細(xì)胞周期 課件

鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室

姓名賀穎第二十二章細(xì)胞周期1鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室

姓名賀穎第二十二章細(xì)胞增殖周期（細(xì)胞周期）：細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束開始，到下一次有絲分裂結(jié)束為止所經(jīng)歷的全過程。細(xì)胞周期間期interphase絲裂期（M期）mitoticphaseDNA合成前期（G1期）DNA合成期（S期）DNA合成后期（G2期）前期prophase中期premataphase后期anaphase末期talophaseG0期細(xì)胞周期中的細(xì)胞G1期G2期S期M期第一節(jié)細(xì)胞周期的一些基本概念2細(xì)胞增殖周期（細(xì)胞周期）：細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束開始，到下一增殖周期中的細(xì)胞G1期G2期S期M期死亡不分裂細(xì)胞G0期暫不增殖細(xì)胞從增殖的角度來看，可將高等動(dòng)物的細(xì)胞分為三類：連續(xù)分裂細(xì)胞連續(xù)分裂細(xì)胞(cyclingcell)在細(xì)胞周期中連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)因而又稱為周期細(xì)胞，如表皮生發(fā)層細(xì)胞、部分骨髓細(xì)胞?！ば菝呒?xì)胞(Go細(xì)胞)暫不分裂，但在適當(dāng)?shù)拇碳は驴芍匦逻M(jìn)入細(xì)胞周期，稱G0期細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、肝、腎細(xì)胞等。·終末分化細(xì)胞指不可逆地脫離細(xì)胞周期，不再分裂的細(xì)胞，又稱終端細(xì)胞，如神經(jīng)、肌肉、多形性白細(xì)胞、紅細(xì)胞等等。3增殖周期G1期G2期S期M期死亡不分裂細(xì)胞G0期從增殖的角度二、細(xì)胞周期同步化選擇同步化選擇同步化是根據(jù)細(xì)胞的體積、黏附性等的時(shí)相特征來對(duì)不同時(shí)相的細(xì)胞進(jìn)行選擇和分離，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的同步化。誘導(dǎo)同步法誘導(dǎo)同步法是在培養(yǎng)液中添加或去除某些成分，或者改變培養(yǎng)溫度，從而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)行阻滯或回復(fù)，將不同步生長(zhǎng)的細(xì)胞調(diào)整為同步生長(zhǎng)，獲得時(shí)相較為均一的細(xì)胞群。4二、細(xì)胞周期同步化選擇同步化選擇同步化是根據(jù)細(xì)胞的體積、黏附細(xì)胞分裂收獲法M期細(xì)胞由于細(xì)胞骨架的變化，而使細(xì)胞變園。因而，當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)皿表面貼壁生長(zhǎng)時(shí)，由于M期細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)皿的黏著力減弱，只要輕輕搖動(dòng)這些細(xì)胞就被分離出來。用此法收集到的M期細(xì)胞構(gòu)成一個(gè)同步化細(xì)胞群，它們幾乎立即就將進(jìn)入G1期。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，同步化程度高，細(xì)胞不受藥物傷害。缺點(diǎn)：獲得的細(xì)胞數(shù)量較少。5細(xì)胞分裂收獲法M期細(xì)胞由于細(xì)胞骨架的變化，而使細(xì)胞變園。因而代謝抑制法胸苷是合成DNA的前體，是不可或缺的。其適當(dāng)?shù)臐舛葹?0-7～10-5mol/L。如果給與過量的胸苷（10-3mol/L）則引起脫氧胸苷合成受到抑制，其結(jié)果DNA的合成也將終止。在培養(yǎng)中的細(xì)胞給與過量的胸苷后，則S期細(xì)胞都會(huì)向G2、M、G1前進(jìn)，再次給藥后，細(xì)胞大都被阻滯在G1/S期。優(yōu)點(diǎn)是同步化程度高，適用于任何培養(yǎng)體系?？蓪缀跛械募?xì)胞同步化。缺點(diǎn)是產(chǎn)生非均衡生長(zhǎng)，個(gè)別細(xì)胞體積增大。6代謝抑制法胸苷是合成DNA的前體，是不可或缺的。其適當(dāng)?shù)臐舛鹊诙?jié)細(xì)胞周期各時(shí)相的動(dòng)態(tài)G1期：細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂決定和復(fù)制準(zhǔn)備G1早期：合成三種RNA、cAMP、cGMP、核糖體、蛋白質(zhì)以及糖類。氨基酸及糖的轉(zhuǎn)運(yùn)迅速進(jìn)行。限制點(diǎn)：決定細(xì)胞將來是否分裂的關(guān)鍵點(diǎn)，又稱R點(diǎn)。G1晚期：急劇合成與DNA合成有關(guān)的酶（DNA聚合酶、胸苷激酶）U蛋白、以及一種重要的酶調(diào)節(jié)物——鈣調(diào)素，還進(jìn)行H1組蛋白的磷酸化、組蛋白和非組蛋白R(shí)NA的合成。7第二節(jié)細(xì)胞周期各時(shí)相的動(dòng)態(tài)G1期：細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂決限制點(diǎn),R限制點(diǎn)（R點(diǎn)）：G1期對(duì)一些環(huán)境因素的敏感點(diǎn)，可限制正常細(xì)胞通過周期。是控制細(xì)胞增殖的關(guān)鍵。8限制點(diǎn),R限制點(diǎn)（R點(diǎn)）：G1期對(duì)一些環(huán)境因素的敏感點(diǎn)，可限S期S期：從DNA合成開始到DNA合成結(jié)束的全過程，是細(xì)胞增殖周期的關(guān)鍵階段。主要特點(diǎn)：1.DNA的復(fù)制2.染色質(zhì)組裝3.中心粒的復(fù)制9S期S期：從DNA合成開始到DNA合成結(jié)束的全過程，是細(xì)胞增G2期G2期:從DNA復(fù)制完成到有絲分裂開始前的時(shí)期，為有絲分裂進(jìn)行物質(zhì)條件和能量的準(zhǔn)備（加速RNA和有絲分裂相關(guān)蛋白的合成）。合成微管蛋白等紡錘體的成分；合成染色質(zhì)凝集相關(guān)蛋白；合成M期調(diào)控蛋白；4.

中心粒開始向兩極移動(dòng)，體積膨大。10G2期G2期:從DNA復(fù)制完成到有絲分裂開始前的時(shí)期，為有M期M期:染色質(zhì)螺旋化變?yōu)槿旧w，并均勻分配到兩個(gè)子細(xì)胞的過程。同時(shí)伴有核的一系列變化和胞質(zhì)分裂。11M期M期:染色質(zhì)螺旋化變?yōu)槿旧w，并均勻分配到兩個(gè)子細(xì)胞的第三節(jié)細(xì)胞周期的驅(qū)動(dòng)力一、細(xì)胞周期的引擎：Cyc-CdK蛋白磷酸化調(diào)控系統(tǒng)二、細(xì)胞周期的原動(dòng)力：周期性基因表達(dá)三、細(xì)胞周期的清道夫：泛素化蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)四、細(xì)胞周期的外動(dòng)力：生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)12第三節(jié)細(xì)胞周期的驅(qū)動(dòng)力一、細(xì)胞周期的引擎：Cyc-C

Cyc-CdK蛋白磷酸化調(diào)控系統(tǒng)CdKCyclin，CycCdK是催化亞單位，Cyc是調(diào)節(jié)亞單位，兩者結(jié)合才具有激酶活性。由于Cyc呈周期性表達(dá)和降解，而CdK的激酶活性是驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期的關(guān)鍵。因此Cyc-CdK被稱為細(xì)胞周期引擎（cellcycleengine)。

13Cyc-CdK蛋白磷酸化調(diào)控系統(tǒng)CdKCyclin，C如酵母細(xì)胞的周期蛋白：cln1、cln2、cln3、clb1、clb2、clb3、clb4、clb5、clb6；高等真核生物迄今為止已鑒定出周期蛋白有cyclinA(A1、A2)、B(B1、B2、B3)、C、D(D1、D2、D3)、E(E1、E2)、F、G、H等。TimothyHunt：首次發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)ＣＤＫ功能的物質(zhì)cyclin（細(xì)胞周期蛋白）。一、周期蛋白14如酵母細(xì)胞的周期蛋白：cln1、cln2、cln3、clb1細(xì)胞周期蛋白(cyclin)cyclinAcyclinBcyclinCcyclinDcyclinE在G1期細(xì)胞越過R點(diǎn)向S期轉(zhuǎn)變的過程中發(fā)揮調(diào)控作用。與S期的啟動(dòng)有關(guān)。在S期DNA合成的起始過程中起作用,當(dāng)cyclinE降解后,其作用可延續(xù)至整個(gè)S期。G2/M。MPF的組成部分。15細(xì)胞周期蛋白(cyclin)cyclinAcyclinBcy周期蛋白框PESTPESTPESTPESTPEST48X10348X10333X10332X10344X10366X10387X10329X103A2B1GFCln3EDC相對(duì)分子質(zhì)量周期蛋白破壞框破壞框R42R42均含有一段相當(dāng)保守的搭配序列——周期蛋白框（cyclinbox），周期蛋白框介導(dǎo)周期蛋白的周期蛋白依賴激酶（cyclindependentkinaseCDK）結(jié)合。16周期蛋白框PESTPESTPESTPESTPEST48X二、周期蛋白依賴激酶

這類基因所編碼的蛋白產(chǎn)物均為P34Kd的蛋白，稱為P34cdc2和P34cdc28,

它們本身不具有激酶活性，但和有關(guān)蛋白結(jié)合后，可使多種蛋白底物磷酸化，因而它們統(tǒng)稱為周期蛋白依賴性激酶（cyclindependentkinasecdk激酶）。

20世紀(jì)70年代初，哈特韋爾（LelandHarwell）和納斯（PaulNurse）博士分別以不同種的酵母為材料，利用遺傳學(xué)方法先后分離出cdc28和cdc2基因。17二、周期蛋白依賴激酶這類基因所編碼的蛋白產(chǎn)物均為P34KdPSTAIREPSTAIREPSTAIREPV/STVREPSSALREPLSTIRENRTAIRECDK7(p40MO15)與Cdc序列相識(shí)度百分比例100%65%66%44%57%47%40%CDK蛋白Cdc2(CDK1)CDK3CDK4CDK5CDK6CDK2激酶活性區(qū)通過PCR技術(shù)測(cè)定的與cdc2類似的CDK蛋白分子圖解。18PSTAIREPSTAIREPS某些CDK與周期蛋白配對(duì)關(guān)系及作用CDK種類可結(jié)合cyclin功能作用CDK1(cdc2)

CDK2

CDK3CDK4CDK5CDK6CDK7CDK8AB1、B2、B3AD1D2D3E?D1D2D3D1D2D3D1D2D3HCS/G2→MG2→M、早期ＭSG1G1→SG1G1G1G1→SMultiplephases19某些CDK與周期蛋白配對(duì)關(guān)系及作用CDK種類可結(jié)合cyclCDK在細(xì)胞周期中連續(xù)合成，含量穩(wěn)定；cyclin的合成和降解隨細(xì)胞周期的進(jìn)程發(fā)生明顯變化。CDK

水平MPF水平

SMSMcyclin水平

CDK

、

cyclin和MPF三者的關(guān)系20CDK在細(xì)胞周期中連續(xù)合成，含量穩(wěn)定；cyclin的合成和6CdK1CdK1216CdK121細(xì)胞越過G1期的R點(diǎn)時(shí)，CycD-CdK4/6被激活后進(jìn)入細(xì)胞核，對(duì)RB蛋白進(jìn)行磷酸化，解除RB對(duì)轉(zhuǎn)錄因子E2F的抑制。E2F激活表達(dá)G1/S轉(zhuǎn)換和復(fù)制所需的一系列基因，產(chǎn)物包括CycE和E2F自身。CycE-CdK2結(jié)合，進(jìn)一步對(duì)RB進(jìn)行磷酸化，形成正反饋，激活復(fù)制相關(guān)基因的大量表達(dá)，實(shí)現(xiàn)復(fù)制的啟動(dòng)。22細(xì)胞越過G1期的R點(diǎn)時(shí)，CycD-CdK4/6被激活后進(jìn)入細(xì)復(fù)制開始后，CycD/E和復(fù)制啟動(dòng)因子迅速被CycA-Cdk2磷酸化并降解，從而防止復(fù)制的重復(fù)啟動(dòng)。復(fù)制期間的蛋白磷酸化主要由CycA-Cdk2控制。23復(fù)制開始后，CycD/E和復(fù)制啟動(dòng)因子迅速被CycA-Cdk

M期的啟動(dòng)M期的啟動(dòng)由于磷酸酶Cdc25解除了Cdk1的磷酸化抑制。CyclinA/B-Cdk1又稱為成熟促進(jìn)因子（MPF)。

CycA/B-Cdk1結(jié)合后具有Ser/Thr(絲氨酸/蘇氨酸)激酶活性，可使多種底物蛋白磷酸化。24M期的啟動(dòng)M期的啟動(dòng)由于磷酸酶Cdc25解CyclinA/BCdk1+有絲分裂染色質(zhì)凝集組蛋白H1p核纖層解體核膜破裂核纖層蛋白p降低與DNA結(jié)合的能力,促進(jìn)染色體的凝集某些DNA結(jié)合蛋白p細(xì)胞周期中微管動(dòng)力學(xué)變化微管蛋白p25CyclinA/BCdk1+有絲分裂組蛋白H1p核纖層解體核在細(xì)胞周期進(jìn)程中，多種蛋白或酶直接或間接地參與細(xì)胞周期事件的調(diào)控，編碼這些蛋白或酶的基因有規(guī)律、特異性的表達(dá)構(gòu)成細(xì)胞周期調(diào)控的遺傳基礎(chǔ)。細(xì)胞分裂周期基因(celldivisioncyclegene,Cdc)是一類產(chǎn)物表達(dá)具有細(xì)胞周期依賴性或直接參與細(xì)胞周期調(diào)控的基因，主要包括Cyclin,CdK等，此外DNA聚合酶基因、DNA連接酶基因均屬于Cdc基因。除Cdc基因外，在細(xì)胞周期調(diào)控中起著重要作用的另一大類基因還有癌基因和抑癌基因。它們的正常表達(dá)是細(xì)胞周期運(yùn)行所必須的，當(dāng)其發(fā)生突變或失活時(shí)，將導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖或癌變。26在細(xì)胞周期進(jìn)程中，多種蛋白或酶直接或間接地參與細(xì)胞周期事件的CyclinBCdc2CyclinBCdc2ppCyclinA&BCdc2pP107&E2FCDK2CyclinEP107&E2FCDK2CyclinACyclinD1,2&3PCNACDK4,6E2FRBE2FpRBCyclinHCDK7⊕Cdc25A⊕⊕WeelMiklS期G2

期G1

期M期Cdc25C⊕Ras,Rat,Myc,Fos,JunMyc⊕生長(zhǎng)因子限制點(diǎn)⊕p16p15TGFβp21p53p27TGFβ接觸抑制與癌瘤相關(guān)的蛋白27CyclinBCdc2CyclinBCdc2ppCyclin泛素化蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期的時(shí)相轉(zhuǎn)換：終止前一階段的事件；2.解除對(duì)后一階段事件的抑制。蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)可以選擇性地清除某些活性蛋白和抑制蛋白，為細(xì)胞周期的進(jìn)程掃清道路，保證細(xì)胞周期的方向。細(xì)胞內(nèi)的選擇性蛋白質(zhì)降解主要由泛素化蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)來完成。28泛素化蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期的時(shí)相轉(zhuǎn)換：蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)

泛素（ubiquitin)由76個(gè)氨基酸組成，高度保守，普遍存在于真核細(xì)胞，故名泛素。共價(jià)結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶體識(shí)別和降解，這是細(xì)胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑，泛素相當(dāng)于蛋白質(zhì)被摧毀的標(biāo)簽。26S蛋白酶體是一個(gè)大型的蛋白酶，可將泛素化的蛋白質(zhì)分解成短肽。泛素ubiquitin29泛素（ubiquitin)由76個(gè)氨基酸組成，高度保守，3030

蛋白質(zhì)的泛素化修飾過程分為3個(gè)步驟:E1（泛素激活酶）水解ATP獲取能量，通過其活性位置的半胱氨酸殘基與泛素的羧基末端形成高能硫酯鍵而激活泛素，然后E1將泛素交給E2（泛素結(jié)合酶），最后在E3（泛素連接酶）的作用下將泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白表面的賴氨酸殘基上。E3是泛素化蛋白質(zhì)降解的關(guān)鍵。參與細(xì)胞周期調(diào)控的泛素連接酶至少有兩類，其中SCF負(fù)責(zé)將泛素連接到G1/S期周期蛋白和某些CKI上，APC負(fù)責(zé)將泛素連接到M期周期蛋白上。31蛋白質(zhì)的泛素化修飾過程分為3個(gè)步驟:E1（泛素激活酶）

APCcdc20降解抑制因子securin釋放分離酶降解染色單體間的連接蛋白cohesin姐妹染色單體分離

APCcdh1降解CycA/B-Cdk1啟動(dòng)M期退出機(jī)制完成細(xì)胞分裂

G1早期降解CdcD防止過早啟動(dòng)G1/S轉(zhuǎn)換細(xì)胞越過R點(diǎn)，cdh1自我降解，APC失活，CycD/E積累，進(jìn)入S期；進(jìn)入S期后，CycD/E被SCF泛素化降解有效防止復(fù)制的重復(fù)啟動(dòng)APC的作用機(jī)理32APCcdc20降解抑制因子securin釋放分離酶降解

生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)

生長(zhǎng)因子是一類由細(xì)胞自分泌或旁分泌產(chǎn)生的多肽，主要通過激活細(xì)胞膜受體來啟動(dòng)相應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而影響細(xì)胞周期的進(jìn)程。33生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)生長(zhǎng)因子是一類由細(xì)胞自分泌第四節(jié)細(xì)胞周期的檢控點(diǎn)34第四節(jié)細(xì)胞周期的檢控點(diǎn)34一、Cdk活性的抑制控制細(xì)胞周期進(jìn)程主要通過抑制Cdk活性來實(shí)現(xiàn)。1.結(jié)合抑制Cdk抑制因子（CKI)是一類Cdk結(jié)合蛋白，可直接結(jié)合抑制Cdk的活性。CKI主要包括INK4家族的p15、p16、p18、p19和WAF/KIP家族的p21、p27、p57等。因此，G1/S轉(zhuǎn)換和G2/M轉(zhuǎn)換都需要特定的機(jī)制來解除CKI的抑制。2.磷酸化抑制激酶Myt1、Waf1、Weel、Cip1等則是通過對(duì)Cdk蛋白進(jìn)行磷酸化修飾來抑制其活性。35一、Cdk活性的抑制控制細(xì)胞周期進(jìn)程主要通過抑制Cdk活性來3636二、檢控點(diǎn)（checkpoint)檢控點(diǎn)是檢查和控制細(xì)胞周期進(jìn)程的信號(hào)通路。在細(xì)胞周期程序出現(xiàn)問題或環(huán)境條件發(fā)生變化時(shí)，檢控點(diǎn)機(jī)制被激活，通過對(duì)Cdk的結(jié)合抑制和磷酸化抑制來阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程，同時(shí)啟動(dòng)DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡等應(yīng)對(duì)機(jī)制。37二、檢控點(diǎn)（checkpoint)檢控點(diǎn)是檢查和控制細(xì)胞周期3838DNA損傷檢控點(diǎn)DNA損傷或未復(fù)制ATM/ATRDNA修復(fù)Chk1/2p53Mdm2cdc25Waf1/Cip1p21細(xì)胞周期引擎細(xì)胞周期停滯細(xì)胞凋亡ATM是與DNA損傷檢驗(yàn)有關(guān)的基因。ATM編碼一個(gè)蛋白激酶，結(jié)合在損傷的DNA上，能將某些蛋白磷酸化，中斷細(xì)胞周期。39DNA損傷檢控點(diǎn)DNA損傷或未復(fù)制ATM/ATRDNA修復(fù)C4040小結(jié)1.掌握細(xì)胞周期的基本概念2.掌握細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制3.掌握細(xì)胞周期的檢控點(diǎn)調(diào)控機(jī)制41小結(jié)1.掌握細(xì)胞周期的基本概念41鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

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姓名賀穎第二十二章細(xì)胞周期42鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院

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姓名賀穎第二十二章細(xì)胞增殖周期（細(xì)胞周期）：細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束開始，到下一次有絲分裂結(jié)束為止所經(jīng)歷的全過程。細(xì)胞周期間期interphase絲裂期（M期）mitoticphaseDNA合成前期（G1期）DNA合成期（S期）DNA合成后期（G2期）前期prophase中期premataphase后期anaphase末期talophaseG0期細(xì)胞周期中的細(xì)胞G1期G2期S期M期第一節(jié)細(xì)胞周期的一些基本概念43細(xì)胞增殖周期（細(xì)胞周期）：細(xì)胞從一次有絲分裂結(jié)束開始，到下一增殖周期中的細(xì)胞G1期G2期S期M期死亡不分裂細(xì)胞G0期暫不增殖細(xì)胞從增殖的角度來看，可將高等動(dòng)物的細(xì)胞分為三類：連續(xù)分裂細(xì)胞連續(xù)分裂細(xì)胞(cyclingcell)在細(xì)胞周期中連續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)因而又稱為周期細(xì)胞，如表皮生發(fā)層細(xì)胞、部分骨髓細(xì)胞。·休眠細(xì)胞(Go細(xì)胞)暫不分裂，但在適當(dāng)?shù)拇碳は驴芍匦逻M(jìn)入細(xì)胞周期，稱G0期細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、肝、腎細(xì)胞等?！そK末分化細(xì)胞指不可逆地脫離細(xì)胞周期，不再分裂的細(xì)胞，又稱終端細(xì)胞，如神經(jīng)、肌肉、多形性白細(xì)胞、紅細(xì)胞等等。44增殖周期G1期G2期S期M期死亡不分裂細(xì)胞G0期從增殖的角度二、細(xì)胞周期同步化選擇同步化選擇同步化是根據(jù)細(xì)胞的體積、黏附性等的時(shí)相特征來對(duì)不同時(shí)相的細(xì)胞進(jìn)行選擇和分離，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的同步化。誘導(dǎo)同步法誘導(dǎo)同步法是在培養(yǎng)液中添加或去除某些成分，或者改變培養(yǎng)溫度，從而對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)行阻滯或回復(fù)，將不同步生長(zhǎng)的細(xì)胞調(diào)整為同步生長(zhǎng)，獲得時(shí)相較為均一的細(xì)胞群。45二、細(xì)胞周期同步化選擇同步化選擇同步化是根據(jù)細(xì)胞的體積、黏附細(xì)胞分裂收獲法M期細(xì)胞由于細(xì)胞骨架的變化，而使細(xì)胞變園。因而，當(dāng)細(xì)胞在培養(yǎng)皿表面貼壁生長(zhǎng)時(shí)，由于M期細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)皿的黏著力減弱，只要輕輕搖動(dòng)這些細(xì)胞就被分離出來。用此法收集到的M期細(xì)胞構(gòu)成一個(gè)同步化細(xì)胞群，它們幾乎立即就將進(jìn)入G1期。優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，同步化程度高，細(xì)胞不受藥物傷害。缺點(diǎn)：獲得的細(xì)胞數(shù)量較少。46細(xì)胞分裂收獲法M期細(xì)胞由于細(xì)胞骨架的變化，而使細(xì)胞變園。因而代謝抑制法胸苷是合成DNA的前體，是不可或缺的。其適當(dāng)?shù)臐舛葹?0-7～10-5mol/L。如果給與過量的胸苷（10-3mol/L）則引起脫氧胸苷合成受到抑制，其結(jié)果DNA的合成也將終止。在培養(yǎng)中的細(xì)胞給與過量的胸苷后，則S期細(xì)胞都會(huì)向G2、M、G1前進(jìn)，再次給藥后，細(xì)胞大都被阻滯在G1/S期。優(yōu)點(diǎn)是同步化程度高，適用于任何培養(yǎng)體系?？蓪缀跛械募?xì)胞同步化。缺點(diǎn)是產(chǎn)生非均衡生長(zhǎng)，個(gè)別細(xì)胞體積增大。47代謝抑制法胸苷是合成DNA的前體，是不可或缺的。其適當(dāng)?shù)臐舛鹊诙?jié)細(xì)胞周期各時(shí)相的動(dòng)態(tài)G1期：細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂決定和復(fù)制準(zhǔn)備G1早期：合成三種RNA、cAMP、cGMP、核糖體、蛋白質(zhì)以及糖類。氨基酸及糖的轉(zhuǎn)運(yùn)迅速進(jìn)行。限制點(diǎn)：決定細(xì)胞將來是否分裂的關(guān)鍵點(diǎn)，又稱R點(diǎn)。G1晚期：急劇合成與DNA合成有關(guān)的酶（DNA聚合酶、胸苷激酶）U蛋白、以及一種重要的酶調(diào)節(jié)物——鈣調(diào)素，還進(jìn)行H1組蛋白的磷酸化、組蛋白和非組蛋白R(shí)NA的合成。48第二節(jié)細(xì)胞周期各時(shí)相的動(dòng)態(tài)G1期：細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂決限制點(diǎn),R限制點(diǎn)（R點(diǎn)）：G1期對(duì)一些環(huán)境因素的敏感點(diǎn)，可限制正常細(xì)胞通過周期。是控制細(xì)胞增殖的關(guān)鍵。49限制點(diǎn),R限制點(diǎn)（R點(diǎn)）：G1期對(duì)一些環(huán)境因素的敏感點(diǎn)，可限S期S期：從DNA合成開始到DNA合成結(jié)束的全過程，是細(xì)胞增殖周期的關(guān)鍵階段。主要特點(diǎn)：1.DNA的復(fù)制2.染色質(zhì)組裝3.中心粒的復(fù)制50S期S期：從DNA合成開始到DNA合成結(jié)束的全過程，是細(xì)胞增G2期G2期:從DNA復(fù)制完成到有絲分裂開始前的時(shí)期，為有絲分裂進(jìn)行物質(zhì)條件和能量的準(zhǔn)備（加速RNA和有絲分裂相關(guān)蛋白的合成）。合成微管蛋白等紡錘體的成分；合成染色質(zhì)凝集相關(guān)蛋白；合成M期調(diào)控蛋白；4.

中心粒開始向兩極移動(dòng)，體積膨大。51G2期G2期:從DNA復(fù)制完成到有絲分裂開始前的時(shí)期，為有M期M期:染色質(zhì)螺旋化變?yōu)槿旧w，并均勻分配到兩個(gè)子細(xì)胞的過程。同時(shí)伴有核的一系列變化和胞質(zhì)分裂。52M期M期:染色質(zhì)螺旋化變?yōu)槿旧w，并均勻分配到兩個(gè)子細(xì)胞的第三節(jié)細(xì)胞周期的驅(qū)動(dòng)力一、細(xì)胞周期的引擎：Cyc-CdK蛋白磷酸化調(diào)控系統(tǒng)二、細(xì)胞周期的原動(dòng)力：周期性基因表達(dá)三、細(xì)胞周期的清道夫：泛素化蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)四、細(xì)胞周期的外動(dòng)力：生長(zhǎng)因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)53第三節(jié)細(xì)胞周期的驅(qū)動(dòng)力一、細(xì)胞周期的引擎：Cyc-C

Cyc-CdK蛋白磷酸化調(diào)控系統(tǒng)CdKCyclin，CycCdK是催化亞單位，Cyc是調(diào)節(jié)亞單位，兩者結(jié)合才具有激酶活性。由于Cyc呈周期性表達(dá)和降解，而CdK的激酶活性是驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期的關(guān)鍵。因此Cyc-CdK被稱為細(xì)胞周期引擎（cellcycleengine)。

54Cyc-CdK蛋白磷酸化調(diào)控系統(tǒng)CdKCyclin，C如酵母細(xì)胞的周期蛋白：cln1、cln2、cln3、clb1、clb2、clb3、clb4、clb5、clb6；高等真核生物迄今為止已鑒定出周期蛋白有cyclinA(A1、A2)、B(B1、B2、B3)、C、D(D1、D2、D3)、E(E1、E2)、F、G、H等。TimothyHunt：首次發(fā)現(xiàn)了調(diào)節(jié)ＣＤＫ功能的物質(zhì)cyclin（細(xì)胞周期蛋白）。一、周期蛋白55如酵母細(xì)胞的周期蛋白：cln1、cln2、cln3、clb1細(xì)胞周期蛋白(cyclin)cyclinAcyclinBcyclinCcyclinDcyclinE在G1期細(xì)胞越過R點(diǎn)向S期轉(zhuǎn)變的過程中發(fā)揮調(diào)控作用。與S期的啟動(dòng)有關(guān)。在S期DNA合成的起始過程中起作用,當(dāng)cyclinE降解后,其作用可延續(xù)至整個(gè)S期。G2/M。MPF的組成部分。56細(xì)胞周期蛋白(cyclin)cyclinAcyclinBcy周期蛋白框PESTPESTPESTPESTPEST48X10348X10333X10332X10344X10366X10387X10329X103A2B1GFCln3EDC相對(duì)分子質(zhì)量周期蛋白破壞框破壞框R42R42均含有一段相當(dāng)保守的搭配序列——周期蛋白框（cyclinbox），周期蛋白框介導(dǎo)周期蛋白的周期蛋白依賴激酶（cyclindependentkinaseCDK）結(jié)合。57周期蛋白框PESTPESTPESTPESTPEST48X二、周期蛋白依賴激酶

這類基因所編碼的蛋白產(chǎn)物均為P34Kd的蛋白，稱為P34cdc2和P34cdc28,

它們本身不具有激酶活性，但和有關(guān)蛋白結(jié)合后，可使多種蛋白底物磷酸化，因而它們統(tǒng)稱為周期蛋白依賴性激酶（cyclindependentkinasecdk激酶）。

20世紀(jì)70年代初，哈特韋爾（LelandHarwell）和納斯（PaulNurse）博士分別以不同種的酵母為材料，利用遺傳學(xué)方法先后分離出cdc28和cdc2基因。58二、周期蛋白依賴激酶這類基因所編碼的蛋白產(chǎn)物均為P34KdPSTAIREPSTAIREPSTAIREPV/STVREPSSALREPLSTIRENRTAIRECDK7(p40MO15)與Cdc序列相識(shí)度百分比例100%65%66%44%57%47%40%CDK蛋白Cdc2(CDK1)CDK3CDK4CDK5CDK6CDK2激酶活性區(qū)通過PCR技術(shù)測(cè)定的與cdc2類似的CDK蛋白分子圖解。59PSTAIREPSTAIREPS某些CDK與周期蛋白配對(duì)關(guān)系及作用CDK種類可結(jié)合cyclin功能作用CDK1(cdc2)

CDK2

CDK3CDK4CDK5CDK6CDK7CDK8AB1、B2、B3AD1D2D3E?D1D2D3D1D2D3D1D2D3HCS/G2→MG2→M、早期ＭSG1G1→SG1G1G1G1→SMultiplephases60某些CDK與周期蛋白配對(duì)關(guān)系及作用CDK種類可結(jié)合cyclCDK在細(xì)胞周期中連續(xù)合成，含量穩(wěn)定；cyclin的合成和降解隨細(xì)胞周期的進(jìn)程發(fā)生明顯變化。CDK

水平MPF水平

SMSMcyclin水平

CDK

、

cyclin和MPF三者的關(guān)系61CDK在細(xì)胞周期中連續(xù)合成，含量穩(wěn)定；cyclin的合成和6CdK1CdK1626CdK121細(xì)胞越過G1期的R點(diǎn)時(shí)，CycD-CdK4/6被激活后進(jìn)入細(xì)胞核，對(duì)RB蛋白進(jìn)行磷酸化，解除RB對(duì)轉(zhuǎn)錄因子E2F的抑制。E2F激活表達(dá)G1/S轉(zhuǎn)換和復(fù)制所需的一系列基因，產(chǎn)物包括CycE和E2F自身。CycE-CdK2結(jié)合，進(jìn)一步對(duì)RB進(jìn)行磷酸化，形成正反饋，激活復(fù)制相關(guān)基因的大量表達(dá)，實(shí)現(xiàn)復(fù)制的啟動(dòng)。63細(xì)胞越過G1期的R點(diǎn)時(shí)，CycD-CdK4/6被激活后進(jìn)入細(xì)復(fù)制開始后，CycD/E和復(fù)制啟動(dòng)因子迅速被CycA-Cdk2磷酸化并降解，從而防止復(fù)制的重復(fù)啟動(dòng)。復(fù)制期間的蛋白磷酸化主要由CycA-Cdk2控制。64復(fù)制開始后，CycD/E和復(fù)制啟動(dòng)因子迅速被CycA-Cdk

M期的啟動(dòng)M期的啟動(dòng)由于磷酸酶Cdc25解除了Cdk1的磷酸化抑制。CyclinA/B-Cdk1又稱為成熟促進(jìn)因子（MPF)。

CycA/B-Cdk1結(jié)合后具有Ser/Thr(絲氨酸/蘇氨酸)激酶活性，可使多種底物蛋白磷酸化。65M期的啟動(dòng)M期的啟動(dòng)由于磷酸酶Cdc25解CyclinA/BCdk1+有絲分裂染色質(zhì)凝集組蛋白H1p核纖層解體核膜破裂核纖層蛋白p降低與DNA結(jié)合的能力,促進(jìn)染色體的凝集某些DNA結(jié)合蛋白p細(xì)胞周期中微管動(dòng)力學(xué)變化微管蛋白p66CyclinA/BCdk1+有絲分裂組蛋白H1p核纖層解體核在細(xì)胞周期進(jìn)程中，多種蛋白或酶直接或間接地參與細(xì)胞周期事件的調(diào)控，編碼這些蛋白或酶的基因有規(guī)律、特異性的表達(dá)構(gòu)成細(xì)胞周期調(diào)控的遺傳基礎(chǔ)。細(xì)胞分裂周期基因(celldivisioncyclegene,Cdc)是一類產(chǎn)物表達(dá)具有細(xì)胞周期依賴性或直接參與細(xì)胞周期調(diào)控的基因，主要包括Cyclin,CdK等，此外DNA聚合酶基因、DNA連接酶基因均屬于Cdc基因。除Cdc基因外，在細(xì)胞周期調(diào)控中起著重要作用的另一大類基因還有癌基因和抑癌基因。它們的正常表達(dá)是細(xì)胞周期運(yùn)行所必須的，當(dāng)其發(fā)生突變或失活時(shí)，將導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖或癌變。67在細(xì)胞周期進(jìn)程中，多種蛋白或酶直接或間接地參與細(xì)胞周期事件的CyclinBCdc2CyclinBCdc2ppCyclinA&BCdc2pP107&E2FCDK2CyclinEP107&E2FCDK2CyclinACyclinD1,2&3PCNACDK4,6E2FRBE2FpRBCyclinHCDK7⊕Cdc25A⊕⊕WeelMiklS期G2

期G1

期M期Cdc25C⊕Ras,Rat,Myc,Fos,JunMyc⊕生長(zhǎng)因子限制點(diǎn)⊕p16p15TGFβp21p53p27TGFβ接觸抑制與癌瘤相關(guān)的蛋白68CyclinBCdc2CyclinBCdc2ppCyclin泛素化蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期的時(shí)相轉(zhuǎn)換：終止前一階段的事件；2.解除對(duì)后一階段事件的抑制。蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)可以選擇性地清除某些活性蛋白和抑制蛋白，為細(xì)胞周期的進(jìn)程掃清道路，保證細(xì)胞周期的方向。細(xì)胞內(nèi)的選擇性蛋白質(zhì)降解主要由泛素化蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)來完成。69泛素化蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期的時(shí)相轉(zhuǎn)換：蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)

泛素（ubiquitin)由76個(gè)氨基酸組成，高度保守，普遍存在于真核細(xì)胞，故名泛素。共價(jià)結(jié)合泛素的蛋白質(zhì)能被蛋白酶體識(shí)別和降解，這是細(xì)胞內(nèi)短壽命蛋白和一些異常蛋白降解的普遍途徑，泛素相當(dāng)于蛋白質(zhì)被摧毀的標(biāo)簽。26S蛋白酶體是一個(gè)大型的蛋白酶，可將泛素化的蛋白質(zhì)分解成短肽。泛素ubiquitin70泛素（ubiquitin)由76個(gè)氨基酸組成，高度保守，7130

蛋白