實驗六-石蠟切片法1課件

實驗六石蠟切片法——

包埋、切片和貼片石蠟切片法石蠟切片法是顯微制片技術中最常用的一種方法，除了藻類、菌類、木材和骨骼外一般的材料均可以使用，既可制成較薄的切片，使材料各部分都清晰可見，同時也可制成連續(xù)切片，觀察材料的動態(tài)發(fā)生及層次，所以，它在顯微制片技術中占有非常重要的地位，必須掌握，同時也是進行透射電鏡觀察超薄切片的基礎。石蠟切片的主要過程取材——固定保存——沖洗——脫水————透明——石蠟透入——包埋——修塊——切片——貼片——復水——染色——脫水——封藏——觀察保存（一）包埋（二）修塊、切片、貼片（三）染色、封藏一、實驗目的掌握動植物材料石蠟切片的方法及要求；熟練掌握石蠟切片的關鍵步驟——包埋。學習旋轉切片機的使用方法，熟練掌握石蠟切片的關鍵步驟——切片。三、實驗步驟（1）取材（根據(jù)制片目的和要求而定，代表性）；殺死和固定：小鼠利用引頸致死法迅速殺死，取其肝臟，用生理鹽水沖洗干凈后分割成0.5~1cm×0.5~1cm×0.3cm小塊投入Bouin’s固定液中進行固定；植物葉片采集后分割成1~1.5c㎡小塊后投入FAA固定液中進行固定；沖洗小鼠肝臟經(jīng)苦味酸固定液固定后必須使用70%或50%AL進行沖洗；植物葉片經(jīng)FAA固定液后使用流水進行沖洗脫水（常用脫水劑：乙醇；脫水原則：低濃度到高濃度）（目的？）50%70%80%95%100%AL100%AL脫水時間：視材料的性質、大小而定小鼠肝臟：在各級AL中停留0.5-1h；植物葉片：在各級AL中停留2-4h；注意：脫水應徹底，否則與二甲苯混合后混濁，必須倒回重脫水；如需過夜，則停留在70%酒精中。三、實驗步驟（2）透明（置換，作用？）常用透明劑：二甲苯；透明原則：低濃度到高濃度（?二甲苯+?100%酒精二甲苯二甲苯）透明時間：小鼠肝臟每級停留0.5-1h；植物葉片每級停留1-3h。脫水不凈，用二甲苯透明后，將發(fā)生下列不良后果：（1）材料：材料內(nèi)仍留有微量水分，二甲苯就進不去，因此石蠟也不能透入，切片后將在蠟片上出現(xiàn)空洞，影響結果。（2）切片：切片內(nèi)留有微量水分，在封片以后，就會發(fā)生乳白色的云霧狀，在顯微鏡下觀察時，可見許多密集水珠把組織掩蓋，切片就作廢了。浸蠟：要點：使石蠟完全浸入細胞的每個部分，同時要使石蠟緊密地貼在細胞壁的內(nèi)外，成為不可分離的狀態(tài)；原則：低溫高溫、低濃度高濃度三、實驗步驟（3）包埋：就是將已經(jīng)浸好蠟的材料連用熔化的石蠟一起倒入定形的紙盒中，使之凝固。包埋前折紙盒包埋時將紙盒放在已經(jīng)加熱的溫臺上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入包埋用的紙盒中，取出存放材料的蠟杯，迅速且輕輕地用溫鑷子夾取材料平放于紙盒底部（注意切面朝下放置），再用溫鑷子輕輕撥動材料，使之排列整齊。然后輕輕將紙盒兩側的把手提起，慢慢平放于水盆的水面上，待蠟盒內(nèi)的石蠟表面凝固，即可將紙盒向一側傾斜，使冷水從一邊浸入紙盒，并立即使它沉如水中，使盒中包埋塊迅速凝固，待石蠟完全凝固（約30min）后即可取出備用。包埋過程中易出現(xiàn)的問題及解決辦法問題：包埋后的石蠟塊應為均勻半透明狀，有時出現(xiàn)白色渾濁結晶（像雪花一樣）部分，這樣在切片時就有妨礙，不易切出薄的切片。原因：①組織內(nèi)部或石蠟中混有透明劑；②脫水不干凈；③石蠟本身品質不良；④組織塊移入紙盒時動作太慢，周圍的石蠟已成凝固狀態(tài)；⑤冷卻用水溫度不夠低，石蠟凝固太慢。解決辦法：屬于前三個原因者應在包埋之前就須注意；屬于后二個原因者，可將包埋塊再投入Ⅲ蠟中熔化后重新包埋，但必須注意熔化包埋過的石蠟塊的時間不宜過久。三、實驗步驟（4）修塊：削去表面的包埋劑，露出組織，然后在組織的四周以和水平面成45度的角度削去包埋劑，修成金字塔形，頂面修成梯形或長方形，每邊的長度為0.2mm～0.3mm；修塊的目的：1）使切成的蠟帶成一直線，不發(fā)生彎曲；2）每個切片組織的距離接近，便于鏡檢或作連續(xù)切片。要求：組織塊必須①上下平行，②但左右的蠟、上下的蠟不要太多或太少；③正方形或長方形，可各切去一角，以便識別。三、實驗步驟（5）切片：用鋒利的刀片，將包埋好的材料切成所需要的厚度的薄片，一般用專門的切片機和切片刀。切片機的結構：控制切片厚薄的微動裝置；供裝切片刀的夾刀部分；供裝置組織塊的夾物部分。切片機的類型根據(jù)結構分為：滑行式切片機：夾刀部分是滑動的，而夾物部分是固定的，可上下升降；旋轉式切片機：夾物部分式上下移動，前后推進，而夾刀部分則固定不變。三、實驗步驟（6）切片的步驟：將已經(jīng)修整好的蠟塊裝在樣品固定器上，并固定好；將切片刀安裝在切片機的刀架上，調(diào)節(jié)切片刀的角度為15°左右，并固定好；調(diào)節(jié)切片的厚度：棉花葉片：8-10um；小鼠肝臟：6-9um；調(diào)節(jié)蠟塊與刀口的距離：打開刀架固定鈕，推動刀架，使切片刀刃貼近蠟塊表面（從側面觀察），再固定刀架；切片：打開停刀軋，開始切片，右手握住手輪柄，順時針方向搖動，每搖動一圈就切下一片，切下的蠟片粘在刀口上，待第二片切下時就連在一起，連續(xù)搖轉手輪就可以講切下的蠟片練成一條蠟帶。待蠟帶有一定長度，左手執(zhí)毛筆，將蠟帶抬起，邊搖邊移動蠟帶。待蠟帶長至20-30cm，停止搖動，用右手執(zhí)另一支毛筆順刀口方向拔下蠟帶，平放于白紙上，靠刀面較光滑面向下，較皺褶的一面向上。切片注意事項：操作時一定要小心，隨時注意關好停刀軋，以防刀夾突然下降傷及手指，在換蠟塊時，必須先關停刀軋，才能取下蠟塊；切片時不要對著蠟帶講話，要防風，以免將蠟帶吹散；根據(jù)材料要求，注意調(diào)節(jié)合適的切片厚度；切片完畢后，將刀取下擦凈，放入盒內(nèi)保存，同時用毛筆清潔切片機各部分，將刀架、夾物器等退回原處固定。切片過程中出現(xiàn)問題的一般原因和補救辦法：一、蠟帶彎曲不直

原因：1.蠟塊上下兩邊不平行，或與刀口不平行；2.刀口鋒利不一，局部產(chǎn)生差異；3.材料未居蠟塊正中央。補救辦法：1.取下臺木，將蠟塊兩邊修平，調(diào)節(jié)夾物部，使兩者平行。2.移動刀片，改用新刀口。3.用刀片切去部分石蠟，使材料居中。二、切片分離，不能連成帶狀或卷起成圓筒狀。原因：1.室溫過低。2.石蠟過硬。3.材料邊緣留蠟太少。4.刀的角度不合適。補救辦法：

1.在切片機上安一盞電燈加溫。2.用手指在蠟塊面上磨擦。3.重新包埋。4.矯正刀的角度。三、切片粘附于刀片上，皺褶在一起。原因：1.室溫過高。2.石蠟過軟。3.刀口上留有一層石蠟。4.刀口鈍。補救辦法：

1.在早晚涼爽時切。2.將蠟塊投入涼水中稍浸。3.用二甲苯拭去石蠟。4.磨刀或移動刀口。切片過程中出現(xiàn)問題的一般原因和補救辦法：

四、切片縱裂橫波。厚薄不均勻。原因：1.刀口有缺口；2.石蠟塊中有顆粒及雜質；3.刀口有細纖絲或碎屑；4.刀和臺木未夾緊；5.組織塊太硬。補救辦法：

1.可移動刀片；2.將顆粒挑去；3.清潔刀口；4.旋緊螺旋；5.在水中浸泡。五、材料出現(xiàn)裂隙、破碎或脫落。原因：1.脫水不干凈；2.透明劑殘留；3.石蠟透入時溫度過高；4.材料太硬或太粗。補救辦法：

1.無法補救；2.重新包埋；3.無法補救；如由于脫水劑，透明劑引起的可改用正丁醇，松油醇等進行脫水和透明；4.軟化組織。三、實驗步驟（7）貼片：要求：1）貼附牢固，在染色時不易脫落；2）使皺褶的蠟片伸展平整步驟：1）在載玻片上涂上蛋白黏貼劑；2）將已經(jīng)涂好蛋白黏貼劑的載玻片放在紙面上，并滴加數(shù)滴蒸餾水；3）用刀片將蠟帶切成許多小段，每段的長度應依照蓋玻片的長度為準，一般應比蓋玻片短約1/5-2/5，因蠟片加溫后要伸長1/5-2/5，在分段時應從蠟片的交界處分開；4）用毛筆將蠟片輕輕移到載玻片上（必須注意蠟片的光面朝下）；5）將載玻片平行地放置在酒精燈的上方，微熱，使切片伸展攤平，如發(fā)現(xiàn)散開，請重新用鑷子排列整齊；6）晾干待用。四、實驗結果包埋后的石蠟快應為均勻的半透明狀，蠟塊中沒有氣泡。包埋材料擺放的位置是否符合要求？修塊效果：每個蠟邊與材料平行，蠟邊的上下左右搖平行。切片效果：得到厚薄均勻的蠟帶，蠟帶無破損。展片效果：展片后蠟帶或蠟片平整，無氣泡、粘附牢固，蠟帶略呈透明狀，后續(xù)制片不易脫落。五、作業(yè)實驗完畢，每人交包埋塊一個，在紙盒上寫上材料名稱及自己的姓名和日期；實驗完畢，每人交玻片兩張，用鉛筆在載玻片上寫上材料名稱及自己的姓名和日期；實驗報告（姓名和日期）?？辔端嵋海úㄒ鹗弦海┘滓海?％鉻酸50ml10％醋酸20ml乙液：甲醛25ml

苦味酸飽和水溶液75ml是常用的良好固定液，廣泛應用于一般動物組織、昆蟲組織、無脊椎動物的卵和幼蟲，以及胚胎學材料的固定。也適用于裸子植物的雌配子體和被子植物的胚囊的固定。此液穿透迅速而均勻，使組織收縮少，不使組織變硬變脆，著色良好。一般動物組織固定12—24h，小塊組織數(shù)小時即可。固定后直接入70％酒精中洗去黃色，但留一點黃色對染色并無妨礙。植物材料的固定時間為12—48h。甲醛－醋酸－