專題生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能課件

生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能生物大分子的結(jié)構(gòu)1

第一章

核酸的結(jié)構(gòu)和功能

StructureandFunctionofNucleicAcid第一章核酸的結(jié)構(gòu)和功能2

目錄第一節(jié)核酸的種類、分布和化學(xué)組成第二節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)第三節(jié)核酸的理化性質(zhì)及其應(yīng)用第四節(jié)核酸的制備、測定及研究技術(shù)目錄第一節(jié)核酸的種類、分布和化學(xué)組成3核酸(nucleicacid)

核酸是一類重要的生物大分子，擔(dān)負(fù)著生命信息的儲(chǔ)存與傳遞。核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分子。核酸(nucleicacid)核酸是一類重要的生物4

核酸的發(fā)現(xiàn)和研究工作進(jìn)展1868年FridrichMiescher從膿細(xì)胞中提取“核素”

1944年Avery等人證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)1953年Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型1966年Nirenberg發(fā)現(xiàn)遺傳密碼1975年Temin和Baltimore發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶;Sanger建立DNA測序方法1981年T.Cech發(fā)現(xiàn)了核酶1985年Mullis發(fā)明PCR技術(shù)1990年美國啟動(dòng)人類基因組計(jì)劃(HGP)

1999年中國獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃2001年美、英等國完成人類基因組計(jì)劃基本框架核酸的發(fā)現(xiàn)和研究工作進(jìn)展1868年FridrichMi5第一節(jié)核酸的種類、分布和化學(xué)組成一、核酸的生物學(xué)功能二、核酸的種類和分布三、核酸的化學(xué)組成第一節(jié)核酸的種類、分布和化學(xué)組成一、核酸的生物學(xué)功能6一、核酸的生物學(xué)功能orand肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)一、核酸的生物學(xué)功能orand肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)7蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA生物學(xué)的中心法則蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA生物學(xué)的中心法則8二、核酸的種類及分布(DNA)(RNA)脫氧核糖核酸

核糖核酸RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，約占90%，少量存在于細(xì)胞核。RNA有三種：信使RNA（mRNA），占總RNA

5%。核糖體RNA

（rRNA），占總RNA

80%。轉(zhuǎn)移RNA（

tRNA），占總RNA

10-15%。真核98%核中（染色體中）核外線粒體（mDNA）葉綠體（ctDNA）原核擬核核外：質(zhì)粒（plasmid）病毒：DNA病毒二、核酸的種類及分布(DNA)(RNA)脫氧核糖核酸核9三、核酸的化學(xué)組成核酸核苷酸核苷磷酸堿基戊糖元素組成：CHONPA、G、C、U（RNA)A、G、C、T(DNA)核糖（RNA）脫氧核糖（DNA）三、核酸的化學(xué)組成核酸核苷酸核苷磷酸堿基戊糖元素組成：C10兩類核酸的基本化學(xué)組成DNARNA嘌呤堿腺嘌呤鳥嘌呤腺嘌呤鳥嘌呤嘧啶堿胞嘧啶胸腺嘧啶胞嘧啶尿嘧啶戊糖D-2-脫氧核糖D-核糖酸

磷酸

磷酸兩類核酸的基本化學(xué)組成DNARNA嘌呤堿11（一）戊糖組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為D-核糖。RiboseDeoxyribose（一）戊糖組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為D-2-脫氧12(二）堿基1.嘌呤（Purine）123456978腺嘌呤AdenineA鳥嘌呤guanineG(二）堿基1.嘌呤（Purine）123456978腺嘌呤132.嘧啶（Pyrimidine）123456尿嘧啶uracilU胞嘧啶cytosineC胸腺嘧啶thymineTCH32.嘧啶（Pyrimidine）123456尿嘧啶U胞嘧啶14

稀有堿基除上述5種基本的堿基外，核酸中還有一些含量甚少的堿基，通常稱為稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。N,N-二甲基腺嘌呤：m2666A稀有堿基除上述5種基本的堿基外，核酸中還有一些含量甚少的堿15（三）核苷核苷戊糖+堿基糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)（三）核苷核苷戊糖+堿基1’2’3’4’5’(O16AdenosineGuanosineCytidineUridine核酸中的各種核苷AdenosineGuanosine17幾種稀有核苷假尿嘧啶核苷（）二氫尿嘧啶核苷（DHU）2-O-甲基腺苷(Am)CH3CH3H3CHH5HH′6A）（m2N,N-二甲基腺嘌呤66幾種稀有核苷假尿嘧啶核苷（）二氫尿嘧啶核苷2-O-甲18（四）核苷酸腺嘌呤核苷酸（AMP）

Adenosinemonophosphate脫氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）

Deoxyadenosinemonophosphate鳥嘌呤核苷酸（GMP）胞嘧啶核苷酸（CMP）尿嘧啶核苷酸（UMP）脫氧鳥嘌呤核苷酸（dGMP）脫氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）脫氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）OHH（四）核苷酸腺嘌呤核苷酸（AMP）脫氧腺嘌呤核苷酸（dA19PPPPPPPP腺嘌呤核苷酸（AMP）鳥嘌呤核苷酸（GMP）尿嘧啶核苷酸（UMP）胞嘧啶核苷酸（CMP）脫氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）脫氧鳥嘌呤核苷酸（dGMP）脫氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）脫氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）PPPPPPPP腺嘌呤核苷酸鳥嘌呤核苷酸尿嘧啶核苷酸胞嘧啶核20

（五）細(xì)胞內(nèi)游離核苷酸及其衍生物多磷酸核苷酸環(huán)化核苷酸輔酶類核苷酸（五）細(xì)胞內(nèi)游離核苷酸及其衍生物多磷酸核苷酸21AMPADPATP

1.多磷酸核苷酸AMPADPATP1.多磷酸核苷酸222.環(huán)化核苷酸OPOOHOA(G)OOOHCH2HHHHcAMP(cGMP)的結(jié)構(gòu)

2.環(huán)化核苷酸OPOOHOA(G)OOOHCH2HHHHc233.輔酶類核苷酸NADP+NAD+3.輔酶類核苷酸NADP+NAD+24VitB2FMNAMPFADVitB2FMNAMPFAD25第二節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)

一、DNA的分子結(jié)構(gòu)二、RNA的分子結(jié)構(gòu)第二節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)

一、DNA的分子結(jié)構(gòu)26一、DNA的分子結(jié)構(gòu)（一）DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)（二）DNA堿基組成的Chargaff規(guī)則（三）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)（四）DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)一、DNA的分子結(jié)構(gòu)（一）DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)27（一）DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)是由數(shù)量極其龐大的四種脫氧核苷酸，dAMP,dGMP,dCMP,dTMP通過3′5′-磷酸二酯鍵連接起來的線形或環(huán)形多核苷酸鏈。

DNA分子中核苷酸的排列順序叫做DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，簡稱為堿基序列。一級(jí)結(jié)構(gòu)的走向規(guī)定為5′→3′。不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列順序，因此攜帶有不同的遺傳信息（一）DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)是由數(shù)量極其龐大的2855333-5磷酸二酯鍵核酸分子中核苷酸之間的共價(jià)鍵55333-5磷酸二酯鍵核酸分子中核苷酸之29一級(jí)結(jié)構(gòu)表示法：結(jié)構(gòu)式，線條式，字母式5′3′結(jié)構(gòu)式5pApTpCpGpCpT-OH3

字母式ATP5PCPGPCPTPOH3線條式一級(jí)結(jié)構(gòu)表示法：結(jié)構(gòu)式，線條式，字母式5′3′結(jié)構(gòu)式530（二）DNA堿基組成的Chargaff規(guī)則Chargaff首先注意到DNA堿基組成的某些規(guī)律性，在１９５０年總結(jié)出DNA堿基組成的規(guī)律：1.同一生物的不同組織的DNA堿基組成相同；2.同一種生物DNA堿基組成不隨生物體的年齡、營養(yǎng)狀態(tài)或者環(huán)境變化而改變；3.幾乎所有的DNA，無論種屬來源如何，其腺嘌呤摩爾含量與胸腺嘧啶摩爾含量相同［A］=［T］，鳥嘌呤摩爾含量與胞嘧啶摩爾含量相同［G］=［C］，總的嘌呤摩爾含量與總的嘧啶摩爾含量相同［A］＋［G］=［C］＋［T］。4.不同生物來源的DNA堿基組成不同，表現(xiàn)在A＋T/G＋C比值的不同。這些結(jié)果后來為DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型提供了一個(gè)有力的佐證。（二）DNA堿基組成的Chargaff規(guī)則Chargaff首31（三）DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)——雙螺旋結(jié)構(gòu)（三）DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)——雙螺旋結(jié)構(gòu)321.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景堿基組成分析Chargaff規(guī)則：[A]=

[T][G]

[C]

堿基的理化數(shù)據(jù)分析A-T、G-C以氫鍵配對(duì)較合理DNA纖維的X-光衍射圖譜分析1.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景堿基組成分析堿基的理化數(shù)據(jù)332.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)

（Watson,Crick,1953）（1）DNA分子由兩條反向平行的多核苷酸鏈構(gòu)成雙螺旋結(jié)構(gòu)。兩條鏈圍繞同一個(gè)“中心軸”形成右手螺旋，螺旋表面有一條大溝和一條小溝。（2）嘌呤堿和嘧啶堿層疊于螺旋內(nèi)側(cè)，堿基平面與縱軸垂直，堿基之間的堆積距離為0.34nm。磷酸與脫氧核糖在外側(cè)，彼此之間通過磷酸二酯鍵連接，形成DNA的骨架。糖環(huán)平面與中軸平行。2.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（1）DNA分子由兩條反向342.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)

（Watson,Crick,1953）（3）雙螺旋的直徑為2nm，順軸方向每隔0.34nm有一個(gè)核苷酸,兩個(gè)核苷酸之間的夾角為36o，因此，沿中心軸每旋轉(zhuǎn)一周有10個(gè)核苷酸。（4）一條多核苷酸鏈上的嘌呤堿基與另一條鏈上的嘧啶堿基以氫鍵相連，匹配成對(duì)，配對(duì)的原則是A=

T之間形成二個(gè)氫鍵，GC之間形成三個(gè)氫鍵。因此，DNA的一條鏈為另一條鏈的互補(bǔ)鏈。2.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)（3）雙螺旋的直徑為2nm，35

堿基的配對(duì)

AT

CG堿基的配對(duì)A363.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素

氫鍵堿基堆集力帶負(fù)電荷的磷酸基與帶正電荷的陽離子形成離子鍵3.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素

氫鍵374.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多態(tài)性Z-DNAB-DNAA-DNA三種DNA雙螺旋構(gòu)象比較ABZ外型粗短適中細(xì)長螺旋方向右手右手左手螺旋直徑2.3nm2.0nm1.8nm螺距2.8nm3.4nm4.5nm堿基夾角33o

36o

60o每圈堿基數(shù)111012堿基對(duì)間垂直距離0.255nm0.34nm0.37nm堿基對(duì)傾角20o

0o

7o

大溝很窄很深很寬較深平坦小溝很寬、淺窄、深較窄很深4.DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多態(tài)性Z-DNAB-DNAA-DNA385.三鏈DNADNA三鏈間的堿基配對(duì)T-A-TC-G-CDNA分子內(nèi)的三鏈結(jié)構(gòu)多聚嘌呤多聚嘧啶

DNA分子內(nèi)的三鏈結(jié)構(gòu)5.三鏈DNADNA三鏈間的堿基配對(duì)T-A-TC-G-C39（四）DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲成三級(jí)結(jié)構(gòu)。（四）DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋進(jìn)一步扭曲成三級(jí)結(jié)構(gòu)。401.DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)某些小病毒、細(xì)菌的質(zhì)粒、噬菌體、真核生物線粒體和葉綠體以及某些細(xì)菌染色體中的DNA為雙鏈環(huán)形，其三級(jí)結(jié)構(gòu)為麻花狀超螺旋形式。1.DNA的超螺旋結(jié)構(gòu)某些小病毒、細(xì)菌的質(zhì)粒、噬菌體、真核41L=25,T=25,W=0松弛環(huán)形1152010523L=23,T=23,W=0解鏈環(huán)形15101520231510152025L=23,T=25,W=–2負(fù)超螺旋121482316131510152023右手旋轉(zhuǎn)擰松兩周后的線形DNADNA超螺旋的形成超螺旋的拓?fù)鋵W(xué)公式：L=T+WL=25,T=25,W=0松弛環(huán)形1152010523L=242超螺旋狀態(tài)的定量描述

公式1：L=T+WL——連環(huán)數(shù)，DNA雙螺旋中一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù)。

T——DNA分子中的螺旋數(shù)

W——超螺旋周數(shù)或扭曲數(shù)公式2：λ=（L-L0）/L0λ——超螺旋度

L0——松馳態(tài)DNA連環(huán)數(shù)如上述超螺旋DNA的L=23

L0=25，λ=-0.08L=25,T=25,W=0松弛環(huán)形1152010523L=23,T=25,W=–2負(fù)超螺旋12148231613超螺旋狀態(tài)的定量描述

公式1：L=T+W公式2：43DNA超螺旋結(jié)構(gòu)整體或局部的拓?fù)鋵W(xué)變化及其調(diào)控對(duì)于DNA復(fù)制和RNA轉(zhuǎn)錄過程具有關(guān)鍵作用。

DNA超螺旋結(jié)構(gòu)形成的意義DNA超螺旋結(jié)構(gòu)形成的意義442.DNA在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組裝真核生物染色體由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其基本單位是

核小體(nucleosome)。核小體的組成

DNA：約200bp

組蛋白：H1H2A，H2BH3H4各2分子2.DNA在真核生物細(xì)胞核內(nèi)的組裝真核生物染色體由DNA和45核小體的直徑10-11nm，DNA分子在組蛋白核心外面纏繞約1.8圈，有大約160bp。連接核小體的DNA片段約為32-34bp核小體的直徑10-11nm，DNA分子在組蛋白核心外面纏繞約46核小體盤繞及染色質(zhì)示意圖核小體盤繞及染色質(zhì)示意圖47二、RNA的分子結(jié)構(gòu)（一）RNA一級(jí)結(jié)構(gòu)和類別（二）tRNA的分子結(jié)構(gòu)（三）rRNA的分子結(jié)構(gòu)（四）mRNA的分子結(jié)構(gòu)二、RNA的分子結(jié)構(gòu)（一）RNA一級(jí)結(jié)構(gòu)和類別48（一）RNA的類別和一級(jí)結(jié)構(gòu)

信使RNA（messengerRNA，mRNA）：在蛋白質(zhì)合成中起模板作用；核糖體RNA（ribosoalRNA，rRNA）：與蛋白質(zhì)結(jié)合構(gòu)成核糖體（ribosome）,核糖體是蛋白質(zhì)合成的場所；轉(zhuǎn)移RNA（transforRNA，tRNA）：在蛋白質(zhì)合成時(shí)起著攜帶活化氨基酸的作用。（一）RNA的類別和一級(jí)結(jié)構(gòu)信使RNA（me49

RNA分子中各核苷之間的連接方式（3′-5′磷酸二酯鍵）和排列順序叫做RNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)OHOHOH5′3′

RNA與DNA的差異

DNARNA糖脫氧核糖核糖堿基AGCTAGCU

不含稀有堿基含稀有堿基RNA分子中各核苷之間的連接方式（3′-5′磷酸50（二)tRNA

的分子結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)特征：

單鏈三葉草葉形四臂四環(huán)三級(jí)結(jié)構(gòu)特征：

在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步折疊扭曲形成倒L型（二)tRNA的分子結(jié)構(gòu)二級(jí)結(jié)構(gòu)特征：三級(jí)結(jié)構(gòu)特征：51tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)

——三葉草形DHU環(huán)IGC反密碼子反密碼環(huán)氨基酸臂可變環(huán)TψC環(huán)CCA3′5′氨基酸臂DHU環(huán)反密碼環(huán)額外環(huán)TΨC環(huán)tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)

——三葉草形DHU52tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)

——倒L形

tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)

——倒L形

53*真核生物5SrRNA28SrRNA5.8SrRNA18SrRNA原核生物5SrRNA23SrRNA16SrRNArRNA的種類（根據(jù)沉降系數(shù)）（三）rRNA的分子結(jié)構(gòu)*真核生物原核生物rRNA的種類（根據(jù)沉降系數(shù)）（三）rR54

結(jié)構(gòu)特征：單鏈，螺旋化程度較tRNA低

與蛋白質(zhì)組成核糖體后方能發(fā)揮其功能5S

RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)特征：單鏈，螺旋化程度較tRNA低5SRNA的二級(jí)55（四）mRNA的分子結(jié)構(gòu)hnRNA內(nèi)含子(intron)mRNA*mRNA成熟過程

外顯子(exon)（四）mRNA的分子結(jié)構(gòu)hnRNA內(nèi)含子mRNA56*mRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1.大多數(shù)真核mRNA的5′末端均在轉(zhuǎn)錄后加上一個(gè)7-甲基鳥苷，同時(shí)第一個(gè)核苷酸的C′2也是甲基化，形成帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppNm-。2.大多數(shù)真核mRNA的3′末端有一個(gè)多聚腺苷酸(polyA)結(jié)構(gòu)，稱為多聚A尾。*mRNA結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：1.大多數(shù)真核mRNA的5′末端57帽子結(jié)構(gòu)帽子結(jié)構(gòu)帽子結(jié)構(gòu)OCH3︳帽子結(jié)構(gòu)帽子結(jié)構(gòu)帽子結(jié)構(gòu)OCH3︳58mRNA由核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移mRNA的穩(wěn)定性翻譯起始的調(diào)控帽子結(jié)構(gòu)和多聚A尾的功能mRNA由核內(nèi)向胞質(zhì)的轉(zhuǎn)移帽子結(jié)構(gòu)和多聚A尾的功能59*mRNA的功能把DNA所攜帶的遺傳信息，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，抄錄并傳送至核糖體，用以決定其合成蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序。DNAmRNA蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯原核細(xì)胞

細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核DNA內(nèi)含子外顯子轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄后剪接轉(zhuǎn)運(yùn)mRNAhnRNA翻譯蛋白真核細(xì)胞

*mRNA的功能DNAmRNA蛋白轉(zhuǎn)錄翻譯原核細(xì)胞60其他小分子RNA除了上述三種RNA外，細(xì)胞的不同部位存在的許多其他種類的小分子RNA，統(tǒng)稱為非mRNA小RNA(smallnon-messengerRNAs,snmRNAs)。

snmRNAs其他小分子RNA除了上述三種RNA外，細(xì)胞的不同部位存在的許61第三節(jié)核酸的理化性質(zhì)及其應(yīng)用一、核酸的一般性質(zhì)二、核酸的紫外吸收性質(zhì)三、核酸的變性、復(fù)性和分子雜交第三節(jié)核酸的理化性質(zhì)及其應(yīng)用一、核酸的一般性質(zhì)62一、核酸的一般性質(zhì)1、性狀：DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末。2、粘性：核酸的水溶液粘度很大，DNA分子粘度大于RNA。核酸變性后，粘度下降。一、核酸的一般性質(zhì)1、性狀：DNA為白色纖維狀固體，RNA為633、溶解性：RNA和DNA都是極性的化合物，兩者都微溶于水，不溶于乙醇、乙醚、氯仿等有機(jī)溶劑。它們的鈉鹽易溶于水。

核酸的提取？3、溶解性：RNA和DNA都是極性的化合物，兩者都微溶于水，644、核酸的酸堿性質(zhì)

核酸的磷酸基具有酸性，堿基具有堿性，因此，核酸具有兩性電離的性質(zhì)。但核酸中磷酸基的酸性大于堿基的堿性，其等電點(diǎn)偏酸性。DNA的pI約為4～5，RNA的pI約為2.0～2.5，在pH7～8電泳時(shí)泳向正極。

4、核酸的酸堿性質(zhì)65二、核酸的紫外吸收性質(zhì)1、光吸收：

紫外吸收波段：240－290nm

最大吸收峰：260nm2、變性后的光學(xué)性質(zhì)：（1）增色效應(yīng)：

與天然DNA相比，變性DNA因其雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞，使堿基充分外露，因此，紫外吸收增加，這種現(xiàn)象叫增色效應(yīng)。（2）減色效應(yīng)：

若變性DNA復(fù)性形成雙螺旋結(jié)構(gòu)后，其紫外吸收降低，這種現(xiàn)象叫減色效應(yīng)。二、核酸的紫外吸收性質(zhì)1、光吸收：66DNA的紫外吸收光譜天然DNA變性DNA核苷酸總吸收值1232202402602800.10.20.30.4波長（nm）光吸收123DNA的紫外吸收光譜天然DNA12202402602800.67OD260的應(yīng)用

1.DNA或RNA的定量RNA濃度（ug/mL）=OD2600.022XLX稀釋倍數(shù)DNA濃度（ug/mL）=0.02XLOD260X稀釋倍數(shù)式中：OD260為260nm波長處光密度值；L為比色杯的光程，一般為1cm；0.022為每毫升溶液含1微克RNA的光密度；0.02為每毫升溶液內(nèi)含1微克DNA鈉鹽時(shí)的光密度。OD260的應(yīng)用

1.DNA或RNA的定量RNA濃度（ug682.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.02.判斷核酸樣品的純度DNA純品:OD260/OD28069三、核酸的變性、復(fù)性和分子雜交（一）變性（二）復(fù)性（三）核酸的分子雜交三、核酸的變性、復(fù)性和分子雜交（一）變性70(一）變性1、DNA變性的概念：指DNA分子中的雙螺旋結(jié)構(gòu)解鏈為無規(guī)則線性結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。2、DNA變性的本質(zhì)：維持雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。3、導(dǎo)致DNA變性的因素：凡能破壞雙螺旋穩(wěn)定性的因素，如加熱、極端的pH、有機(jī)試劑甲醇、乙醇、尿素及甲醛等，均可引起核酸分子變性(一）變性1、DNA變性的概念：指DNA分子中的雙螺旋結(jié)構(gòu)解71DNA的變性過程加熱部分雙螺旋解開無規(guī)則線團(tuán)鏈內(nèi)堿基配對(duì)DNA的變性過程加熱部分雙螺旋解開無規(guī)則線724、變性后其它理化性質(zhì)變化：OD260增高 粘度下降比旋度下降 浮力密度升高酸堿滴定曲線改變 生物活性喪失4、變性后其它理化性質(zhì)變化：OD260增高 粘73Tm：熔解溫度DNA的變性發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍內(nèi)，通常把熱變性過程中光吸收達(dá)到最大吸收一半時(shí)的溫度稱為該DNA的熔點(diǎn)或熔解溫度，用Tm表示。

DNA的Tm值一般在70℃～

85℃之間。某些DNA的Tm值60801001.01.41.2100%A260t\0CTmTmTm123Tm：熔解溫度DNA的變性發(fā)生在一個(gè)很窄的溫度范圍74DNA的Tm值與下列的因素有關(guān)：1、DNA的均一性:均一性愈高的樣品，熔解過程的溫度范圍愈小。2、G-C的含量：

（G-C）%=（tm-69.3）x2.443、介質(zhì)離子強(qiáng)度：介質(zhì)離子強(qiáng)度較低，DNA的tm也低。DNA的Tm值與下列的因素有關(guān)：1、DNA的均一性:均一性75（二）復(fù)性DNA復(fù)性(renaturation)：變性DNA在適當(dāng)條件下，又可使兩條彼此分開的鏈重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一現(xiàn)象稱為復(fù)性。熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火(annealing)。（二）復(fù)性DNA復(fù)性(renaturation)：變性D76專題生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能課件77（三）分子雜交當(dāng)兩條不同來源的DNA鏈或DNA鏈與RNA鏈之間存在互補(bǔ)順序時(shí)，在復(fù)性時(shí)可發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)形成局部雙螺旋區(qū)，稱分子雜交

Southern雜交（Southernbolting）Northern雜交（Northernbolting）Western雜交（Westernbolting）（三）分子雜交當(dāng)兩條不同來源的DNA鏈或DNA鏈與RNA鏈之78分子雜交的原理示意圖分子雜交的原理示意圖79

核酸雜交技術(shù)是目前研究核酸結(jié)構(gòu)、功能常用手段之一。用來檢驗(yàn)核酸的缺失、插入；制備特定的探針（probe）通過雜交技術(shù)可進(jìn)行基因的檢測和定位研究。核酸雜交技術(shù)是目前研究核酸結(jié)構(gòu)、功能常用手段之一。80核酸雜交及其應(yīng)用示意圖Ⅰ.變性、復(fù)性和雜交粗細(xì)線分別代表不同DNA。

A是雜化雙鏈

Ⅱ.突變體的鑒別。B代表天然DNA；C是B的缺失突變體；虛線框內(nèi)是已缺失的部分；D是顯示從天然DNA鏈鼓出小泡Ⅲ.粗線代表探針粗線上的X表示放射性標(biāo)記核酸雜交及其應(yīng)用示意圖Ⅲ.粗線代表探針81Southern印跡法DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上與放射性標(biāo)記DNA探針雜交放射自顯影帶有DNA片段的凝膠凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern印跡法DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電82專題生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能課件83第四節(jié)核酸的制備、測定及研究技術(shù)一、核酸制備的一般原則

二、核酸的制備三、核酸的測定方法四、核酸的研究技術(shù)第四節(jié)核酸的制備、測定及研究技術(shù)一、核酸制備的一般原則84一、核酸制備的一般原則

因?yàn)檫z傳信息全部貯存在核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)中，故完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是保證核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)。一、核酸制備的一般原則因?yàn)檫z傳信息全部貯存在核酸85（一）核酸制備時(shí)應(yīng)遵循兩個(gè)原則：保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；排除其它分子的污染。

（一）核酸制備時(shí)應(yīng)遵循兩個(gè)原則：86（二）核酸的純度要求

①核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過高濃度的金屬離子；②其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時(shí)，應(yīng)去除RNA，反之亦然。（二）核酸的純度要求①核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的87（三）核酸制備的注意事項(xiàng)

①

盡量簡化操作步驟，縮短提取過程，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞；②減少化學(xué)物質(zhì)對(duì)核酸的降解(避免過酸、過堿對(duì)核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞)；③防止核酸的生物降解。細(xì)胞內(nèi)或外來的各種核酸酶水解核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。其中DNA酶需要二價(jià)陽離子Mg2+，Ca2+的激活，因此使用金屬離子螯合劑，如EDTA或檸檬酸鹽等基本上可以抑制DNA酶的活性。而RNA酶不但分布廣泛、極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸堿、不易失活，所以生物降解是RNA提取過程中的主要危害因素；

（三）核酸制備的注意事項(xiàng)①盡量簡化操作步驟，縮短提取過程88④

減少物理因素對(duì)核酸的降解，物理降解因素主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。

機(jī)械剪切力包括強(qiáng)力高速的溶液振蕩、攪拌，細(xì)胞突然置于低滲液中；DNA樣品的反復(fù)凍融等。這些操作細(xì)節(jié)在實(shí)驗(yàn)操作中應(yīng)加倍注意。機(jī)械剪切作用的主要危害對(duì)象是大分子量的線性DNA分子，如真核細(xì)胞的染色體DNA等。高溫，如長時(shí)間煮沸，除水沸騰帶來的剪切力外，高溫本身對(duì)核酸分子中的某些化合鍵也有破壞作用。核酸提取過程中常規(guī)操作溫度為0～4℃以降低核酸酶的活性從而減少對(duì)核酸的生物降解。④減少物理因素對(duì)核酸的降解，物理降解因素主要是機(jī)械剪切力，89I.材料準(zhǔn)備II.破碎細(xì)胞或包膜－內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)

V.核酸溶解在適量緩沖液或水中破碎細(xì)胞提取純化二、核酸的制備I.材料準(zhǔn)備破碎細(xì)胞提取純化二、核酸的制備90(一）核酸制備的一般方法和原理1、核酸酶的抑制和抑制劑

降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對(duì)核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當(dāng)然，幾個(gè)條件并用更好。對(duì)于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止機(jī)械張力拉斷則更重要。對(duì)于RNA，因分子較小，不易被機(jī)械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設(shè)法抑制RNase更重要。(一）核酸制備的一般方法和原理1、核酸酶的抑制和抑制劑91DNase抑制

①加入少量金屬離子螯合劑，如0.01mol/LEDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活。②去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。DNase抑制92RNase抑制

①操作要帶手套②所有器皿要嚴(yán)格消毒③試劑處理④低溫操作⑤在分離過程中要加入一定的RNase抑制劑RNase抑制932、核酸制備中常用的去垢劑

核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用：

1．溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂；

2．溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來；

3．對(duì)RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉2、核酸制備中常用的去垢劑943、核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑蛋白質(zhì)變性劑的作用：（1）使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。（2）使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。（3）某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制RNase活性和破裂細(xì)胞的作用。如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC3、核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑蛋白質(zhì)變性劑的作用：954、核酸提取的一般過程

（1）破碎細(xì)胞

微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。

動(dòng)物：液氮處理后用勻漿器破碎。

細(xì)胞器DNA：首先純化細(xì)胞器。

以上處理時(shí)均要同時(shí)加入核酸酶抑制劑4、核酸提取的一般過程

（1）破碎細(xì)胞96（2）抽提核酸除去雜質(zhì)

a．首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它成分分離；

b．使核酸與蛋白質(zhì)分離；

c．除去脂類；

d．多糖的除去。（2）抽提核酸除去雜質(zhì)

97（3）核酸的純化

根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點(diǎn)除去其它核酸污染,并除去提取過程中的系列試劑(鹽、有機(jī)溶劑等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。（3）核酸的純化

根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點(diǎn)除去其它核酸污染,98（4）核酸質(zhì)量的鑒定DNA純品:OD260/OD280=1.8RNA純品:OD260/OD280=2.0a.應(yīng)用OD260：b.瓊脂糖凝膠電泳（4）核酸質(zhì)量的鑒定DNA純品:OD260/OD28099（5）核酸樣品的保存

核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì)

溫度：

-70℃是長期保存的良好溫度，為一次性保存。

-20℃保存。

保存介質(zhì)：

TE緩沖溶液(最常用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0（5）核酸樣品的保存

核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì)100（二）注意事項(xiàng)

——材料準(zhǔn)備①最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融②組培細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過長，否則會(huì)造成DNA降解③含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集（二）注意事項(xiàng)

——材料準(zhǔn)101（二）注意事項(xiàng)

——細(xì)胞裂解①材料應(yīng)適量，過多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低②針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動(dòng)物組織－－勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞－－蛋白酶K細(xì)菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠（二）注意事項(xiàng)

——細(xì)胞102（二）注意事項(xiàng)

——核酸分離、純化①采用吸附材料吸附的方式分離DNA時(shí)，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系②采用有機(jī)（酚/氯仿）抽提時(shí)應(yīng)充分混勻，但動(dòng)作要輕柔③離心分離兩相時(shí)，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時(shí)間④針對(duì)不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法（二）注意事項(xiàng)

——核酸分離103（二）注意事項(xiàng)

——核酸沉淀、溶解①當(dāng)沉淀時(shí)間有限時(shí)，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會(huì)更充分②沉淀時(shí)加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀③沉淀后應(yīng)用70％的乙醇洗滌，以除去鹽離子等④晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥）⑤若長期儲(chǔ)存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解

（二）注意事項(xiàng)

——核酸沉淀、104（三）DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶切和PCR反應(yīng)。原因DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子對(duì)策重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70％乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）（三）DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶切105（三）DNA提取常見問題問題二：DNA降解

原因材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融對(duì)策盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時(shí)，可增加裂解液中螯合劑含量細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融（三）DNA提取常見問題問題二：DNA降解原因材料不新鮮或106（三）DNA提取常見問題問題三：DNA提取量少

原因?qū)嶒?yàn)材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時(shí)DNA丟失對(duì)策盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動(dòng)植物要?jiǎng)驖{研磨充分；細(xì)菌、酵母裂解前先用生物酶或機(jī)械方式破壁高溫裂解時(shí)，時(shí)間適當(dāng)延長（對(duì)于動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長沉淀時(shí)間洗滌時(shí)，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒（三）DNA提取常見問題問題三：DNA提取量少原因?qū)嶒?yàn)材料107三、核酸的測定方法三、核酸的測定方法108RNA濃度（ug/mL）=OD2600.022XLX稀釋倍數(shù)DNA濃度（ug/mL）=0.02XLOD260X稀釋倍數(shù)式中：OD260為260nm波長處光密度值；L為比色杯的光程，一般為1cm；0.022為每毫升溶液含1微克RNA的光密度；0.02為每毫升溶液內(nèi)含1微克DNA鈉鹽時(shí)的光密度。1、紫外吸收法RNA濃度（ug/mL）=OD2600.022XLX稀釋倍數(shù)1092、定糖法

RNA的測定：RNA分子中所含的核糖經(jīng)濃硫酸或濃鹽酸作用脫水生成糠醛，糠醛可與3，5-二羥甲苯（苔黑酚或地衣酚）反應(yīng)生成綠色化合物，該化合物可在670-680nm波長下進(jìn)行比色測定。

DNA的測定：DNA分子中的脫氧核糖在冰醋酸或濃硫酸存在下可與二苯胺反應(yīng)生成蘭色化合物，該化合物可在595-620nm波長下進(jìn)行比色測定。2、定糖法RNA的測定：RNA分子中所含的核糖經(jīng)濃硫酸1103、定磷法

RNA和DNA中都含有磷酸，可以進(jìn)行磷的測定。純的核酸中含磷量在9.5%左右，因此，測出核酸中的磷含量就可計(jì)算核酸的含量。測定時(shí)先將核酸用強(qiáng)酸消化成無機(jī)磷酸，后者與定磷試劑中的鉬酸反應(yīng)生成磷鉬酸，在經(jīng)過還原作用而生成藍(lán)色的復(fù)合物，最后在650-660nm進(jìn)行比色測定。3、定磷法RNA和DNA中都含有磷酸，可以進(jìn)行磷的測定。純111四．核酸研究技術(shù)

（一）核酸的沉降特性

溶液中的核酸在引力場中可以下沉。在超速離心機(jī)造成的強(qiáng)大的離心力場中，核酸分子下沉的速度大大加快。核酸的超速離心用于：四．核酸研究技術(shù)（一）核酸的沉降特性溶液中的核酸在1121、測定核酸的浮力密度；2、測定溶液中核酸的構(gòu)象，核酸經(jīng)染料—氯化銫密度梯度離心以后，在離心管里，沉降的速度由大到小依次為：超螺旋DNA、閉環(huán)質(zhì)粒DNA、開環(huán)及線型DNA，若樣品中含有蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)沉降速度最小。3、核酸的制備。1、測定核酸的浮力密度；113專題生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能課件114專題生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能課件115（二）核酸的凝膠電泳

凝膠電泳是當(dāng)前核酸研究中最常用的方法，有瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳。（二）核酸的凝膠電泳凝膠電泳是當(dāng)前核酸研究中最常用的方116專題生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能課件117水平板電泳水平板電泳118（三）核酸的序列測定（三）核酸的序列測定119DNA測序的基本戰(zhàn)略：

設(shè)法產(chǎn)生帶標(biāo)記的不同長度的成套DNA片段，各帶有標(biāo)記的片段起點(diǎn)相同、終點(diǎn)不同。通過PAGE電泳，能夠?qū)⑾嗖钜粋€(gè)核苷酸的DNA片段分開，放射自顯影后，根據(jù)長短排列，根據(jù)特定末端堿基的DNA片段就可讀出待測DNA的堿基序列。

DNA測序的基本戰(zhàn)略：

設(shè)法產(chǎn)生帶標(biāo)記的不同長度的成套DNA1201.Sanger雙脫氧鏈終止法(酶法測序）

DNA的合成總是從5′端向3′端進(jìn)行的。DNA的合成需要模板以及相應(yīng)的引物鏈。DNA的合成過程中，在合成的DNA鏈的3′末端，依據(jù)堿基配對(duì)的原則，通過生成新的3′,5′－磷酸二酯鍵，產(chǎn)生短的DNA鏈。具體測序工作中，平行進(jìn)行四組反應(yīng)，每組反應(yīng)均使用相同的模板，相同的引物以及四種脫氧核苷酸；并在四組反應(yīng)中各加入適量的四種之一的雙脫氧核苷酸，使其隨機(jī)地接入DNA鏈中，使鏈合成終止，產(chǎn)生相應(yīng)的四組具有特定長度的、不同長短的DNA鏈。這四組DNA鏈再經(jīng)過聚丙烯酸胺凝膠電泳按鏈的長短分離開，經(jīng)過放射自顯影顯示區(qū)帶，就可以直接讀出被測DNA的核苷酸序列,如下圖所示：1.Sanger雙脫氧鏈終止法(酶法測序）DNA的合121模板CCGGTAGCAACT3′5′引物5′GG3′酶反應(yīng)dATPdCTPdGTPdTTP+ddATPdATPdCTPdGTPdTTP+ddCTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddGTPdATPdCTPdGTPdTTP+ddTTPGGCCAGGCCATCGTTGAGGCGGCCGGCCATCGGCCATCGGGCCATCGTTGGGCCATGGCCATCGTGGCCATCGTTACGT電泳方向GGCCATCGTTGAGGCCATCGTTGGGCCATCGTTGGCCATCGTGGCCATCGGGCCATCGGCCATGGCCAGGCCGGC讀出模板互補(bǔ)序列AGTTGCTACC3′5′讀出模板序列TCAACGATGG5′3′酶法序列分析的原理模板CCGGTAGCAACT3′5′引物5′GG3′酶反應(yīng)d122專題生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能課件123DNA的測序儀示意圖computeranalysis成象透鏡聚焦透鏡高靈敏度相機(jī)旋光鏡/棱鏡組件樣品槽凝膠中DNA移動(dòng)方向輸入光學(xué)系統(tǒng)激光器DNA的測序儀示意圖computeranalysis成象透124專題生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能課件1252.化學(xué)法（Maxam和Gilbert）

這一方法的基本步驟為:(1)先將DNA的末端之一進(jìn)行標(biāo)記(通常為放射性同位素32P；(2)在多組互相獨(dú)立的化學(xué)反應(yīng)中分別進(jìn)行特定堿基的化學(xué)修飾；(3)在修飾堿基位置化學(xué)法斷開DNA鏈；(4)聚丙烯酰胺凝膠電泳將DNA鏈按長短分開；(5)根據(jù)放射自顯影顯示區(qū)帶，直接讀出DNA的核苷酸序列,如下圖所示：

2.化學(xué)法（Maxam和Gilbert）這一方法的基126DNA的化學(xué)測序示意圖

反應(yīng)試劑G反應(yīng)：硫酸二甲酯G+A反應(yīng)：甲酸T+C反應(yīng)：肼C反應(yīng)：NaCl+肼DNA的化學(xué)測序示意圖反應(yīng)試劑1271、G反應(yīng)：用硫酸二甲酯（DMS）使鳥嘌呤上的N7原子甲基化。甲基化的鳥嘌呤與脫氧戊糖之間的糖苷鍵在中性環(huán)境中加熱而斷裂，鳥嘌呤堿基脫落，多核苷酸骨架在鳥嘌呤處發(fā)生斷裂。2、G+A反應(yīng)：用甲酸使A和G嘌呤環(huán)上的N原子質(zhì)子化，從而使其糖苷鍵變得不穩(wěn)定，再用哌啶使嘌呤脫落。3、T+C反應(yīng)：用肼使T和C的嘧啶環(huán)斷裂，再用哌啶除去堿基。4、C反應(yīng)：當(dāng)有NaCl存在時(shí)，只有C與肼發(fā)生反應(yīng)，T不發(fā)生反應(yīng)。斷裂的C可用哌啶除去。1、G反應(yīng)：用硫酸二甲酯（DMS）使鳥嘌呤上的N7原子甲基化1283、測序技術(shù)進(jìn)展

同位素標(biāo)記到熒光標(biāo)記,平板電泳到毛細(xì)管電泳

同位素標(biāo)記平板電泳單色熒光標(biāo)記平板電泳多色熒光標(biāo)記毛細(xì)管電泳

ACGTACGT測序圖譜TA

TTGCATTGTC

TGCATTGT

CT3、測序技術(shù)進(jìn)展

同位素標(biāo)記到熒光標(biāo)記,平板電泳到毛細(xì)管電129PCR是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件，應(yīng)用DNA聚合酶反應(yīng)，特異性擴(kuò)增某一DNA片段的技術(shù)。體外程序化的DNA合成技術(shù)。（四）聚合酶鏈反應(yīng)（polymerasechainreaction,PCR）PCR是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件，應(yīng)用DNA聚合酶反應(yīng)，特異性1305Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA555555551、基本工作原理5Primer15Primer2Cycle2Cyc131Cycle3555555555555555525～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬倍以上。Cycle35555555555132專題生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能課件1332、PCR反應(yīng)體系引物（primer）酶（TaqDNApolymerase）dNTP（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）模板（template）Mg2+（magnesium）2、PCR反應(yīng)體系引物（primer）134PCR影響因素引物的長度、堿基組成和濃度、模板的濃度、鎂離子的濃度、退火溫度、延伸時(shí)間及循環(huán)周期數(shù)。PCR影響因素引物的長度、堿基組成和濃度、模板的濃度、鎂離子135⑴引物設(shè)計(jì)

對(duì)整個(gè)PCR擴(kuò)增體系，引物的設(shè)計(jì)占有十分重要的地位。PCR效率和特異性取決于兩個(gè)方面。一是引物與模板的特異結(jié)合，二是多聚酶對(duì)引物的有效延伸。引物設(shè)計(jì)的總原則就是提高擴(kuò)增的效率和特異性。⑴引物設(shè)計(jì)對(duì)整個(gè)PCR擴(kuò)增體系，引物的設(shè)計(jì)占有十分重要的136引物設(shè)計(jì)的一般原則：①引物長度以15-25為宜。引物過短時(shí)會(huì)使特異性降低，過長時(shí)則成本增加，且也會(huì)降低特異性。②引物堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象。引物G+C含量宜在45%-55%。③引物內(nèi)部不應(yīng)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，兩個(gè)引物之間尤其在3′末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在。引物設(shè)計(jì)的一般原則：①引物長度以15-25為宜。引物過短時(shí)會(huì)137④引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性。要求在引物設(shè)計(jì)時(shí)采用計(jì)算機(jī)進(jìn)行輔助檢索分析。⑤引物3′末端堿基：要求3′末端與模板DNA一定要配對(duì)。3′末端的末位堿基最好選T、C、G，而不選A。⑥引物5′末端堿基：沒有嚴(yán)格的限制，只要與模板DNA結(jié)合的引物長度足夠，其5′末端堿基可以不與模板DNA匹配而呈游離狀態(tài)。④引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性。要求在引物設(shè)計(jì)時(shí)采138引物濃度

一般為10-100pmol/L，引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)率，這兩者還由于競爭使用酶，dNTP和引物，這一切均會(huì)使DNA合成產(chǎn)率下降。引物濃度一般為10-100pmol/L，引物濃度偏高會(huì)引起139⑵模板的濃度靶序列：10-10拷貝基因組DNA：0.2-2μg質(zhì)粒DNA：20ng25⑵模板的濃度靶序列：10-10拷貝25140⑶鎂離子濃度

范圍1.5-8mmol/L。一般為1.5mmol/L。鎂離子過量能增加非特異性擴(kuò)增并影響產(chǎn)率。當(dāng)樣品中含有EDTA時(shí)適當(dāng)增加鎂離子濃度⑶鎂離子濃度范圍1.5-8mmol/L。一般為1.5mm141⑷退火溫度

由引物的堿基組成及長度決定，經(jīng)驗(yàn)公式為：4（G+C）+2（A+T）-5℃在Tm允許的范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可大大減少引物和模板之間的非特異結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。⑷退火溫度由引物的堿基組成及長度決定，經(jīng)驗(yàn)公式為：4（G142⑸延伸時(shí)間擴(kuò)增片段小于1000bp時(shí)延伸時(shí)間1min。擴(kuò)增片段大于1000bp時(shí)可適當(dāng)延長延伸時(shí)間。但太長的延伸時(shí)間易引起非特異性擴(kuò)增。⑸延伸時(shí)間擴(kuò)增片段小于1000bp時(shí)延伸時(shí)間1min。擴(kuò)增143⑹循環(huán)周期數(shù)

由模板DNA濃度決定，一般為25-30個(gè)周期為宜。模板拷貝數(shù)極低時(shí)，可擴(kuò)增40個(gè)周期，但循環(huán)次數(shù)增加，非特異性擴(kuò)增增加。⑹循環(huán)周期數(shù)由模板DNA濃度決定，一般為25-30個(gè)周期1443、PCR的基本反應(yīng)步驟變性94?C延伸72?C退火Tm-5?C3、PCR的基本反應(yīng)步驟變性延伸退火145PCR反應(yīng)條件的選擇變性溫度：一般情況下，選擇94℃30s可使各種復(fù)雜的DNA分子完全變性。過高溫度或高溫持續(xù)時(shí)間過長，可對(duì)TaqDNA聚合酶和dNTP造成損傷。退火溫度：Tm-5℃。退火時(shí)間設(shè)置為30s，足以使引物和模板之間完全結(jié)合。PCR反應(yīng)條件的選擇變性溫度：一般情況下，選擇94℃30s146PCR的延伸溫度：70-75℃之間，此時(shí)TaqDNA聚合酶具有最高活性。當(dāng)引物在16bp以下時(shí)，過高的延伸溫度不利于引物和模板結(jié)合。PCR的延伸時(shí)間：可根據(jù)待擴(kuò)增片段長度而定。PCR的循環(huán)數(shù)：主要取決于模板DNA的濃度。理論上說20-25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)最大值，實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到100%，因此不管模板濃度是多少，20-30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)越多非特異性產(chǎn)物的量也會(huì)增加。PCR的延伸溫度：70-75℃之間，此時(shí)TaqDNA聚合酶147PCR產(chǎn)物積累規(guī)律：在反應(yīng)初期，目的片段的增加呈指數(shù)形式。隨著目的DNA產(chǎn)物逐漸積累，而進(jìn)入相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，即平臺(tái)期。而用TaqDNA聚合酶則可進(jìn)行25次以上PCR循環(huán)，積累4×10目的基因的拷貝。8經(jīng)過30-35循環(huán)，可使長2kb的DNA從原來的1pg擴(kuò)增到0.5-1μg。PCR產(chǎn)物積累規(guī)律：在反應(yīng)初期，目的片段的增加呈指數(shù)形式。隨148專題生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能課件149（一）目的基因的克?。ǘ┗虻捏w外突變（三）基因組DNA分析（四）遺傳物質(zhì)的鑒定（五）遺傳病的診斷4、PCR的主要用途（一）目的基因的克隆4、PCR的主要用途150PCR相關(guān)技術(shù)：

①增效PCR（boosterPCR）

當(dāng)擴(kuò)增少于1000拷貝的模板DNA時(shí)會(huì)遇到兩個(gè)問題：一是形成引物二聚體，一是非特異擴(kuò)增，消耗了引物和酶，而特異擴(kuò)增片段產(chǎn)量降低。對(duì)于這種情況，可設(shè)置二步PCR，先用較低濃度的引物進(jìn)行初級(jí)PCR，此時(shí)由于引物少，形成引物二聚體的可能減少，但它并不影響靶序列的擴(kuò)增，只是由于引物少產(chǎn)量不高。約經(jīng)15～20個(gè)循環(huán)后補(bǔ)充產(chǎn)物量，以初級(jí)PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增，靶序列的產(chǎn)量將相應(yīng)增加。PCR相關(guān)技術(shù)：①增效PCR（boosterP151②巢式PCR（nestPCR）

此時(shí)也是進(jìn)行二步PCR，與上面不同的是，第二級(jí)PCR需另行設(shè)置反應(yīng)體系，并應(yīng)用另外的PCR引物，此時(shí)引物的位置位于初級(jí)PCR引物的內(nèi)側(cè)，用初級(jí)PCR產(chǎn)物做模板，進(jìn)行第二步PCR，這樣只有初級(jí)PCR中特異的擴(kuò)增片段才能被二級(jí)引物擴(kuò)增。除了達(dá)到增效PCR同樣的目的外，還提高了最終產(chǎn)物的特異性。②巢式PCR（nestPCR）152在同一PCR體系中加入數(shù)對(duì)PCR引物，如果這些引物的退火溫度相近，并且所覆蓋的區(qū)域不重疊，這樣的反應(yīng)體系可同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA片段。多重PCR常用來檢測同一基因的多個(gè)外顯子的缺失.③多重PCR

在同一PCR體系中加入數(shù)對(duì)PCR引物，如果這些引物的退火溫度153④RT-PCR

RT-PCR是以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用合成cDNA。使微量的mRNA（pg水平）迅速擴(kuò)增（達(dá)ng～ug水平），大大提高mRNA的檢出靈敏度。應(yīng)用于基因表達(dá)與調(diào)控的研究。④RT-PCR

RT-PCR是以mRNA為模板，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作154RT-PCRRT-PCR155RT-PCRcDNART-PCRcDNA156生物大分子的結(jié)構(gòu)與功能生物大分子的結(jié)構(gòu)157

第一章

核酸的結(jié)構(gòu)和功能

StructureandFunctionofNucleicAcid第一章核酸的結(jié)構(gòu)和功能158

目錄第一節(jié)核酸的種類、分布和化學(xué)組成第二節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)第三節(jié)核酸的理化性質(zhì)及其應(yīng)用第四節(jié)核酸的制備、測定及研究技術(shù)目錄第一節(jié)核酸的種類、分布和化學(xué)組成159核酸(nucleicacid)

核酸是一類重要的生物大分子，擔(dān)負(fù)著生命信息的儲(chǔ)存與傳遞。核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分子。核酸(nucleicacid)核酸是一類重要的生物160

核酸的發(fā)現(xiàn)和研究工作進(jìn)展1868年FridrichMiescher從膿細(xì)胞中提取“核素”

1944年Avery等人證實(shí)DNA是遺傳物質(zhì)1953年Watson和Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型1966年Nirenberg發(fā)現(xiàn)遺傳密碼1975年Temin和Baltimore發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)錄酶;Sanger建立DNA測序方法1981年T.Cech發(fā)現(xiàn)了核酶1985年Mullis發(fā)明PCR技術(shù)1990年美國啟動(dòng)人類基因組計(jì)劃(HGP)

1999年中國獲準(zhǔn)加入人類基因組計(jì)劃2001年美、英等國完成人類基因組計(jì)劃基本框架核酸的發(fā)現(xiàn)和研究工作進(jìn)展1868年FridrichMi161第一節(jié)核酸的種類、分布和化學(xué)組成一、核酸的生物學(xué)功能二、核酸的種類和分布三、核酸的化學(xué)組成第一節(jié)核酸的種類、分布和化學(xué)組成一、核酸的生物學(xué)功能162一、核酸的生物學(xué)功能orand肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)一、核酸的生物學(xué)功能orand肺炎球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)163蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA生物學(xué)的中心法則蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)制DNARNA生物學(xué)的中心法則164二、核酸的種類及分布(DNA)(RNA)脫氧核糖核酸

核糖核酸RNA主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，約占90%，少量存在于細(xì)胞核。RNA有三種：信使RNA（mRNA），占總RNA

5%。核糖體RNA

（rRNA），占總RNA

80%。轉(zhuǎn)移RNA（

tRNA），占總RNA

10-15%。真核98%核中（染色體中）核外線粒體（mDNA）葉綠體（ctDNA）原核擬核核外：質(zhì)粒（plasmid）病毒：DNA病毒二、核酸的種類及分布(DNA)(RNA)脫氧核糖核酸核165三、核酸的化學(xué)組成核酸核苷酸核苷磷酸堿基戊糖元素組成：CHONPA、G、C、U（RNA)A、G、C、T(DNA)核糖（RNA）脫氧核糖（DNA）三、核酸的化學(xué)組成核酸核苷酸核苷磷酸堿基戊糖元素組成：C166兩類核酸的基本化學(xué)組成DNARNA嘌呤堿腺嘌呤鳥嘌呤腺嘌呤鳥嘌呤嘧啶堿胞嘧啶胸腺嘧啶胞嘧啶尿嘧啶戊糖D-2-脫氧核糖D-核糖酸

磷酸

磷酸兩類核酸的基本化學(xué)組成DNARNA嘌呤堿167（一）戊糖組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為D-核糖。RiboseDeoxyribose（一）戊糖組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為D-2-脫氧168(二）堿基1.嘌呤（Purine）123456978腺嘌呤AdenineA鳥嘌呤guanineG(二）堿基1.嘌呤（Purine）123456978腺嘌呤1692.嘧啶（Pyrimidine）123456尿嘧啶uracilU胞嘧啶cytosineC胸腺嘧啶thymineTCH32.嘧啶（Pyrimidine）123456尿嘧啶U胞嘧啶170

稀有堿基除上述5種基本的堿基外，核酸中還有一些含量甚少的堿基，通常稱為稀有堿基。稀有堿基的種類很多，大部分是上述堿基的甲基化產(chǎn)物。N,N-二甲基腺嘌呤：m2666A稀有堿基除上述5種基本的堿基外，核酸中還有一些含量甚少的堿171（三）核苷核苷戊糖+堿基糖與堿基之間的C-N鍵，稱為C-N糖苷鍵1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)（三）核苷核苷戊糖+堿基1’2’3’4’5’(O172AdenosineGuanosineCytidineUridine核酸中的各種核苷AdenosineGuanosine173幾種稀有核苷假尿嘧啶核苷（）二氫尿嘧啶核苷（DHU）2-O-甲基腺苷(Am)CH3CH3H3CHH5HH′6A）（m2N,N-二甲基腺嘌呤66幾種稀有核苷假尿嘧啶核苷（）二氫尿嘧啶核苷2-O-甲174（四）核苷酸腺嘌呤核苷酸（AMP）

Adenosinemonophosphate脫氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）

Deoxyadenosinemonophosphate鳥嘌呤核苷酸（GMP）胞嘧啶核苷酸（CMP）尿嘧啶核苷酸（UMP）脫氧鳥嘌呤核苷酸（dGMP）脫氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）脫氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）OHH（四）核苷酸腺嘌呤核苷酸（AMP）脫氧腺嘌呤核苷酸（dA175PPPPPPPP腺嘌呤核苷酸（AMP）鳥嘌呤核苷酸（GMP）尿嘧啶核苷酸（UMP）胞嘧啶核苷酸（CMP）脫氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）脫氧鳥嘌呤核苷酸（dGMP）脫氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）脫氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）PPPPPPPP腺嘌呤核苷酸鳥嘌呤核苷酸尿嘧啶核苷酸胞嘧啶核176

（五）細(xì)胞內(nèi)游離核苷酸及其衍生物多磷酸核苷酸環(huán)化核苷酸輔酶類核苷酸（五）細(xì)胞內(nèi)游離核苷酸及其衍生物多磷酸核苷酸177AMPADPATP

1.多磷酸核苷酸AMPADPATP1.多磷酸核苷酸1782.環(huán)化核苷酸OPOOHOA(G)OOOHCH2HHHHcAMP(cGMP)的結(jié)構(gòu)

2.環(huán)化核苷酸OPOOHOA(G)OOOHCH2HHHHc1793.輔酶類核苷酸NADP+NAD+3.輔酶類核苷酸NADP+NAD+180VitB2FMNAMPFADVitB2FMNAMPFAD181第二節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)

一、DNA的分子結(jié)構(gòu)二、RNA的分子結(jié)構(gòu)第二節(jié)核酸的分子結(jié)構(gòu)

一、DNA的分子結(jié)構(gòu)182一、DNA的分子結(jié)構(gòu)（一）DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)（二）DNA堿基組成的Chargaff規(guī)則（三）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)（四）DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)一、DNA的分子結(jié)構(gòu)（一）DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)183（一）DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)

DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)是由數(shù)量極其龐大的四種脫氧核苷酸，dAMP,dGMP,dCMP,dTMP通過3′5′-磷酸二酯鍵連接起來的線形或環(huán)形多核苷酸鏈。

DNA分子中核苷酸的排列順序叫做DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，簡稱為堿基序列。一級(jí)結(jié)構(gòu)的走向規(guī)定為5′→3′。不同的DNA分子具有不同的核苷酸排列順序，因此攜帶有不同的遺傳信息（一）DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)是由數(shù)量極其龐大的18455333-5磷酸二酯鍵核酸分子中核苷酸之間的共價(jià)鍵55333-5磷酸二酯鍵核酸分子中核苷酸之185一級(jí)結(jié)構(gòu)表示法：結(jié)構(gòu)式，線條式，字母式5′3′結(jié)構(gòu)式5pApTpCpGpCpT-OH3

字母式ATP5PCPGPCPTPOH3線條式一級(jí)結(jié)構(gòu)表示法：結(jié)構(gòu)式，線條式，字母式5′3′結(jié)構(gòu)式5186（二）DNA堿基組成的Chargaff規(guī)則Chargaff首先注意到DNA堿基組成的某些規(guī)律性，在１９５０年總結(jié)出DNA堿基組成的規(guī)律：1.同一生物的不同組織的DNA堿基組成相同；2.同一種生物DNA堿基組成不隨生物體的年齡、營養(yǎng)狀態(tài)或者環(huán)境變化而改變；3.幾乎所有的DNA，無論種屬來源如何，其腺嘌呤摩爾含量與胸腺嘧啶摩爾含量相