細胞培養(yǎng)的基本方法

關于細胞培養(yǎng)的基本方法第1頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五第一節(jié)無菌操作技術第二節(jié)培養(yǎng)細胞的觀察第三節(jié)細胞培養(yǎng)中常用的染色方法第四節(jié)細胞培養(yǎng)的污染和檢測主要內容第2頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五教學目的和要求重點和難點：掌握細胞培養(yǎng)中無菌操作技術及操作過程中需要注意哪些問題；預防污染是無菌操作的關鍵。第3頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五

由于體外培養(yǎng)的細胞沒有抗感染能力，因此防污染是決定培養(yǎng)成功的首要條件。即便使用設備完善的實驗室，若實驗者粗心大意，技術操作不規(guī)范,也會導致污染。一切操作需要保證無菌和有條不紊。組織培養(yǎng)中最重要的，也是最基本的要求就是各項操作均應從無毒害、無污染的培養(yǎng)環(huán)境來考慮。培養(yǎng)基、器皿材料、接種工具、操作環(huán)境、培養(yǎng)室和超凈工作臺等各個環(huán)節(jié)都應注意。第一節(jié)無菌操作技術第4頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五一、實驗器具等的洗滌和材料的準備

在開始實驗前要制定好實驗計劃和操作程序。有關數(shù)據的計算要事先做好。根據實驗要求，準備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內，然后開始消毒。這可以避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。

第5頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五培養(yǎng)玻璃器具的洗滌是非常重要的。用完后應洗凈，再用蒸餾水沖一遍，烘干；用合適的方法滅菌。第6頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五二、培養(yǎng)室和超凈臺的消毒（一）、無菌與有菌范疇

滅菌工作是極其重要的。對于初學者來說，首先應建立有菌和無菌的概念。有菌的范疇：凡是暴露在空氣中的物體，至少其表面都是有菌的。如植物表面、超凈工作臺的臺面，未處理的工具、手等。第7頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五無菌的范疇：物理或化學處理的物體（工具、器皿、培養(yǎng)基等）健康的動植物不與外部表面接觸的組織內部可能是無菌的（有時也有內生菌，但不會影響培養(yǎng)，也不會污染）經過滅菌的物品有可能再次染菌第8頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五（二）無菌操作室

工作前后室內清掃、拖地，以防菌在空氣中流動，特別真菌孢子。使用前，室內及超凈工作臺紫外燈殺菌30分鐘，超凈工作臺酒精（75%）殺菌，工作中一直吹風。第9頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五三、洗手和著裝

原則上和外科手術相同。平時僅做觀察不做培養(yǎng)操作時，可穿著細胞培養(yǎng)室內紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內，應著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消毒手。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進入培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。第10頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五第11頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五第12頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五第13頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五

無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺面消毒時切勿將培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線，消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果?！┎僮饔镁呷缫埔浩鳌U液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后置于臺內同時紫外線消毒。第14頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五四、無菌培養(yǎng)操作1、首先點燃酒精燈，所有操作均在火焰近處并經過燒灼進行；冷卻后才能使用；2、操作時，打開試管蓋，要進行燒灼滅菌，但是時間要短。在火焰上燒瓶口。保證容器傾斜。3、進行操作時動作要準確敏捷，但是不宜太快，防止空氣流動，增加污染的機會；第15頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五4、超凈工作臺上的器具和用品要擺放合理；5、操作時器具不能觸及瓶口以防止污染；6、不要說話、咳嗽、打噴嚏等，頭發(fā)、首飾等注意；7、吸管、注射器等專管專用。第16頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五

接種時在近火焰處打開瓶口，使瓶傾斜，以免空氣中微生物落入瓶中正

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第17頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五整個接種操作應在近火焰處進行，且動作要迅速正

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第18頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五防止操作帶來的污染

接種過程中盡可能達到懸空要求正

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第19頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五正

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接種時不得用手接觸瓶蓋內壁或瓶口第20頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五瓶蓋朝上放，接種完畢后立即蓋好瓶口正

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第21頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五接種完一瓶用火燒用具以防止交叉污染產生

第22頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五種子和分生組織：培養(yǎng)時通常將其貼放在培養(yǎng)基表面，而不是插到培養(yǎng)基內部，以免供氧不足正

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第23頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五接種莖段：注意形態(tài)學下端插入培養(yǎng)基內，而形態(tài)學上端露于空氣中

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第24頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五

污染材料應及時清除，高壓滅菌。菌有兩種，細菌成粘液狀，真菌有菌絲。特別真菌危害極大。第25頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五五、使用超凈臺注意事項1、超凈臺安裝在清潔無塵的房間內，最好為隔離的無菌間，以免塵土過多易使濾器阻塞，降低凈化效果，縮短使用壽命；第26頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五第27頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五2、長期未使用或新安裝的超凈臺使用前必須對工作臺和周圍環(huán)境進行清掃，再采用化學滅菌或紫外線滅菌法進行滅菌處理；第28頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五3、使用前用75％酒精擦洗臺面，并提前用紫外線滅菌30min。關閉紫外燈后應啟動鼓風機運轉幾分鐘后再進行培養(yǎng)操作；第29頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五4、凈化工作區(qū)不應存放不必要的物品，以保持潔凈氣流型不受干擾；5、用后工作臺要用75％酒精擦洗，以備后面工作人員使用；6、經常注意工作區(qū)上方微壓表的指示，及時更換濾器。第30頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五六、培養(yǎng)細胞的取材取材組織用培養(yǎng)液浸泡，4度運送，24h內盡快培養(yǎng)。取材無菌操作，避免對組織的機械損傷，盡量去除脂肪、神經、結締、壞死組織，污染組織可用青鏈霉素和制霉菌素漂洗。原代取材同時保留組織學和電鏡標本，對供體來源、部位及一般情況做記錄。欲從組織中獲得大量生長良好的細胞，須將組織分散開，使細胞解離出來。常用方法有機械法和化學法。第31頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五第二節(jié)培養(yǎng)細胞的觀察第32頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五組織塊培養(yǎng)法將組織剪成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶，24小時貼壁后，細胞就從組織周圍長出。培養(yǎng)瓶底預先涂以膠原薄層，以利上皮細胞的生長。如需做組織染色或電鏡檢查，可將組織可放入小蓋玻片上后再放進培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。換液需輕巧，以免組織塊漂起，細胞死亡第33頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五消化培養(yǎng)法采用前述的組織消化分散法。將妨礙細胞生長的細胞間質去除，使細胞分散，形成懸液，按不同濃度接種培養(yǎng)瓶培養(yǎng)。第34頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五密度抑制（Densityinhibition）或接觸抑制（Ccontactinhibition）

1958年Abercrombie等學者提出的一種現(xiàn)象，培養(yǎng)細胞再生長過程中多發(fā)生分裂增殖，細胞移動而相互靠近，這時某些細胞可移向其他方向，保證細胞不會重疊，一但接觸，這種活動即可停止。

所謂接觸抑制實際使細胞匯合形成單層時，細胞變得擁擠，與培養(yǎng)液接觸的表面區(qū)域也相應減少，營養(yǎng)成分消耗，其分裂也將停止。第35頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五培養(yǎng)細胞的生長過程1）原代（初代）培養(yǎng)期：從機體取下組織培養(yǎng)到第一次傳代，此代細胞保持異質性，細胞種類較多，接近原組織細胞種類。維持時間，因細胞種類不同，一般1-4周。第36頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五2）傳代期培養(yǎng)：初代培養(yǎng)的細胞生長到一定程度，即可連接傳代，使其連續(xù)生長。一般正常二倍體細胞，不加附加條件，可傳代30-50代，此時可發(fā)生染色體丟失、突變、細胞增殖變慢、停止分裂，進入衰退期，我們稱之有限細胞系。這一轉折點有人稱之危象臨界點（crisis）有些細胞的少數(shù)后代，或通過人工條件轉化的細胞可通過這一期，獲得持久的增殖傳代能力，我們稱細胞系，或無限細胞系，即一般通稱的細胞系。第37頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五（3）衰退期：傳代細胞到達一定代數(shù)，即發(fā)生增殖緩慢，逐漸停止，進而發(fā)生衰退、死亡，多數(shù)傳代細胞（或叫有限細胞系），不能通過所謂的“crisis（危象臨界點），導致最終死亡，這一現(xiàn)象可能說明生物學衰老的細胞學基礎。

人胚胎成纖維細胞可以進行60代增殖，而80歲老人的肺成纖維細胞僅傳代了16代后便死亡。表皮細胞壽命4-10天；紅細胞3周-3個月，白細胞5-7天，神經細胞數(shù)年或更多。第38頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五第39頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五第40頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五第41頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五第42頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五第43頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五

實體顯微鏡（解剖鏡）倒置顯微鏡生物顯微鏡照相設備

對培養(yǎng)材料進行細胞學鑒定和研究2、顯微鏡觀察第44頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五第45頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五3、細胞計數(shù)法（cellcounting）用血細胞計數(shù)板計數(shù)細胞懸液中的細胞數(shù)目，以測定細胞增殖和調整細胞濃度的一種方法。第46頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五4、細胞生長曲線（cellgrowthcurve）是觀察細胞在一代生存期內的增生過程的重要指標。

橫坐標為培養(yǎng)時間

縱坐標為細胞密度注意：只有具備自身穩(wěn)定生長特性的細胞才適合觀察。第47頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五細胞生長曲線細胞數(shù)量生長天數(shù)緩慢生長期對數(shù)生長期平衡期第48頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五

（1）遲緩期（或延遲期）當細胞接種到培養(yǎng)瓶后，細胞逐漸貼附于瓶底，并恢復貼壁形狀，代謝開始旺盛，出現(xiàn)細胞分裂及增殖，但生長緩慢。

（2）對數(shù)生長期：此期幾乎所有的細胞都在進行分裂，細胞數(shù)目迅速增長。其細胞倍增時間（TD）等于細胞周期時間（TC）長度。這一期常用細胞倍增時間及細胞分裂指數(shù)來判定。（3）平衡期（平坦期）這期細胞數(shù)目雖然在增加，但其增加速度在減慢，直至細胞數(shù)量不再增加，處于平衡狀態(tài)。

第49頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五5、細胞分裂指數(shù)指分裂期細胞在全部細胞中所占的百分率，用以表示細胞的增殖旺盛程度。一般要計算和觀察1000個細胞中的細胞分裂相數(shù)。第50頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五6、細胞貼壁率細胞貼壁率又稱接種存活率，用于觀察貼壁附著生長細胞，主要反映細胞的生存能力和部分底物材料的相容性。第51頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五7、細胞周期

細胞周期：一個細胞的分裂生長周期時間。

倍增時間：指在對數(shù)生長期細胞數(shù)量增加一倍所用的時間，這一時間內一般有些細胞參與分裂有些細胞可能不參與分裂，有些可能分裂兩次或數(shù)次，但細胞總數(shù)量增加1倍。第52頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五第四節(jié)細胞培養(yǎng)中常用的染色方法一、活體染色體外活體染色就是在體外條件下用某種染色劑（即活體染料）對活的組織或細胞進行染色，而不影響活細胞的生命活動的一種方法。利用這種方法，可以對培養(yǎng)物進行染色觀察，染色后的培養(yǎng)物還可以繼續(xù)進行培養(yǎng)。第53頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五1、活體染料的類別

堿性染料酸性染料中性紅，甲基蘭剛果紅，臺盼藍第54頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五2、染料排除檢測法第55頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五第四節(jié)細胞培養(yǎng)的污染與檢測污染是組織培養(yǎng)的大敵，避免污染的發(fā)生。污染一般包括微生物污染（細菌、真菌、支原體和病毒）、化學物（影響細胞生存的非細胞所需的化學成分）、細胞（非同種的其他細胞）。第56頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五一、污染途徑A.空氣措施：減少空氣流動B.器材措施：消毒徹底，洗刷干凈，定期消毒第57頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五C.操作措施：嚴格進行無菌操作，避免交叉感染D.血清E.組織樣本很難避免第58頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五二、污染對培養(yǎng)細胞的影響及檢測影響：細胞生長緩慢、分裂相減少、細胞變得粗糙、細胞輪廓增強、重者細胞停止增殖、分裂相消失、細胞質中出現(xiàn)大量堆積物、細胞變圓或崩潰從瓶壁脫落。第59頁，共67頁，2022年，5月20日，23點23分，星期五A.細菌的污染及檢測取懸液培養(yǎng)，培養(yǎng)液顏色變黃，混濁。B.真菌的