結(jié)核菌快速測定

關(guān)于結(jié)核菌快速測定第1頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五結(jié)核分枝桿菌結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)，俗稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌。可侵犯全身各器官，但以肺結(jié)核為最多見。結(jié)核病至今仍為重要的傳染病。估計(jì)世界人口中1/3感染結(jié)核分枝桿菌。據(jù)WHO報道，每年約有800萬新病例發(fā)生，至少有300萬人死于該病。我國建國前死亡率達(dá)200-300人/10萬，居各種疾病死亡原因之首，建國后人民生活水平提高，衛(wèi)生狀態(tài)改善，特別是開展了群防群治，兒童普遍接種卡介苗，結(jié)核病的發(fā)病率和死亡率大為降低。但應(yīng)注意，世界上有些地區(qū)因艾滋病、吸毒、免疫抑制劑的應(yīng)用、酗酒和貧困等原因，發(fā)病率又有上升趨勢。第2頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五TB形態(tài)第3頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五全球感染情況第4頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五實(shí)驗(yàn)診斷檢測方法常規(guī)檢測方法分子生物學(xué)檢測方法第5頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五常規(guī)檢測方法一個月二個月三個月第6頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五分子生物學(xué)檢測（PCR）方法第7頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五回顧RNA與DNA第8頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五RNAVsDNARNA-核糖核酸只存在於活細(xì)胞非常脆弱，環(huán)境中存在水解酶（RNase）單鏈結(jié)構(gòu)DNA-脫氧核糖核酸非常穩(wěn)定，在死亡生物內(nèi)也可存在雙鏈結(jié)構(gòu)第9頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五結(jié)核菌快速測定GenprobLeader-50i第10頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五方法

方法名稱：HPV（HybridizationProtectionAssay）-雜交保護(hù)分析法為Gen-probe公司專利檢測設(shè)備：LEADER50i第11頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五

不同方法結(jié)核菌檢測報告時間

羅氏（LJ）培養(yǎng):2-8周HPA-MTD:2.5h報告

直接從標(biāo)本中檢測結(jié)核菌HPA-Accuprobe:<1h報告

用菌落或自動培養(yǎng)系統(tǒng)的菌液第12頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五HPA-MTD方法檢測TB第13頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五優(yōu)勢（一）靶分子選取核糖體RNA-RIBOSOMALRNA

rRNA作為靶分子好處：生物擴(kuò)增提高靈敏度靶位獨(dú)特的核酸次序保證檢測特異性靶分子:rRNA第14頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五優(yōu)勢（二）敏感度

10000套r-RNACATATATGCGCATTAATCGTAGCGCGCATATGCTACGTADNARNA聚合酶(eg:E.coli)第15頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五樣本前處理樣本細(xì)胞溶解目標(biāo)r-RNA釋放第16頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五雜交AE60°C雜交體rRNAAEAEAEAEAEAEAE探針15分鐘第17頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五選擇60°C選擇性試劑AEAEAEAEAEAEAEAE第18頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五ATATRAINING/TP/Nov9719PMTPhotomultiplicator注射1注射2CPU微機(jī)處理器顯示打印機(jī)鍵盤化學(xué)發(fā)光讀數(shù)儀/原理結(jié)果測定第19頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五MTD結(jié)核分枝桿菌的直接檢測意義TB與其他分枝桿菌區(qū)分

AIDS患者鳥分枝桿菌小腸黏膜感染龜分枝桿菌引起嚴(yán)重院內(nèi)感染（南方某醫(yī)院）TB耐藥基因

發(fā)現(xiàn)并監(jiān)測耐藥菌株，為醫(yī)生提供有效治療TB復(fù)燃方案提高TB檢出率

CSF、胸腹水等疑似患者

長期低熱、ESR持續(xù)增快，排除腫瘤和免疫性疾病患者，做血、痰TB菌PCR第20頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五Gen-Probe結(jié)核分枝桿菌檢測分析儀特點(diǎn)采用分子技術(shù)快速鑒定（2.5小時）結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群；標(biāo)本可以是涂片陰性或者陽性的痰標(biāo)本；也可以是培養(yǎng)物。唯一獲得FDA推薦的凃陰樣本快速檢測技術(shù)檢測RNA，RNA只能來源于活的細(xì)菌，可鑒定活動性結(jié)核病人）采用TMA恒溫擴(kuò)增，不使用PCR儀器，無需專業(yè)的PCR實(shí)驗(yàn)室認(rèn)證HPA雜交保護(hù)分析技術(shù)：靈敏、特異嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室防污染技術(shù)：整個實(shí)驗(yàn)過程所有試劑和樣本全部在同一個反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行，杜絕交叉污染。第21頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五GenoType?MTBDRplus

結(jié)核菌藥敏試驗(yàn)第22頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五采用線性探針技術(shù)（Line-Probe或稱DNA-Strip）檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群利福平(rpoB)和異煙肼(katG和inhA)等結(jié)核治療藥物的耐藥基因來判斷TB體內(nèi)耐藥性基本原理第23頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五異煙肼：katG和inhA基因katG基因：編碼觸酶-過氧化物酶40-100%異煙肼耐藥是由該基因突變引起且為高水平耐藥inhA基因：編碼NADH烯?；鵄CP還原酶25%異煙肼耐藥是由該基因突變引起且為低水平耐藥GenoType?MTBDRplus檢測舉例第24頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五分枝桿菌復(fù)合群中的耐藥基因第25頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五DNA提取PCR擴(kuò)增探針雜交結(jié)果判斷檢測過程

第26頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五DNA提取標(biāo)本固體或液體培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌種抗酸染色涂片陽性標(biāo)本方法超聲波裂解：GenoLyse試劑盒：第27頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五PCR擴(kuò)增

不同標(biāo)本,擴(kuò)增參數(shù)不同培養(yǎng)菌種：擴(kuò)增20個循環(huán)涂陽標(biāo)本：擴(kuò)增30個循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物：擴(kuò)增過程標(biāo)記生物素(Bio-11-dUTP、Bio-7-dATP、Bio-11-dCTP

?)第28頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五采用反向雜交方法PCR擴(kuò)增產(chǎn)物→變性（DNA成單鏈）→與探針雜交→洗滌→顯色→判斷結(jié)果雜交第29頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五

雜交試劑第30頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五TwinCubator?（可做12個條）雜交儀（手工,12條）第31頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五GT-Blot?20

雜交儀（自動,20條）第32頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五GT-Blot?48雜交儀（自動,48條）第33頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五

野生型：有雜交帶顯色為“+”，表示未發(fā)生突變耐藥突變位點(diǎn)：有雜交帶顯色為“+”，表示發(fā)生突變結(jié)果判斷第34頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五敏感：所有野生型探針“+”和所有耐藥位點(diǎn)探針“—”耐藥：對應(yīng)藥物有1條野生型探針“—”或有1條耐藥位點(diǎn)“+”結(jié)果解釋第35頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五結(jié)果解釋第36頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五MTD試驗(yàn)與其它試驗(yàn)方法性能比較涂陽（+）患者的結(jié)果比較檢測敏感性特異性陽性預(yù)測值（PPV）陰性預(yù)測值（NPV）患者數(shù)MTD96.9%(31/32)100%(7/7)100%(31/31)87.5%(7/8)39[83.8%-99.9%][59.0%-100%][88.8%-100%][47.3%-99.7%]BACTEC96.9%(31/32)100%(7/7)100%(31/31)87.5%(7/8)39[83.8%-99.9%][59.0%-100%][88.8%-100%][47.3%-99.7%]LJ

87.5%(28/32)100%(7/7)100%(28/28)63.6%(7/11)39[71.0%-96.5%][59.0%-100%][87.7%-100%][30.8%-89.1%]7H10/96.7%(29/30)100%(7/7)100%(29/29)87.5%(7/8)377H11[82.8%-99.9%][59.0%-100%][88.1%-100%][47.3%-99.7%]第37頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五MTD試驗(yàn)與其它試驗(yàn)方法性能比較涂陰（—）患者的結(jié)果比較檢測敏感性特異性陽性預(yù)測值（PPV）陰性預(yù)測值（NPV）患者數(shù)MTD72%(18/25)99.3%(141/142)94.7%(18/19)95.3%(141/148)167[50.6%-87.9%][96.1%-100%][74.0%-99.9%][90.5%-98.1%]BACTEC68.0%(17/25)100%(142/142)100%(17/17)94.7%(142/150)167[46.5%-85.1%][97.4%-100%][80.5%-100%][89.8%-97.7%]LJ

72.0%(18/25)100%(135/135)100%(18/18)95.1%(135/142)160[50.6%-87.9%][97.3%-100%][81.5%-100%][90.1%-98.0%]7H10/60.0%(15/25)100%(142/142)100%(15/15)93.4%(142/152)1677H11[38.7%-78.9%][97.4%-100%][78.2%-100%][88.2%-96.8%]第38頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五WHO、蓋茨基金會推薦使用的快速線性探針技術(shù)，可以在6小時內(nèi)給出藥敏鑒定結(jié)果；可以做一線結(jié)核藥物（異煙肼利福平）、二線結(jié)核藥物的耐藥檢測（乙胺丁醇、氟喹諾酮類藥物、可注射結(jié)核藥物）；標(biāo)本是涂片陽性的痰標(biāo)本，或者是培養(yǎng)物；技術(shù)步驟簡單：核酸提取、PCR擴(kuò)增、核酸雜交儀檢測；核酸雜交儀有三款可選擇：手工型（12個樣本）、GTBlot20（20個樣本）和GTBlot48（48個樣本）；每個試劑條上自帶質(zhì)控：CC雜交質(zhì)控、AC擴(kuò)增質(zhì)控、TUB結(jié)核分枝桿菌質(zhì)控，確保整個實(shí)驗(yàn)流程的可信度；HAIN-結(jié)核分枝桿菌耐藥快速檢測系統(tǒng)特點(diǎn)第39頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五Genprobe&Hain產(chǎn)品市場段結(jié)核病?？漆t(yī)院(胸科、結(jié)核病醫(yī)院、結(jié)核病防治中心)三級及以上綜合性醫(yī)院監(jiān)獄管理局醫(yī)院腫瘤專科醫(yī)院精神病醫(yī)院戒毒所CDC、CIQ、畜牧業(yè)……第40頁，共44頁，2022年，5月20日，19點(diǎn)37分，星期五結(jié)核分子診斷技術(shù)VIP用戶北京醫(yī)院北京朝陽醫(yī)院西安