā)酵：二級種子擴大培養(yǎng)，經(jīng)過二次種子罐，再接入發(fā)酵罐。青霉素生產(chǎn)

四級發(fā)酵：三級種子擴

大培養(yǎng)，經(jīng)過三級種子罐，再到發(fā)酵罐。鏈霉素生產(chǎn)菌

接種方式

單種法：一只種子罐接種一只發(fā)酵罐。

雙種法：兩只種子罐接種一只發(fā)酵罐。倒種法：從發(fā)酵罐中取出一定量發(fā)酵液，接種到另一個發(fā)酵罐。

6.6.2培養(yǎng)技術

1、固體表面培養(yǎng)技術：Solidsurfaceculture原始，最早采用。2、液體深層培養(yǎng)：Liquidsubmergedculture

主要的發(fā)酵培養(yǎng)技術

3、高密度培養(yǎng)（highcelldensityculture）

概念：菌體濃度（干重）至少達到50g/L以上的一種理想培養(yǎng)，發(fā)酵工藝目標和方向明確。

優(yōu)點:

縮小發(fā)酵體積增加表達量成本低，生產(chǎn)率高。

6.6.3發(fā)酵培養(yǎng)的操作方式

1、分批式操作；間歇式操作；不連續(xù)操作2、流加式操作，補料－分批式操作3、半連續(xù)式操作，反復分批式或換液培養(yǎng)4、連續(xù)式操作，衡態(tài)操作

5、灌流式操作，不斷灌注新