人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取RTPCR的原理方法瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用分析

2022/11/10

RNA第一頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10◆人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取◆RT-PCR的原理、方法◆瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用主要內(nèi)容第二頁(yè)，共四十九頁(yè)。

人類細(xì)胞質(zhì)RNA提取第三頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10電泳PCR提取總RNA合成cDNA第一鏈第四頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10真核細(xì)胞RNA的種類真核細(xì)胞總RNA主要由rRNA〔80-85%〕、tRNA和核內(nèi)小分子RNA(10-15%)、mRNA〔1-5%〕組成，其中rRNA、tRNA和mRNA位于細(xì)胞質(zhì)中。大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA在其3'端均有一多聚A(PolyA)尾巴。第五頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備

RNA實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是RNA酶的污染。由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，只要存在少量的RNA酶就會(huì)引起RNA的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以建立一個(gè)無(wú)RNA酶的環(huán)境對(duì)于制備RNA很重要。第六頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10常用的RNA酶抑制劑1、焦磷酸二乙酯〔DEPC〕：與RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合，進(jìn)而使RNA酶失活，有高致癌性?！矊?shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段使用〕2、異硫氰酸胍、氯仿：提取RNA同時(shí)也使RNA酶失活。3、RNA酶的蛋白抑制劑〔RNasin〕：從大鼠肝或人胎盤中提取得來(lái)的酸性糖蛋白?！埠铣蒫DNA階段使用〕第七頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10實(shí)驗(yàn)原理Trizol試劑盒是一種苯酚與異硫氰酸胍(GTC)的混合物，異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞，促使核蛋白體的解離，使RNA與蛋白質(zhì)別離。參加氯仿可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚促使RNA進(jìn)入水相，離心后，RNA保存在水相中，DNA和蛋白質(zhì)保存在有機(jī)相中。轉(zhuǎn)移水相，參加異丙醇沉淀RNA，從而得到純化的總RNA。第八頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10

提取RNA〔一〕、準(zhǔn)備試劑氯仿異丙醇75℅乙醇無(wú)RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC處理過(guò)的水配制)

第九頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10

提取RNA〔二〕、操作步驟取材:用生理鹽水漱口后，含生理鹽水約2~3min，用15ml離心管〔4000rpm5min〕收集細(xì)胞(同管屢次離心)，棄上清

沉淀中參加1mlTRIzol，旋渦震蕩10s重懸沉淀，加樣槍打勻溶液后轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管，15~30℃放置5min

參加0.2ml氯仿，用手搖晃15s，15~30℃放置5min

12000rpm離心15min第十頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10

提取RNA〔二〕、操作步驟小心吸取上清，轉(zhuǎn)移至新的1.5mlEp管，參加等體積的異丙醇，15~30℃放置10min

12000rpm離心15min，小心去上清，參加1ml70%乙醇，震蕩數(shù)秒，8000rpm離心5min

小心去上清，室溫枯燥5min，參加10ulDEPC水，打勻

55℃水浴10分鐘助溶第十一頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10

提取RNA〔三〕、本卷須知1、塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高壓滅菌。2、有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇枯燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。3、所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6h或更長(zhǎng)時(shí)間。4、配制的溶液應(yīng)盡可能用0.1%DEPC在37℃處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過(guò)的無(wú)菌雙蒸水配制，然后經(jīng)濾膜過(guò)濾除菌。5、操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中手套要勤換。第十二頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10

提取RNA〔三〕、本卷須知6、設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。7、防止RNA酶污染〔1〕RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等〔2〕嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑的污染?！?〕最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶；而各種組織和細(xì)胞中那么含有大量?jī)?nèi)源性的RNA酶。第十三頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10

RNA保存溶解在無(wú)RNase的水或TE中，在-70℃或更低溫度中保存時(shí)間在一年以內(nèi)，但防止反復(fù)凍融，應(yīng)分裝保存。從富含RNase的樣品〔如胰臟、肝臟〕中別離到的RNA需溶解在去離子甲酰胺中存于-70℃，至少可以保存一年。需使用RNA時(shí)，可以參加NaAc至終濃度0.3M，12000×g離心5分鐘，70%乙醇洗滌后再用無(wú)RNase的水或TE溶解。第十四頁(yè)，共四十九頁(yè)。RT-PCR的原理、方法第十五頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10實(shí)驗(yàn)原理1、單拷貝基因表達(dá)存在逐步放大機(jī)制。2、PCR技術(shù)，即聚合酶鏈?zhǔn)椒错憽７错懛秩剑鹤冃?，退火，延伸?、逆轉(zhuǎn)錄酶?？梢砸訰NA為模板合成cDNA第一條鏈，或者以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA。principedoesmatter

可見(jiàn)，RT-PCR是一種將cDNA合成與PCR技術(shù)結(jié)合分析基因表達(dá)的快速靈敏的方法。第十六頁(yè)，共四十九頁(yè)。RNA模板逆轉(zhuǎn)錄酶DNA-RNA雜化雙鏈RNase降解RNA

單鏈DNADNA聚合酶cDNART-PCRTaq酶第十七頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/101、引物的特異性決定PCR反響特異性。2、引物設(shè)計(jì)原那么的把握：〔1〕引物長(zhǎng)度:一般為15～30bp〔2〕堿基分布〔3〕3‘端要求〔4〕引物自身二級(jí)結(jié)構(gòu)〔5〕引物之間的二級(jí)結(jié)構(gòu)〔6〕同源序列

〔7〕5’端無(wú)嚴(yán)格限制

操作步驟〔一〕引物設(shè)計(jì)第十八頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10

操作步驟〔二〕RNA的提取第十九頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10

操作步驟〔二〕RNA的提取第二十頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10〔1〕兩步法RT-PCR

操作步驟〔三〕cNDA合成a常用的反響體系10×RT反響緩沖液2uldNTPMixture〔各10mM〕2ulRNAaseinhibitor(40U/ul)0.5uloligo(dT)181ul逆轉(zhuǎn)錄酶1ul總RNA0.5~1ugDEPC－free水補(bǔ)足體系至20ul第二十一頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10〔1〕兩步法RT-PCR

操作步驟〔三〕cNDA合成b操作在發(fā)給每人一份的已制備分裝的逆轉(zhuǎn)錄反響管里參加8ul總RNA溶液0.2mlEp管，迷你離心機(jī)離心數(shù)秒，放置PCR儀中42℃30min〔合成cDNA第一鏈〕85℃5min〔滅活逆轉(zhuǎn)錄酶〕↓↓第二十二頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10〔2〕一步法RT-PCR

操作步驟〔三〕cNDA合成在一步法RT-PCR中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR在同時(shí)為逆轉(zhuǎn)錄和PCR優(yōu)化的條件下，在同一管內(nèi)進(jìn)行。優(yōu)勢(shì)：在處理大量樣品時(shí)易于操作；減少剩余污染；可以得到更高的靈敏度。缺點(diǎn)：無(wú)法優(yōu)化反響條件；一旦失敗，必須重新提取總RNA。

第二十三頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10〔2〕一步法RT-PCR

操作步驟〔三〕cNDA合成·0.1-1ug總RNA200一500umol/L的dNTP(每種)0.5umol／L基因特異引物〔上下游〕200UAMV逆轉(zhuǎn)錄酶1×Taq聚合酶緩沖液0.5-15mmol／LMgCI21mmo1／LDTT1.5UTaq聚臺(tái)酶終體積為50ul。第二十四頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10〔1〕50ulPCR體系的組成〔即一步法〕：

操作步驟〔四〕PCR擴(kuò)增第二十五頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10〔2〕PCR反響過(guò)程：

操作步驟〔四〕PCR擴(kuò)增第二十六頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10〔1〕引物退火溫度的調(diào)節(jié)，一般在引物設(shè)計(jì)軟件推薦溫度的上下2℃變化尋找最佳答案退火溫度?！?〕此外Mg2＋濃度的調(diào)節(jié)也非常重要，通常最佳答案濃度為2mM左右。〔3〕引物和模板的量等。

操作步驟〔五〕PCR條件的優(yōu)化第二十七頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10根據(jù)產(chǎn)物長(zhǎng)度制作適宜濃度的瓊脂糖凝膠〔不同長(zhǎng)度產(chǎn)物所需凝膠濃度〕。取適量PCR產(chǎn)物，加上樣緩沖液充分混合，點(diǎn)樣于事先做好的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，10V/cm電泳45－60min。成像系統(tǒng)成像分析。

操作步驟〔六〕產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測(cè)定

第二十八頁(yè)，共四十九頁(yè)。

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析及其應(yīng)用第二十九頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10實(shí)驗(yàn)原理1、瓊脂糖為鏈狀多糖→繩狀瓊脂糖束→大網(wǎng)孔型凝膠——?jiǎng)e離、鑒定、純化DNA2、影響DNA遷移率的因素：DNA分子的大小、構(gòu)象，凝膠濃度，電壓，電泳緩沖液的組成principedoesmatter瓊脂糖濃度與DNA分離范圍瓊脂糖濃度/%線狀DNA大小/kb

0.5

0.7

1.0

1.2

1.5

2.0

30-1

12-0.8

10-0.57-0.4

3-0.2

2-0.05第三十頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10染色和照相電泳

樣品的制備與加樣選擇電泳類型選擇電泳緩沖體系瓊脂糖凝膠的制備第三十一頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10選擇電泳類型用于別離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型〔平板型〕。

STEPSdoesmatter第三十二頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10選擇緩沖液系統(tǒng)

常用的電泳緩沖液有EDTA〔pH8.0〕和Tris-乙酸〔TAE〕，Tris-硼酸〔TBE〕或Tris-磷酸〔TPE〕等，濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。

STEPSdoesmatter第三十三頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10凝膠的制備以稀釋的電泳緩沖液為溶劑，用微波爐配制一定濃度的溶膠，灌入水平膠框或垂直膠膜，插入梳子，自然冷卻。

STEPSdoesmatter第三十四頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10樣品配制與加樣

DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解，緩沖液內(nèi)含有0.25%溴酚藍(lán)或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油，以增加其比重，使樣品集中。

STEPSdoesmatter第三十五頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10電泳在低電壓條件下，線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。因此為了獲得電泳別離DNA片段的最大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不宜高于5V/cm。

STEPSdoesmatter第三十六頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10染色與照相常用熒光染料溴乙錠〔EB〕染色，在紫外光下觀察DNA條帶，用紫外分析儀拍照，或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片，并進(jìn)行有關(guān)的數(shù)據(jù)分析。

STEPSdoesmatter第三十七頁(yè)，共四十九頁(yè)。第三十八頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10

結(jié)果分析〔一〕、影響瓊脂糖凝膠電泳的因素DNA分子的大?。簩?shí)驗(yàn)證明，DNA片段遷移距離與其分子量的對(duì)數(shù)成反比；瓊脂糖的濃度：一定大小的DNA片段在不同濃度的瓊脂凝膠中，電泳遷移率不相同；DNA分子的構(gòu)型：不同構(gòu)型的DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳速度差異較大第三十九頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10

結(jié)果分析〔二〕、常見(jiàn)問(wèn)題的原因和解決常見(jiàn)問(wèn)題原因?qū)Σ唠娪緯r(shí)ladder扭曲配膠的緩沖液與電泳的緩沖液不是同時(shí)配制。同時(shí)配制，電泳緩沖液高出膠的1-2mm即可。電泳時(shí)電壓過(guò)高電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)20V/cm。第四十頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10

結(jié)果分析〔二〕、常見(jiàn)問(wèn)題的原因和解決常見(jiàn)問(wèn)題原因?qū)Σ逥NA帶缺尖DNA跑出凝膠縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增加凝膠濃度。分子大小相近的DNA帶不易分辨增加電泳時(shí)間，核準(zhǔn)正確凝膠濃度DNA變性電泳前勿加熱，用20mMNaCl緩沖液稀釋DNA。DNA鏈巨大，常規(guī)凝膠電泳不合適。在脈沖凝膠電泳上個(gè)分析。第四十一頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10

結(jié)果分析〔二〕、常見(jiàn)問(wèn)題的原因和解決常見(jiàn)問(wèn)題原因?qū)Σ邘趸驘o(wú)DNA帶DNA上樣量不夠增加DNA上樣量，聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖電泳靈敏度高，上樣量可適當(dāng)降低。DNA降解實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)避免核酸酶污染。DNA跑出凝膠縮短電泳時(shí)間，降低電壓，增加凝膠濃度。EB染色的DNA所用光源不合適應(yīng)用短波長(zhǎng)（254nm）的紫外光源。第四十二頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10

結(jié)果分析〔二〕、常見(jiàn)問(wèn)題的原因和解決常見(jiàn)問(wèn)題原因?qū)Σ叱霈F(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶酶量多或者酶的質(zhì)量差，dNTP濃度高，Mg2+濃度高，退火溫度過(guò)低，循環(huán)次數(shù)多。減少酶量或更換酶，減少dNTP濃度，適當(dāng)降低Mg2+濃度，增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。不規(guī)則DNA帶遷移電泳條件不合適電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)20V/cm，溫度<30℃，巨大DNA鏈電泳， 溫度<15℃，檢查所用電泳緩沖液的緩沖能力，注意經(jīng)常更換。DNA變性電泳前勿加熱，用20mMNaCl緩沖液稀釋DNA。第四十三頁(yè)，共四十九頁(yè)。常見(jiàn)問(wèn)題原因?qū)Σ逥NA條帶模糊DNA降解實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)避免核酸酶污染。電泳緩沖液陳舊電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，PH值上升，緩沖能力減弱，從而影響電泳效果。TBE建議使用10就更換。所用電泳條件不合適電泳時(shí)電壓不應(yīng)超過(guò)20V/cm，溫度<30℃，巨大DNA鏈電泳， 溫度<15℃，檢查所用電泳緩沖液的緩沖能力，注意經(jīng)常更換。DNA上樣量過(guò)多減少凝膠中DNA上樣量DNA含鹽過(guò)高電泳前通過(guò)乙醇沉淀去除多余鹽分。有蛋白污染電泳前酚抽提去除蛋白。DNA變性電泳前勿加熱，用20mMNaCl緩沖液稀釋DNA。第四十四頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10應(yīng)用

1、PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行的電泳檢測(cè)。

doesmatter

icationappl第四十五頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10應(yīng)用

2、瓊脂糖在其他方面的應(yīng)用

⑴、瓊脂糖在免疫擴(kuò)散法中的應(yīng)用。⑵瓊脂糖在雙鏈DNA探針的合成方法中的作用。

doesmatter

icationappl第四十六頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10[1]劉陽(yáng),楊淑霞,賴翼等.影響瓊脂糖凝膠電泳條帶扭曲程度的因素[J].生物學(xué)雜志,2022,26(2):70-72.DOI:10.3969/j.issn.1008-9632.2022.02.070.參考文獻(xiàn)第四十七頁(yè)，共四十九頁(yè)。2022/11/10THEEND第四十八頁(yè)，共四十九頁(yè)。內(nèi)容總結(jié)2022/3/10。3、RNA酶的蛋白抑制劑〔RNasin〕：從大鼠肝或人胎盤中提取得來(lái)的酸性糖蛋白。3、所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6h或更長(zhǎng)時(shí)間。從富含RNase的樣品〔如胰臟、肝臟〕中別離到的RNA需溶解在去離子甲酰胺中存于-70℃，至少可以保存一年?？梢砸訰NA為模板合成cDNA第一條鏈，或者以第一條DNA鏈為模板合成互補(bǔ)的雙鏈cDNA?！?〕3‘端要求。成像系統(tǒng)成像分析第四十九頁(yè)，共四十九頁(yè)。低血糖危象

概念又稱低血糖癥低血糖癥(hypoglycemia)是由多種病因引起的血葡萄糖(簡(jiǎn)稱血糖)濃度過(guò)低所致的一組臨床綜合征。一般以成人血漿血糖濃度＜2.8mmol/L，或全血葡萄糖＜2.5mmol/L為低血糖。兒童低血糖診斷標(biāo)準(zhǔn)比成人值低1.11mmol/L，但是否出現(xiàn)臨床癥狀，個(gè)體差異較大。低血糖癥定義據(jù)生化指標(biāo)和臨床表現(xiàn)分3種類型低血糖癥：血糖水平低于2.8mmol/l，同時(shí)有臨床癥狀，及時(shí)進(jìn)餐后可緩解。低血糖：血糖水平低于2.8mmol/l，可有或無(wú)癥狀。低血糖反應(yīng):患者有與低血糖相應(yīng)的臨床癥狀和體征，血糖多數(shù)低于2.8mmol/l，但也有可能不低。主要與血糖下降速度過(guò)快引起升糖激素釋放（如兒茶酚胺）所致的癥狀及體征有關(guān)。血糖水平及生理應(yīng)答反應(yīng)血糖水平降低至4.6mmol/l時(shí)，胰島素分泌受抑制。血糖水平在3.8mmol/l時(shí)，胰高血糖素、腎上腺素開(kāi)始釋放。血糖水平在3.0mmol/l時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn)低血糖癥狀。血糖水平低于2.8mmol/l時(shí)，患者出現(xiàn)進(jìn)行性認(rèn)知能力下降。血糖低于1.5mmol/l時(shí)，患者出現(xiàn)昏迷。低血糖癥的臨床表現(xiàn)交感神經(jīng)興奮的表現(xiàn)

在血糖下降快，腎上腺素分泌較多時(shí)更為明顯，為一種代償反應(yīng)。表現(xiàn)為心慌、出汗、饑餓、無(wú)力、手抖、視物模糊、面色蒼白、緊張感。低血糖的分級(jí)輕度：僅有饑餓感，可伴一過(guò)性出汗、心悸，可自行緩解。中度：心悸、出汗、饑餓明顯，有時(shí)可發(fā)生手抖、頭昏，需補(bǔ)充含糖食物方可糾正。重度：是在中度低血糖癥狀的基礎(chǔ)上出現(xiàn)中樞神經(jīng)供能不足的表現(xiàn)，如嗜睡、意識(shí)（認(rèn)人、認(rèn)方向）障礙、胡言亂語(yǔ)、甚至昏迷，死亡病因血糖利用過(guò)度和血糖生成不足發(fā)病機(jī)制體內(nèi)維持血糖正常有賴于消化道、肝腎、及內(nèi)分泌腺體等多器官功能的協(xié)調(diào)一致。人體通過(guò)神經(jīng)體液調(diào)節(jié)機(jī)制來(lái)維持血糖的穩(wěn)定，當(dāng)血糖下降時(shí)，重要的反應(yīng)是體內(nèi)胰島素分泌減少，而胰島素的反調(diào)節(jié)激素如腎上腺素、胰升糖素、皮質(zhì)醇分泌增加。使肝糖原產(chǎn)生增加，糖利用減少，以保持血糖穩(wěn)定。主要生理意義；保證對(duì)腦細(xì)胞的供能，腦細(xì)胞所需的能量幾乎完全直接來(lái)自血糖而且本身沒(méi)有糖原儲(chǔ)備，當(dāng)血糖下降到≤2.8mmol／L時(shí)一方面引起交感神經(jīng)興奮大量?jī)翰璺影丰尫?，另一方面由于能量供?yīng)不足使大腦皮質(zhì)功能抑制，皮質(zhì)下功能異常即表現(xiàn)為中樞神經(jīng)癥狀和交感神經(jīng)興奮癥狀。病情評(píng)估交感神經(jīng)興奮的癥狀；出汗、顫抖、心悸（心跳加快）、饑餓、焦慮、緊張、軟弱無(wú)力、面色蒼白、流涎、肢涼震顫、血壓輕度升高，這些癥狀血糖快速下降時(shí)尤其突出。

神經(jīng)性低血糖的癥狀；即腦功能障礙癥狀，表現(xiàn)為精神不集中、頭暈、遲鈍、視物