丙種球蛋白的電泳制備課件

丙種球蛋白的電泳制備目錄基本資料丙種球蛋白的制備方法丙種球蛋白的操作步驟一、基本資料簡介：中文簡稱：“丙球”英文名稱：γ-globulin、gammaglobulin【別名】免疫血清球蛋白，普通免疫球蛋白，人血丙種球蛋白，丙種球蛋白，靜脈注射用人免疫球蛋白（pH4）性狀：凍干制劑應為白色或灰白色的疏松體，液體制劑和凍干制劑溶解后，溶液應為接近無色或淡黃色的澄明液體，微帶乳光。但不應含有異物或搖不散的沉淀。注：由于人血中的免疫球蛋白大多數(shù)為丙種球蛋白（γ-球蛋白），有時丙種球蛋白也被混稱為“免疫球蛋白”(immunoglobulin)。藥理作用

注射丙種球蛋白是一種被動免疫療法。它是把免疫球蛋白內含有的大量抗體輸給受者，使之從低或無免疫狀態(tài)很快達到暫時免疫保護狀態(tài)。由于抗體與抗原相互作用起到直接中和毒素與殺死細菌和病毒。因此免疫球蛋白制品對預防細菌、病毒性感染有一定的作用。

適應癥丙種球蛋白是血液中一種蛋白質，它通常來源于許多人獻的血液，常被用來：防止和治療感染，對慢性疲勞癥有顯著的改善作用；適用于預防傳染性肝炎，麻疹等病毒性疾病感染；治療先生性丙種球蛋白缺乏癥；可提高對某些嚴重細菌性和病毒性疾病感染的療效。實驗方法分離膠的制備濃縮膠的制備待分離樣品的準備加樣電泳脫色染色實訓原理

圓盤電泳是帶電粒子(膠體顆粒、離子等)在電場的作用下在特定的介質中向與其電荷性質相反的電極方向定向泳動的現(xiàn)象.廣泛應用于生物大分子的分離和鑒定。它是利用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在催化劑的作用下聚合成大分子的凝膠物。

它同時兼有分子篩和電泳效應。當樣品通過凝膠進行電泳時，便可以根據(jù)其樣品中各分子的電荷和分子量的不同而泳動出不同的區(qū)帶。

由于聚丙烯酰胺凝膠化學性質較瓊脂穩(wěn)定，很少帶有側基，在電泳過程中，吸附作用與電滲作用均小，所以該技術的分辨率均高于其它瓊脂電泳技術實訓器材與試劑試劑：

豬血清樣品、分離膠緩沖液、凝膠溶液、10%過硫酸銨（AP）、電極緩沖液、固定液、染色液、脫色液

儀器：圓盤電泳槽、電泳儀、電泳玻璃管、滴管、燒杯、刻度吸管、加樣槍、注射器等。

三、操作步驟1、裝管取已準備好的玻管，從一端量至7cm處，用筆劃線。起始端用膠布包封好后，插入橡皮塞中，垂直放好。2、配膠

分離膠的制備：（1）將清潔、無破碎干燥的小玻管一端（挑選一下比較平的那頭），用膠布貼封后，朝下垂直放入有機玻璃凝膠玻管架的孔中，并在小玻管的7.0cm處作一記號。（2）、用自動取液器吸取上述配好的分離凝膠貯液沿著小玻管內壁小心準確加入7.0cm高。（3）、凝膠溶液加畢后，隨即吸取蒸餾水，加至管中的凝膠表面，使其表面覆蓋一水層（水封，1.0cm高）。在灌膠和封水的過程中，操作要輕，以避免產(chǎn)生氣泡。（4）、將加注好的凝膠管于室溫下靜置，以進行聚合反應，在正常情況下大約30-60分鐘后，待界面出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象時，表明膠已聚合完畢，即可加濃縮膠。3、灌膠及封膠將混勻好的膠液，用滴管緩慢注入玻璃管，當加到液面距離電泳玻璃管上口1cm時停止。注意在加的過程中不要混進空氣，隨即用注射器經(jīng)針頭沿凝膠管壁緩慢加入蒸餾水至管滿，防止氧化，室溫下聚合15-20min。4、制樣取血清30ul，加0.025%溴酚藍5ul，20%蔗糖65ul，混勻即可。濃縮膠的制備：（1）、輕輕倒掉分離膠玻管上端的液體，并用吸水紙吸去未倒凈的液體（但不能觸及膠面）然后先小心用濃縮膠貯液洗滌凝膠表面1-2次，再小心加入該濃縮膠貯液1.5cm高。（2）、隨后同樣加1.0cm高的蒸餾水層覆蓋膠表面。大約也在20-40分鐘后，待濃縮膠出現(xiàn)乳白色時，表明膠已聚合完畢。（3）、加樣：取一根上次做好的凝膠小玻管用吸水紙輕輕吸去濃縮膠表面上的水層，然后用微量注射器加10ul測試樣品溶液。（4）、裝置凝膠管：將加好樣品的凝膠管的加樣端（上端），插入上電泳槽孔中，然后將已插滿凝膠管的上電泳槽放入加有電極溶液的下電泳槽內。此時凝膠玻管下端管口易產(chǎn)生氣泡，可通過輕輕擺動凝膠玻管以去除氣泡，插入上電泳槽的玻管上端，用滴管輕輕滴滿電極溶液，以免產(chǎn)生氣泡，最后將上電泳槽裝滿電極液。（5）、接通電源：接通電泳槽的兩端電極與電泳儀的電源，內槽裝陰極緩沖液,外槽用陽極緩沖液恒壓電泳,先40V約1.5h,當樣品進入分離膠時,電壓升至60V約1.5h。確定電泳結束時，不應將溴酚蘭跑出凝膠管，以防止標準分子量中的最低分子量蛋白質也跑出凝膠管。6、剝膠電泳結束后，取下玻璃管，將一支帶有長針頭的注射器吸有適量水（蒸餾水或自來水），從濃縮膠一端緊貼玻璃管壁緩慢插入針頭，一面注入蒸餾水一面緩慢旋轉玻璃管。靠水流的壓力和潤滑作用使凝膠和玻璃管的內壁分開，待水流從另一端流出時，再慢慢將針頭退出（注意操作中不要把膠條攪碎）。然后用洗耳球輕輕在膠管的一端加壓，將膠條從玻璃管中緩慢滑出。

7、固定剝膠完畢后，將膠條置于固定液中固定20-30分鐘

8、凝膠染色：將取出的凝膠柱，放入一合適干凈的培養(yǎng)皿內，然后加入適量考馬斯亮藍染色液中，于搖床上進行振搖染色30分鐘，完畢，回收染色液，用清水洗凝膠柱2-3遍。在染色的同時，凝膠中蛋白質區(qū)帶亦被固定。

9、凝膠脫色：在培養(yǎng)皿（或試管）內加入適量脫色液于搖床上進行振搖（2小時/次，需3次）脫色多次直至色帶完全清晰為止。

10、繪圖：最后根據(jù)染色所出現(xiàn)的帶數(shù)和位置進行繪圖，以確定被分析樣品的組分。另一種方法是通過密度掃描儀掃出各組分的峰形位置，這樣不僅能確定組分，而且能比較出各組分所占比例（如果要計算出各分離區(qū)帶的相對遷移率，可參考教課書）。四、注意事項樣品的離子強度、pH值盡可能與濃縮膠溶液相同，如含大量鹽類時，應透析除鹽。最適合的樣品蛋白量是10μg～100μg，加入樣品量要少，血清樣品3μl～5μl，免疫球蛋白樣品可加15μl～20μl。凝膠柱面應平整，操作過程切勿產(chǎn)生氣泡，否則電泳區(qū)帶不整齊。電泳中電流應保持穩(wěn)定，避免電流強度過高，而產(chǎn)生大量的熱使分離失敗。電泳開始，樣品應于