布氏桿菌病的檢疫

布氏桿菌病的檢疫1、目的

初步掌握布氏桿菌病的血清學診斷及變態(tài)反應等檢疫方法。2、內容及方法｜

2.1血清學診斷

應用血清學方法檢出血清中有抗體存在，則說明被檢動物為布氏桿菌病愚畜。動物感染布氏桿菌以后首先出現(xiàn)的是凝集抗體，再過一段時間才出現(xiàn)補體結合抗體，最后產生變態(tài)反應性。補體結合反應是一種高度特異性的，其陽性反應與感染的符合率，比血清凝集試驗與感染的符合率高。此種方法用來鑒別注苗后和自然感染所引起跑血清學反應很有價值，如4～8個月犢牛注射19號菌苗、和山羊注射Rev1號菌苗，經過6個月后補體結合反應為陰性，而血清凝集反應仍為陽性或可疑。

我國的家畜布氏桿菌病檢疫應用的免疫生物學方法主要是凝集試驗，補體結合試驗及變態(tài)反應試驗。

試管凝集反應：本試驗按《家畜布氏桿菌病試管凝集反應技術操作規(guī)程及判定標準》進行。

（1）材料準備：

抗原：由獸醫(yī)生物藥品廠生產供應。使用時用0．5％石炭酸生理鹽水作l：20稀釋，長霉或出現(xiàn)凝集塊的抗原不能應用。

被檢血清：必須新鮮9無明顯蛋白凝固，無溶血現(xiàn)象和腐敗氣味。

陽性血清和陰性血清：由獸醫(yī)生物藥品廠生產供應。

稀釋液：0．5％石炭酸生理鹽水，用化學純石炭酸與氯化鈉配制，經高壓滅菌后備用。檢疫羊用稀釋液用0．5％石炭酸10％氯化鈉溶液。

（2）操作步驟：

牛、馬、駱駝用1:50、1:100、1:200、1:400四個稀釋度；豬、山羊、綿羊和狗用1:25、1:50、1:100、1:200四個稀釋度。

稀釋血清和抗原加入方法：取5支小試管。

先加入稀釋液0.5%石炭酸生理鹽水，第1管加2.3ml，從第2管不加，第3、4、5管加0.5ml。取被檢血清0.2ml加入到第一管中，混勻，分別取0.5加入2、3管中。將第3管混勻，吸0.5ml加入第4管，混勻，吸0.5ml加入第5管。

被檢血清0.2ml

生理鹽水2.3ml00.5ml0.5ml0.5ml

然后從第2管起，加1：20稀釋抗原0.5ml。血清最后稀釋度為1:251:501:1001:200,震蕩使血清和抗原充分混合，放入37℃溫箱18-20小時，取出后室溫靜置2小時，記錄每管的反應情況，出現(xiàn)50%以上凝集的最高稀釋度就是這份血清的凝集價

實驗應該設立以下對照：陰性血清對照：操作步驟與被檢血清相同。

陽性血清對照：陽性血清稀釋到原有滴度，其它同上。

抗原對照：已稀釋抗原0.5ml＋稀釋液0.5ml。

結果判定：

牛、馬、駱駝血清凝集價在1:100以上；豬、山羊、綿羊和狗在1:50以上，判定為陽性。

牛、馬、駱駝血清凝集價在1:50以上；豬、山羊、綿羊和狗在1:25以上，判定為可疑?？梢杉倚蠼涍^3-4周重檢，牛羊重檢仍然為可疑，可判定為陽性，豬馬重檢仍然為可疑，但是無臨床癥狀判定為陰性。

試管凝集試驗也可用簡便方式進行，即以0．2ml吸管將被檢血清以0.08、O.04、0.02及O.01分別加人4支小試管內，然后每管加人1：40稀釋的抗原1ml,充分搖勻，這樣4管血清的最后稀釋度分別為1：25、1：50、1：100、1：2000.

牛、馬和駱駝的血清稀釋和加抗原的方法與前述者一致，不同的僅第1管加稀釋液2.4ml及被檢血清0.1ml。加抗原后從第2管到第5管血清稀釋度依次為1:50、1:100、1:200和1:400。

每次試驗須作三種對照，陰性血清對照的操作步驟與被檢血清者相同。陽性血清對照須將血清稀釋到其原有滴度，其他步驟同上。抗原對照即將當時使用的乙稀釋抗原0，5mlfB稀釋液0.5ml。

每次試驗須制備比濁管，以為記錄結果的依據(jù)，配制方法即以當時使用的已稀釋抗原加等量稀釋液，按表11比例配制。

比濁管配制方法

管號抗原稀釋液實驗用稀釋液清亮度(%)標記

10.01.0100

20.250.7575

30.50.550

40.750.2525

51.00.00全部試管充分振蕩后，置37～38℃溫箱中，22～24h后用比濁管對照檢查記錄結果。出現(xiàn)50％以上凝集的最高稀釋度就是這份血清的凝集價，因此50％亮度的比濁管很重要。

（3）結杲判定：牛、馬和駱駝血清攘集價為1：100以上，豬、羊和狗1：50以上者，判為陽性。牛、馬和駱駝血清凝集價為1：50，豬、羊和狗為1：25者判為可疑。可疑反應的家畜經3～4周重檢，牛、羊重檢時仍為可疑，判為陽性。豬和馬重檢時仍為可疑，但農場中未出現(xiàn)陽性反應及無臨診癥狀妁家畜，判為陰性。

鑒于豬血清常有個別出現(xiàn)非特異性凝集反應9在試驗時須結合流行病學判定結果。如果出現(xiàn)個別弱陽性（例如凝集價為1：100～1：200），但豬群中均無臨診癥狀（流產、關節(jié)炎、睪丸炎），可以考慮此種反應為非特異性，經3～4周可采血重檢。2.2、變態(tài)反應。本試驗是用不同類型的抗原進行布氏桿菌病診斷的方法之一。布氏桿菌水解素即變態(tài)反應試驗的一種抗原，這種抗原專供綿羊和山羊檢查布氏桿菌病之用。按《羊布氏桿菌病變態(tài)反應技術操作規(guī)程及判定標準》進行。

（1）操作步驟使用細針頭，將水解素注射于綿羊或山羊的尾褶壁部或肘關節(jié)無毛處的皮內，注射劑量0.2ml。注射前應將注射部位用酒精棉消毒。如注射正確，在注射部形成綠豆大小的硬包。注射一只后，針頭應用酒精棉消毒，然后再注射另一只。

（2）結果判定注射后24h和48h各觀察反應一次（肉眼觀察和觸診檢查）。若兩次觀察反應結果不符時，以反應最強的一次作為判定的依據(jù)。判定標準是：

強陽性反應（+++）：注射部位有明顯不同程度腫脹和發(fā)紅（硬腫或水腫），不用觸診，一望而知。

陽性反應（++）：腫脹程度雖不如上述現(xiàn)象明顯，但很容易看出。

弱陽性反應（+）：腫脹程度也不明顯，有時須靠觸診始能發(fā)現(xiàn)。

疑似反應（±）：腫脹程度似不明顯，通常須與另一側皺褶相比較。

陰性反應（—）：注射部位無任何變化。

陽性牲畜，應立即移入陽性畜群進行隔離，可疑牲畜須于注射后30日進行第二次復檢，如仍為疑似反應，則按陽性牲畜處理，如為陰性則視為健畜。思考題：

1.疑似布氏桿菌病綿羊流產胎兒一只，如何進行細菌學檢查。

2.家畜布氏桿菌試管凝集實驗和變態(tài)反應的原理是什么？各有何優(yōu)缺點？豬瘟的診斷1．實驗目的：掌握豬瘟的現(xiàn)場和實驗室診斷方法。2．實驗材料

人工攻毒豬.

剪刀，鑷子等.

兔子.

被檢血清.

陽性和陰性血清

稀釋液：0.5%石炭酸生理鹽水3．實驗步驟。

3.1、臨床診斷。

詳細詢問和調查發(fā)病豬群的發(fā)病情況和有關的其他情況，包括發(fā)病豬頭數(shù)、發(fā)病經過、可能的原因或傳染源、主要臨診癥狀、治療措施及效果、病程和死亡情況、發(fā)病豬的來源及預防接種陶時間、發(fā)病豬群附近其他豬群的情況等；詳細檢查病豬的臨診癥狀，包括步態(tài)及精神狀態(tài)，大便形狀和質地及是否帶血或粘液，眼結膜和口腔粘膜是否有出血變化，體表可觸摸淋巴結（鼠蹊淋巴結）腫大情況，體溫變化情況等。寫出病歷。

病豬急宰或死亡后，應進行剖檢，全面檢查各系統(tǒng)內臟器官的眼觀病理變化，特別注意淋巴結、咽喉部、腎臟、膀胱、膽囊、心內外膜、腸道等臟器的出血性交化。寫出剖檢記錄。

從臨診癥狀、流行病學和病理變化等方面進行綜合分析，注意有無其他疾?。ㄈ绻蜗x病、豬丹毒、豬肺疫、豬副傷寒等）的可能性，作出初步診斷。

3.2、細菌學檢查

采取剛死不久的病豬或急宰豬的血液、淋巴結、脾臟等材料，接種于血液瓊脂和麥康瓊凱脂平板上，培養(yǎng)24～48h，檢查有無疑似的病原細菌。知有，需進一步鑒定和作動物接種試驗。將檢查結果記入病歷或剖檢記錄內，并提出診斷意見。豬瘟診斷中細菌學檢查的目的是為了確定發(fā)病豬（群）是否存在并發(fā)或繼發(fā)細菌感染，有時也為了排除豬瘟。

3.3、家兔接種試驗

選擇體重1.5kg以上大小基本相等的清潔級健康家兔4只，分為2組；試驗前3天測溫，每天3次，間隔8h，體溫應正常。

采病豬淋巴結和脾臟等病料做成1:10懸液，取上清液加青霉素、鏈霉素各100O單位處理后，以每只5m1的劑量肌肉內接種試驗兔。如用血液需加抗凝劑，每頭接種2ml。對照組不接種。

繼續(xù)測溫，每隔6h1次，連續(xù)3天。

7天后用豬瘟兔化弱毒1：20～50的清液靜脈注射試驗兔和對照兔，每只1ml。每6h測溫1次9連續(xù)3天。

記錄每只兔的體溫變化，繪制體溫曲線。根據(jù)試驗組和對照組兔的熱反應進行診斷。

（1）如試驗組接種病料后無熱反應，后來接種豬瘟免化弱毒后也無熱反應，而對照組兔接種豬瘟兔化弱毒有定型熱反應，則診斷為豬瘟。

（2）如試驗組接種病料后有定型熱反應，后來接種豬瘟兔化弱毒不發(fā)生熱反應，而對照組接種豬瘟兔化弱毒發(fā)生定型熱反應，則表明病料內含有豬瘟兔化弱毒。

（3）如試驗組接種病料后無熱反應，后來接種豬瘟兔化弱毒后發(fā)生定型熱反應，或接種病料后發(fā)生熱反應，后來對接種豬瘟兔化弱毒又發(fā)生定型熱反應，而對照組接種豬瘟兔化毒后發(fā)生定型熱反應，則不是豬瘟。

3.4、直接熒光抗體檢查

1．取急性高溫期病豬的扁桃體、淋巴結、脾或其他組織一小片，用濾紙吸去外面液體。

2．取潔凈載玻片一塊，稍為烘熱，將組織小片的切面觸壓玻片，略加轉動，作成壓印片，置室溫干燥，或將病理組織制成冰凍切片。

3、滴加冷丙酮數(shù)滴，置－20℃固定15～20mln。

4．用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗，陰干。

5．滴加標記熒光抗體（中圄獸藥監(jiān)察所），置37℃飽和濕度箱盒內作用30min。

6．用ρH7．2的PBS漂洗3次，每次5～10min。

7．干后滴加甘油緩沖液，加蓋玻片封閉，用熒光顯微鏡檢查。

8．如細胞胞漿內有彌漫性、絮狀或點狀的亮黃綠色熒光，為豬瘟；如僅見暗綠或灰藍色，則不是豬瘟。

9．試驗設已知含豬瘟病毒材料壓印片和不含豬瘟病毒材料壓印片9作為陽性和陰性對照。

10．標本染色和漂洗后，浸泡于5％吐溫80PBS（pH7。2，0．01mol／L）中1h以上，可除去非特異染色，晾干后用0．1％伊文思藍復染15～30min，檢查判定同上。思考題：

1.豬瘟的兔體交互免疫實驗的原理是什么？

2.直接熒光抗體實驗的原理是什么？豬藍耳病的診斷1．實驗目的：掌握豬藍耳病的現(xiàn)場和實驗室診斷方法。2．實驗材料

ELISA試劑盒

被檢血清、陽性和陰性血清、稀釋液（0.5%石炭酸生理鹽水）。3．實驗步驟。

3.1、臨床診斷。

詳細詢問和調查發(fā)病豬群的發(fā)病情況和有關的其他情況，包括流行病學情況（如發(fā)病動物、發(fā)病率、死亡率等）；主要臨床表現(xiàn)（如母豬繁殖障礙、仔豬呼吸困難和死亡、部分仔豬四肢和耳部發(fā)紺出現(xiàn)藍紫色、架子豬臨床表現(xiàn)輕度流感癥狀等）；病理解剖變化（間質性肺炎等）；治療情況；免疫情況等

3.2、實驗室診斷

3.2.1細菌學檢查：單純感染為陰性：采取剛死不久的病豬或急宰豬的血液、淋巴結、脾臟等材料，接種于血液瓊脂和麥康瓊凱脂平板上，培養(yǎng)24～48h，檢查有無疑似的病原細菌。

3.2.2PRRSV的分離鑒定

3.2.3血清學檢測：以ELISA進行抗體檢測為例。

A、用樣品稀釋液將待檢血清1:40稀釋（指形管中完成），取預包被的微孔板（可拆分使用），每孔加稀釋后的血清100μl。同樣1:40稀釋陰、陽性對照血清，陰、陽性對照各設2孔，每孔100μl。另設一空白對照孔，空白對照孔加100μl稀釋液。輕輕振勻孔中樣品（勿溢出），置37℃溫浴30分鐘。

B、甩掉板孔中的溶液，用洗滌液洗板5次，200μl/孔，每次在干凈吸水紙上拍干。

C、每孔加酶標二抗（抗豬IgG－HRP結合物）100μl，置37℃溫浴30分鐘。

D、洗滌5次，方法同2。

E、每孔加底物A液、B液各1滴（50μl），混勻，室溫避光顯色10分鐘。

F、每孔加終止液1滴（50μl），15分鐘內測定結果。

判定標準：以空白孔調零，在酶標儀上測各孔OD630值。試驗成立條件是陽性對照孔平均OD630值大于或等于1.0，陰性對照孔平均OD630值必須小于0.2。樣品OD630值大于0.42，判定為陽性；樣品OD630值在0.38～0.42之間，判為可疑；樣品OD630值小于0.38，判為陰性。

備注：陽性結果表明免疫力達標，陰性結果表明免疫力不達標。思考題：

如何判定某個豬群是否有藍耳病的存在？雞新城疫的診斷1、實驗目的：

掌握雞新城疫的臨診診斷要點；系統(tǒng)地了解和掌握雞新城疫的實驗室診斷和免疫監(jiān)測技術。2、實驗內容

2．1、雞新城疫的臨診診斷。

2．2NDV的分離鑒定

2．2．1．樣品采集

2．2．2．病毒分離培養(yǎng)分離NDv最敏感的方法仍是雞胚接種。接種前樣品在含抗生素培

養(yǎng)基中應在室溫作用2h（女口加抗生素培養(yǎng)基中的樣品已在4℃過夜，此步可省去）。組織懸液或拭子的沖洗液在1000～2000r／min，離心10min，取上清接種4～5個9～10日齡的SPF雞胚，以尿囊腔接種每胚O．2ml。如果沒有SPF雞胚，也可以用非免疫雞胚?？贵w陽性雞胚會降低病毒分離的成功率。

接種后的雞胚在37℃繼續(xù)孵育9并定時照蛋。將死胚或垂死胚取出置4℃冷卻，接種5～7天后將所有雞胚取出置4℃冷卻，然后取尿囊液和羊水做HA試驗。為了不漏檢，應將第一次試驗陰性的胚液不經稀釋再盲傳兩代。｜對所有HA陽性胚液做無菌檢查，如有細菌污染，可用0.22um微孔濾膜過濾除菌，加人抗生素后再接種9～10日齡的雞胚。

2．2．3．病毒的鑒定雞胚液HA陽性，用特異性抗血清進行血凝抑制試驗（HI），可證實或排除NDV。

2．2．3NDV的毒力型鑒定

2．3雞新城疫的血凝和血凝抑制試驗。

試驗材料:96孔血凝板、微量加樣器、吸頭、Eppendorf管、生理鹽水、