2022年醫(yī)學(xué)專題-第4講+細(xì)胞融合與體細(xì)胞雜交

第4講細(xì)胞融合與體細(xì)胞雜交(zájiāo)1新品種培育(péiyù)技術(shù)第一頁(yè)，共七十一頁(yè)。2第二頁(yè)，共七十一頁(yè)。雜交(zájiāo)31.通過不同的基因型的個(gè)體之間的交配而取得某些雙親基因重新組合的個(gè)體的方法。2.兩條單鏈DNA或RNA的堿基配對(duì)。雜交優(yōu)勢(shì)：兩個(gè)(liǎnɡɡè)遺傳基礎(chǔ)不同的植物或動(dòng)物進(jìn)行雜交，其雜交后代所表現(xiàn)出的各種性狀均優(yōu)于雜交雙親，比如抗逆性強(qiáng)、早熟高產(chǎn)、品質(zhì)優(yōu)良等。一般情況下，通過生殖細(xì)胞相互融合而達(dá)到這一目的過程稱為雜交。較多的是種間、種內(nèi)雜交。由體細(xì)胞相互融合達(dá)到這一結(jié)果的過程稱為體細(xì)胞雜交。第三頁(yè)，共七十一頁(yè)。4部分野生品種的塊莖、果實(shí)雖不能食用，但它們的植株具有較強(qiáng)的抗病蟲害、抗鹽堿性(jiǎnxìnɡ)和耐寒能力。因此，用野生馬鈴薯和番茄分別與馬鈴薯、番茄作物雜交，培育出了生存能力較強(qiáng)的雜交系植物。雜交玉米等雜交植物比它們的親本更為健壯(jiànzhuàng)，產(chǎn)量更高。雜交(zájiāo)擬南芥（中間）比其親本（左和右）要大《自然》（Nature）2008年11月23日：中美科學(xué)家近日研究發(fā)現(xiàn)雜交植物比其親本生長(zhǎng)更大更好的原因:負(fù)責(zé)光合作用和淀粉代謝的基因在白天要更為活躍第四頁(yè)，共七十一頁(yè)。5第五頁(yè)，共七十一頁(yè)。不親和性不親和性：在有性生殖過程中，由于生物個(gè)體的細(xì)胞或組織水平上的不協(xié)調(diào)而使受精(shòujīng)或接合不能正常進(jìn)行，或是受精后不能產(chǎn)生后代的現(xiàn)象。例如：生殖細(xì)胞不能融合，或受精卵不能發(fā)育，或子代無(wú)繁殖能力等。是雙親個(gè)體間基因型的不協(xié)調(diào)或是染色體組非同源性在生殖生理表型上的一種反映。不親和性是穩(wěn)定物種的重要機(jī)理之一。種間不親和性：異種、異屬生物個(gè)體之間的生殖不親和現(xiàn)象常由染色體組的不同所造成。一般地說，越是遠(yuǎn)緣則不親和性越高，直到完全不能受精。種內(nèi)不親和性：種內(nèi)個(gè)體間的不親和現(xiàn)象往往是受不親和基因所制約而并不是染色體組不同的結(jié)果。6第六頁(yè)，共七十一頁(yè)。遠(yuǎn)源(yuǎnyuán)雜交遠(yuǎn)緣雜交：不同種屬之間，或是地理上遠(yuǎn)緣的種內(nèi)亞種之間個(gè)體的交配稱為遠(yuǎn)緣雜交。由于種屬間存在著種種隔離機(jī)制，致使(zhìshǐ)遠(yuǎn)緣雜交常表現(xiàn)不親和或獲得的遠(yuǎn)緣雜種表現(xiàn)不育。體細(xì)胞雜交是解決遠(yuǎn)源雜交不親和性的有力手段之一，更好地利用自然界基因資源，培育新物種7第七頁(yè)，共七十一頁(yè)。8視頻(shìpín)：/special/show_3043714/ACRkYAQc9LIhIUwv.html第八頁(yè)，共七十一頁(yè)。9第九頁(yè)，共七十一頁(yè)。第一(dìyī)部分細(xì)胞融合10第十頁(yè)，共七十一頁(yè)。一定義(dìngyì)與意義細(xì)胞融合（Cellfusion）是指用人工方法使兩個(gè)或兩個(gè)以上的細(xì)胞合并形成一個(gè)細(xì)胞的技術(shù)。對(duì)于植物也叫“原生質(zhì)體融合”。親本細(xì)胞是體細(xì)胞，也叫“體細(xì)胞雜交（somaticcellhybridization）”。由于它不僅(bùjǐn)能產(chǎn)生同種細(xì)胞融合，也能產(chǎn)生種間細(xì)胞的融合，因此細(xì)胞融合技術(shù)在創(chuàng)造新細(xì)胞、培育新品種方面意義重大。11第十一頁(yè)，共七十一頁(yè)。二細(xì)胞融合的分類(fēnlèi)1.材料：原生質(zhì)體（去除了細(xì)胞壁的裸露的細(xì)胞）、動(dòng)物細(xì)胞。2.從親本來源：（1）同核體（Homokaryon）：基因型相同的細(xì)胞融合(rónghé)成的融合(rónghé)細(xì)胞。（2）異核體（Heterokaryon）：來自不同基因型的融合細(xì)胞。3.從融合效果：（1）對(duì)稱融合（Symmetricfusion）：兩個(gè)完整的細(xì)胞間的融合。（2）不對(duì)稱融合（Asymmetricfusion）：利用物理或化學(xué)方法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再與另外一個(gè)完整細(xì)胞進(jìn)行融合。12第十二頁(yè)，共七十一頁(yè)。13原生質(zhì)體A原生質(zhì)體B同質(zhì)(tónɡzhì)融合（B+B）異質(zhì)(yìzhì)融合（A+B）同核體（BB）異核體（AB）核融合(rónghé)B的核丟失雜種細(xì)胞（A+B）B的染色體丟失胞質(zhì)雜種不對(duì)稱雜種B的染色體部分丟失第十三頁(yè)，共七十一頁(yè)。三發(fā)展(fāzhǎn)歷史自發(fā)融合現(xiàn)象最初在動(dòng)物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)。1858年發(fā)現(xiàn)正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞情況。動(dòng)物體內(nèi)的破骨細(xì)胞也是自發(fā)融合形成的多核細(xì)胞。1962年日本學(xué)者發(fā)現(xiàn)一種叫日本血凝性病毒(HVJ)能引起艾氏腹水瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞的現(xiàn)象。20世紀(jì)70年代初，華裔加籍科學(xué)家高國(guó)楠發(fā)現(xiàn)聚乙二醇(PEG)能促使(cùshǐ)植物原生質(zhì)體融合，開拓了植物細(xì)胞融合的研究。20世紀(jì)80年代，齊默曼（Zimmerman）等建立電場(chǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞融合方法。14第十四頁(yè)，共七十一頁(yè)。15第十五頁(yè)，共七十一頁(yè)。主要(zhǔyào)環(huán)節(jié)（1）親本選擇(xuǎnzé)（單細(xì)胞或原生質(zhì)體制備）（2）兩原生質(zhì)體或細(xì)胞互相靠近，粘附（3）質(zhì)膜融合形成細(xì)胞橋（4）胞質(zhì)滲透（5）細(xì)胞核融合（6）融合細(xì)胞篩選16第十六頁(yè)，共七十一頁(yè)。原生質(zhì)體及其制備(zhìbèi)（1）定義：去除細(xì)胞壁后裸露的細(xì)胞稱之為原生質(zhì)體（protoplast）。（2）特點(diǎn)：無(wú)細(xì)胞壁，可以(kěyǐ)方便地進(jìn)行遺傳操作、人工誘變、細(xì)胞器轉(zhuǎn)移、細(xì)胞融合等操作。具有全能性，能再生細(xì)胞壁。17第十七頁(yè)，共七十一頁(yè)。（3）制備(zhìbèi)18第十八頁(yè)，共七十一頁(yè)。19兩步法：

酶分離法果膠酶處理(chǔlǐ)材料游離(yóulí)出單細(xì)胞纖維素酶處理(chǔlǐ)單細(xì)胞分離出原生質(zhì)體優(yōu)點(diǎn)：所獲得的原生質(zhì)體均勻一致、質(zhì)量好；缺點(diǎn)：操作復(fù)雜，已被淘汰。第十九頁(yè)，共七十一頁(yè)。20一步法外植體酶液配制(pèizhì)：注意纖維素酶、果膠酶和滲透壓穩(wěn)定劑（甘露醇）的配比及pH酶液離心(líxīn)過濾滅菌(mièjūn)后-20℃保存外植體放入酶液，真空泵抽引滲透處理26℃搖床振蕩2-8小時(shí)第二十頁(yè)，共七十一頁(yè)。（4）分離(fēnlí)、鑒定與活力分析（1）分離飄浮法：常用的飄浮劑有蔗糖(zhètáng)、Percoll、Ficoll等。沉降法：低速離心，收集沉淀。不連續(xù)梯度法:21無(wú)菌下，濃度較高溶液（如20%蔗糖(zhètáng)溶液）加入離心管加入原生質(zhì)體混合液封口后，離心，原生質(zhì)體漂浮在上面用吸管收集原生質(zhì)體液面，放入液體培養(yǎng)基或甘露醇懸浮洗滌原生質(zhì)體2-3次將原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基中備用飄浮法第二十一頁(yè)，共七十一頁(yè)。22沉降(chénjiàng)法

微孔(wēikǒnɡ)濾膜過濾酶混合液低速(dīsù)離心3-5min棄去上清液和酶液液體培養(yǎng)基或甘露醇懸浮洗滌原生質(zhì)體2-3次除去未消化的組織細(xì)胞使原生質(zhì)體沉淀將原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基中備用第二十二頁(yè)，共七十一頁(yè)。23不連續(xù)梯度法

離心管中配制(pèizhì)成不同的濃度梯度加入(jiārù)原生質(zhì)體混合液離心5min，原生質(zhì)體位于(wèiyú)某一濃度梯度，用吸管收集液體培養(yǎng)基或甘露醇懸浮洗滌原生質(zhì)體2-3次將原生質(zhì)體懸浮在液體培養(yǎng)基中備用第二十三頁(yè)，共七十一頁(yè)。24葉片原生質(zhì)體分離純化流程圖第二十四頁(yè)，共七十一頁(yè)。（2）鑒定與活力分析低滲爆破(bàopò)法：爆破后是無(wú)形的。滲透壓調(diào)節(jié)劑：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。染色法：有活力的原生質(zhì)體吸收不同染料顯示與死亡細(xì)胞不同的顏色來分析。FDA（二乙酸熒光素）能自由地穿越細(xì)胞質(zhì)膜，在活細(xì)胞內(nèi)，F(xiàn)DA被酯酶裂解即發(fā)熒光（熒光素），由于熒光素不能自由通過質(zhì)膜，因而可以在熒光顯微鏡下通過具熒光的細(xì)胞的觀察確定細(xì)胞活性25第二十五頁(yè)，共七十一頁(yè)。26酚藏花紅(huāhóng)染色法（0.1%)酚藏花紅能使無(wú)活力的原生質(zhì)體染成紅色，有活力的原生質(zhì)體不著色。 伊凡藍(lán)(Evan’sblue)染色法(0.025%)有活力但受損傷的細(xì)胞和死細(xì)胞能夠攝取這種染料，活細(xì)胞不攝取。 氧電極法：有活力原生質(zhì)體光照下放出(fànɡchū)氧氣，黑暗耗氧氣 第二十六頁(yè)，共七十一頁(yè)。關(guān)鍵(guānjiàn)：細(xì)胞核的融合27第二十七頁(yè)，共七十一頁(yè)。五細(xì)胞融合方法(fāngfǎ)1.生物法病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合：研究最早的細(xì)胞融合誘導(dǎo)方法。主要是由于病毒會(huì)與宿主細(xì)胞膜直接融合，同時(shí)進(jìn)入兩個(gè)細(xì)胞就會(huì)打破兩個(gè)細(xì)胞膜的隔閡，引發(fā)細(xì)胞質(zhì)的交流，進(jìn)而達(dá)到細(xì)胞融合的目的。原因可能是病毒的磷脂外衣與動(dòng)物細(xì)胞膜相似，病毒外殼上的某些糖蛋白有促進(jìn)細(xì)胞融合的功能。仙臺(tái)病毒、皰疹病毒、牛痘病毒和副黏液病毒等。仙臺(tái)病毒（HAJ）是兩層磷脂組成的外膜包裹著RNA與蛋白質(zhì)的復(fù)合體。因HAJ病毒毒力弱，易被滅活而常采用。缺點(diǎn)：要提前大量培養(yǎng)病毒，并且滅活后才能作為融合劑使用，操作繁瑣，而且一旦滅活不充分的話，病毒還可能感染操作者與親本細(xì)胞。因此，目前已經(jīng)(yǐjing)很少使用病毒誘導(dǎo)法進(jìn)行細(xì)胞融合。28第二十八頁(yè)，共七十一頁(yè)。原理(yuánlǐ)與過程（1）足夠量的病毒顆粒(kēlì)附著在細(xì)胞膜上起搭橋作用，使細(xì)胞聚集在一起。（2）通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個(gè)細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相融合。粘結(jié)部位質(zhì)膜被破壞，不同細(xì)胞間形成通道，細(xì)胞質(zhì)流通并融合（病毒也隨之進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)）。（3）有絲分裂，細(xì)胞核融合，形成雜種細(xì)胞。29第二十九頁(yè)，共七十一頁(yè)。2化學(xué)法可以采用(cǎiyòng)的化學(xué)誘導(dǎo)劑包括：NaNO3、高pH的高濃度Ca2+離子、聚乙二醇（PEG）、溶菌酶、明膠、抗體、植物凝血素伴刀豆球蛋白A等。細(xì)胞膜電荷平衡被打破。30第三十頁(yè)，共七十一頁(yè)。（1）NaNO3誘導(dǎo)(yòudǎo)融合1909年，凱斯特（Kuster）發(fā)現(xiàn)機(jī)械分離的發(fā)生了質(zhì)壁分離的洋蔥表皮細(xì)胞原生質(zhì)體在NaNO3溶液中可以恢復(fù)并伴隨著細(xì)胞融合。1972年，卡爾森（Carlson）利用NaNO3誘導(dǎo)融合了粉蘭煙草和郎氏煙草原生質(zhì)體，培育出世界第一株體細(xì)胞雜種。NaNO3的鈉離子可以中和原生質(zhì)體表面負(fù)電荷，引起原生質(zhì)體聚集，促進(jìn)細(xì)胞融合。NaNO3對(duì)原生質(zhì)體無(wú)損害(sǔnhài)，但融合效率低，一般小于4%。31第三十一頁(yè)，共七十一頁(yè)。（2）高pH的高濃度Ca2+離子(lízǐ)誘導(dǎo)融合1973年，凱勒（Keller）和梅爾切斯（Melchers）發(fā)現(xiàn)采用強(qiáng)堿性（例如pH10.5）的高濃度鈣離子(lízǐ)溶液（50mmol/LCaCl2?2H2O）在37℃下處理兩個(gè)品系的煙草葉肉原生質(zhì)體，很容易促使融合，融合率可以達(dá)到10%。鈣離子中和原生質(zhì)體膜或細(xì)胞膜表明表面電荷，使彼此緊密接觸，決定質(zhì)膜的穩(wěn)定性和可塑性；高pH能改變質(zhì)膜的表面電荷，利于細(xì)胞融合。32第三十二頁(yè)，共七十一頁(yè)。（3）PEG誘導(dǎo)(yòudǎo)聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)是一種多聚化合物，分子式為H(OHCH2-CH2)nOH)。常用的PEG平均(píngjūn)分子量在200－20,000之間，分子量1,000以下者為液體，1,000以上者為固體。

PEG分子具有輕微的負(fù)極性，可以與具有正極性基團(tuán)的水分子、蛋白質(zhì)、碳水化合物形成氫鍵，在相鄰的原生質(zhì)體間起到分子橋的作用，使原生質(zhì)體接觸。當(dāng)PEG分子被洗脫時(shí)，膜電荷發(fā)生紊亂而重新分配。此時(shí)，一種原生質(zhì)體上帶正電的基團(tuán)可能與另外一個(gè)原生質(zhì)體中帶負(fù)電的基團(tuán)相連，導(dǎo)致原生質(zhì)體融合。33第三十三頁(yè)，共七十一頁(yè)。（4）高Ca2+和pH誘導(dǎo)(yòudǎo)PEG結(jié)合誘導(dǎo)34第三十四頁(yè)，共七十一頁(yè)。細(xì)胞融合例子(lìzi)1

甘藍(lán)與大白菜的化學(xué)誘導(dǎo)融合35第三十五頁(yè)，共七十一頁(yè)。36第三十六頁(yè)，共七十一頁(yè)。37第三十七頁(yè)，共七十一頁(yè)。38第三十八頁(yè)，共七十一頁(yè)。39第三十九頁(yè)，共七十一頁(yè)。3物理(wùlǐ)法電融合誘導(dǎo)法（Electrofusion）：利用電場(chǎng)來誘導(dǎo)細(xì)胞彼此連接成串，再施加瞬間強(qiáng)脈沖促使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，促進(jìn)細(xì)胞融合的技術(shù)。原理：在直流電脈沖的刺激(cìjī)下，細(xì)胞膜或原生質(zhì)體質(zhì)膜表面的電荷和氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞或原生質(zhì)體粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進(jìn)而連接，直到閉合成完整的膜形成融合體。優(yōu)點(diǎn)：融合率高、重復(fù)性與可控制性強(qiáng)。缺點(diǎn)：可能會(huì)造成不可恢復(fù)的細(xì)胞損傷。40第四十頁(yè)，共七十一頁(yè)。41第四十一頁(yè)，共七十一頁(yè)。細(xì)胞融合舉例2

——薄荷的電誘導(dǎo)(yòudǎo)融合42第四十二頁(yè)，共七十一頁(yè)。43第四十三頁(yè)，共七十一頁(yè)。六融合細(xì)胞(xìbāo)篩選因融合(rónghé)的隨機(jī)性而成為細(xì)胞融合(rónghé)的關(guān)鍵而必需的技術(shù)44第四十四頁(yè)，共七十一頁(yè)。1篩選(shāixuǎn)的原因與必要性細(xì)胞融合是一個(gè)隨機(jī)的物理過程，經(jīng)融合后細(xì)胞將以多種形式出現(xiàn)，需要通過(tōngguò)培養(yǎng)和篩選，除去不需要的細(xì)胞，分離出需要的雜種細(xì)胞，從而解決融合細(xì)胞的選擇問題。問題：A與B融合過程中，你能預(yù)見有哪些形式的細(xì)胞嗎？A-B，A-A，B-B。A-A-A，B-B-B，A-A-B,B-B-A等多聚體。未融合的A，B。45第四十五頁(yè)，共七十一頁(yè)。2雜種(zázhǒng)細(xì)胞篩選方法（1）細(xì)胞(xìbāo)形態(tài)大小差異

(2)熒光標(biāo)記選擇（3）再生后雜種與親本形態(tài)、性質(zhì)差異46第四十六頁(yè)，共七十一頁(yè)。47。

FITC(異硫氰酸熒光素)在熒光顯微鏡下呈綠色(lǜsè)RITC(異硫氰酸羅丹明)

RITC在熒光顯微鏡下呈紅色第四十七頁(yè)，共七十一頁(yè)。48（4）選擇性培養(yǎng)基篩選法：互補(bǔ)選擇法.利用原生質(zhì)體對(duì)培養(yǎng)基成分要求與反應(yīng)的差異選擇雜種細(xì)胞的方法。例如：利用抗性標(biāo)記、酶缺陷型、激素需求(xūqiú)差異等。親本原生質(zhì)體生長(zhǎng)要求外源激素，而有的雜種細(xì)胞由于雙親互補(bǔ)作用會(huì)產(chǎn)生內(nèi)激素，從而使雜種細(xì)胞能在無(wú)激素的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。第四十八頁(yè)，共七十一頁(yè)。49原生質(zhì)體矮牽牛爬山虎冠癭混合體融合(rónghé)處理矮牽牛+爬山虎細(xì)胞(xìbāo)團(tuán)愈傷組織(zǔzhī)（異核體）NT培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基(無(wú)激素)NT培養(yǎng)基NT培養(yǎng)基細(xì)胞團(tuán)MS培養(yǎng)基(無(wú)激素)死亡MS培養(yǎng)基(有激素)愈傷組織原生質(zhì)體細(xì)胞團(tuán)MS培養(yǎng)基(無(wú)激素)死亡愈傷組織第四十九頁(yè)，共七十一頁(yè)。細(xì)胞融合例子3：

利用抗性標(biāo)記進(jìn)行(jìnxíng)的融合細(xì)胞篩選50第五十頁(yè)，共七十一頁(yè)。51第五十一頁(yè)，共七十一頁(yè)。52費(fèi)氏中華(Zhōnghuá)根瘤菌第五十二頁(yè)，共七十一頁(yè)。七細(xì)胞融合的應(yīng)用(yìngyòng)植物：體細(xì)胞雜交培育新品種動(dòng)物(dòngwù)：?jiǎn)慰寺】贵w生產(chǎn)（動(dòng)物(dòngwù)細(xì)胞生物制藥講授）53第五十三頁(yè)，共七十一頁(yè)。第二部分(bùfen)體細(xì)胞雜交Somaticcellhybridization54第五十四頁(yè)，共七十一頁(yè)。一體細(xì)胞雜交育種(zájiāoyùzhǒnɡ)的意義1克服有性不親和性，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)源遺傳重組。2問題：與基因工程改造相比有什么優(yōu)點(diǎn)？植物的抗逆性多為多基因控制(kòngzhì)，因此易于實(shí)現(xiàn)多基因控制性狀。55第五十五頁(yè)，共七十一頁(yè)。二技術(shù)(jìshù)路線56關(guān)鍵技術(shù)：細(xì)胞融合、組織培養(yǎng)第五十六頁(yè)，共七十一頁(yè)。三植物(zhíwù)新品種培育解析

文獻(xiàn)(wénxiàn)討論57第五十七頁(yè)，共七十一頁(yè)。例子(lìzi)4：屬間體細(xì)胞雜交58第五十八頁(yè)，共七十一頁(yè)。59MES:2-(N-嗎啡(mafēi)啉）乙磺酸

CPW是胞-原生質(zhì)體清洗液成份(chéngfèn)有KH2PO4KNO3CaCl2,2H2OMgSO4.7H2OKICuSO4.5H2O第五十九頁(yè)，共七十一頁(yè)。60第六十頁(yè)，共七十一頁(yè)。61第六十一頁(yè)