生物化學(xué)視頻專輯

生命現(xiàn)象的執(zhí)行者蛋白質(zhì)與核酸是體內(nèi)主要的生物大分子第一節(jié)

生命的物質(zhì)基礎(chǔ)-蛋白質(zhì)一、蛋白質(zhì)是構(gòu)成生物體的基本成分蛋白質(zhì)（protein）是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是構(gòu)成生物體的基本成分，生命現(xiàn)象的執(zhí)行者。的45%為蛋白質(zhì)，脾、肺、肌肉含量均超過(guò)80%，細(xì)菌的含量為50~80%，干酵母的含量為46.6%。二、蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的多樣性蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能作為生物催化劑調(diào)節(jié)代謝反應(yīng)載體參與機(jī)體的運(yùn)動(dòng)參與機(jī)體的防御接受傳遞信息控制生長(zhǎng)和分化生物膜的功能沒(méi)有蛋白質(zhì)就沒(méi)有生命。藥學(xué)領(lǐng)域?很多蛋白質(zhì)本身就為藥物（如一些多肽、激素等）；?即使有效成分不是蛋白質(zhì)，但在提取、分離時(shí)必然遇到有關(guān)蛋白質(zhì)的處理問(wèn)題；?

蛋白質(zhì)的研究對(duì)有關(guān)藥物的生產(chǎn)、

、分析和應(yīng)用等也具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。第二節(jié)

蛋白質(zhì)的化學(xué)組成一、蛋白質(zhì)的元素組成蛋白質(zhì)平均含N量為16％，這是凱氏定氮法測(cè)蛋白質(zhì)含量的理論依據(jù)：蛋白質(zhì)含量＝蛋白質(zhì)含N量×6.25蛋白質(zhì)主要元素組成：C、H、O、N、S

及P、Fe、Cu、Zn、Mn、I、Se

等。含量%：元素組成：

N組成蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位是什么呢？蛋白質(zhì)的水解酸水解、堿水解、蛋白酶水解二、蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位—氨基酸20種蛋白質(zhì)氨基酸。（一）氨基酸的結(jié)構(gòu)COOHR

group氨基羧基L-Form

Amino

AcidR=H

-GlycineR=CH3-AlanineH2

NH從氨基酸的結(jié)構(gòu)通式可以看出：α-氨基酸（甘氨酸）α-碳原子都是不對(duì)稱的，可形成不同的構(gòu)型，

旋光性。天然蛋白質(zhì)中基本氨基酸均為L(zhǎng)-型。CHH2NCOOHR組成蛋白質(zhì)的氨基酸都為L(zhǎng)型（Gly除外）非極性氨基酸極性氨基酸極性不帶電荷的氨基酸帶負(fù)電荷帶正電荷的氨基酸組成蛋白質(zhì)的氨基酸共有20

種不同的aa

在于R基團(tuán)的不同1.由R基團(tuán)的極性性質(zhì)（二）氨基酸的分類I非極性氨基酸（八種）丙氨酸

AlaCH3C

COOHHNH2CHCHCOOHNH2CH3CH3纈氨酸

ValC

COOHHNH2CH3CH3CH

CH2亮氨酸

Leu異亮氨酸

IleCOOHNH2HCH

CCH3CH2CH3I非極性氨基酸（八種）脯氨酸

ProCOOHNHCH2HCH2

CCH2苯丙氨酸

PheHC

COOHNH2CH2CH2C

COOHHNH2色氨酸

TrpNH甲硫氨酸

MetCOOHNH2HCH2

CCH2CH3

SII極性不帶電荷的氨基酸（七種）COOHCH蘇氨酸

ThrCH3

NH2HO

CH絲氨酸

SerHC

COOHNH2CH2HO半胱氨酸

CysCOOHHCNH2CH2HS酪氨酸

TyrCOOHHCNH2CH2HO

II極性不帶電荷的氨基酸（七種）天冬酰胺

AsnHC

COOHNH2CH2OH2

CNCOOHHNH2谷氨酰胺

GlnOH2

CNCH2

CH2

C甘氨酸

GlyCOOHHCNH2HIII帶負(fù)電荷的氨基酸（兩種）天冬氨酸

AspHC

COOHNH2CH2OHO

CHNH2谷氨酸

GluOHO

CCH2

CH2

C

COOHIV帶正電荷的氨基酸（三種）賴氨酸

LysCOOHHCNH2H2N

(CH2)4精氨酸

ArgHC

COOHNH2NH

(

CH2)3NHH2

CNCOOHHNH2組氨酸

HisCH2

CHN

N1.稀有的蛋白質(zhì)氨基酸通常是常見(jiàn)氨基酸的衍生物如4羥脯氨酸、5羥賴氨酸稀有氨基酸2.非蛋白質(zhì)氨基酸以游離或結(jié)合態(tài)存在細(xì)胞或組織中，大部分是常見(jiàn)氨基酸的衍生物或異構(gòu)型。鳥(niǎo)氨酸、胍氨酸、高絲氨酸、β-丙氨酸、

γ-氨基丁酸等。形態(tài)：溶解性：：（三）氨基酸的性質(zhì)pI

是氨基酸的特征常數(shù)COO-H3N+C

H

R-H+

pK1'+

H+H3N+COOH

C

H

R+

H+-H+

pK2'COO-

H2N

C

HR2.化學(xué)性質(zhì)–氨基酸的兩性解離與等電點(diǎn)氨基酸的等電點(diǎn)（isoeletric

point）氨基酸的等電點(diǎn)：當(dāng)溶液濃度為某一pH值時(shí)，氨基酸分子中所含的-NH3

和-COO

數(shù)目正好相+

-等，凈電荷為0。這一pH值即為氨基酸的等電點(diǎn)，簡(jiǎn)稱pI。在等電點(diǎn)時(shí)，氨基酸既不向正極也不向負(fù)極移動(dòng)，pH變化時(shí)，遷移發(fā)生變化。氨基酸的R基團(tuán)含有共軛雙鍵，具有紫外吸收特性，在280nm處具有最大吸收值。2.化學(xué)性質(zhì)–紫外吸收性質(zhì)在加熱條件及弱酸環(huán)境下，氨基酸與茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處，利用該性質(zhì)進(jìn)行比色測(cè)定氨基酸含量2.化學(xué)性質(zhì)–茚三酮反應(yīng)（四）氨基酸的生理功能寡肽、多肽的組成單位多種生物活性物質(zhì)的前體：NO前體—精氨酸；褪黑色素前體-色氨酸。作為神經(jīng)遞質(zhì)氧化分解產(chǎn)生ATP作為糖異生的前體蛋白質(zhì)是具有三

結(jié)構(gòu)的高分子物質(zhì)，根據(jù)蛋白質(zhì)肽鏈的折疊方式和復(fù)雜程度，將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分為…….123蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次4Mathewset

al

(2000)

Biochemistry

(3e)

p.195蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的層次一級(jí)結(jié)構(gòu)氨基酸序列二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由氫鍵穩(wěn)固的局部構(gòu)象，如-helix,-sheet等三級(jí)結(jié)構(gòu)一條多肽鏈中所有原子或基團(tuán)在三 的整體排布四級(jí)結(jié)構(gòu)多個(gè)多肽鏈的組合一、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)指蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的氨基酸排列順序，包括二硫鍵的位置。IleAlaSerLeuPhe

TyrThr

LeuAsn

—COO-His

LysH3N+—

GlyVal

Cys

Glu

GlnSSPro

Val

Cys

Arg

AspLys蛋白質(zhì)分子中氨基酸是如何連接的呢？一、肽鍵與肽鏈一個(gè)氨基酸的羧基與另一個(gè)氨基酸的氨基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。二肽，多肽。氨基酸殘基。COOHNH1

2OC

NH21兩個(gè)氨基酸分子頭尾連接起來(lái)肽鍵的形成以肽鍵為平面連接成多肽長(zhǎng)鏈兩肽鍵平面的交接點(diǎn)為α

-碳注意：α

-碳上面接有各種大小不等的基團(tuán)肽鏈中AA的排列順序和命名在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序通常在多肽鏈的一端含有一個(gè)游離的-氨基，稱為氨基端或N-端；在另一端含有一個(gè)游離的-羧基，稱為羧基端或

C-端。氨基酸的順序是從N-端的氨基酸殘基開(kāi)始，以C-端氨基酸殘基為終點(diǎn)的排列順序。如上述五肽可表示為：Ser-Gly-Tyr-Ala-Lue二、蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)指蛋

白質(zhì)多肽鏈中AA的排列順序以及多肽鏈內(nèi)或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。如何測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)：氨基酸序列：Edman

degradationF.

Sanger

(Cambridge

U.)由cDNA

序列反推氨基酸序列：DNA

定序法：F.Sanger分析多肽鏈的N-末端和C－末端殘基(二硝基氟苯法,丹酰氯法)用兩種不同的裂解方式裂解多肽鏈為較小片段測(cè)定各片段的氨基酸順序用片段 法重新建立完整多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)拆分蛋白質(zhì)分子中的多肽鏈測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目蛋白質(zhì)末端分析或SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定多肽鏈的氨基酸組成(鹽酸水解,氨基酸分析儀分析)測(cè)序戰(zhàn)略非共價(jià)鍵（需要用變性劑尿素或SDS）二硫鍵需要用氧化法或還原法末端氨基酸測(cè)定專一性裂解將肽段分離并測(cè)出順序?qū)㈦亩雾樞蜻M(jìn)行疊聯(lián)以確定完整的順序二硫鍵拆開(kāi)純蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)順序測(cè)定基本路線測(cè)定步驟A.測(cè)定蛋白質(zhì)分子中多肽鏈的數(shù)目蛋

通過(guò)測(cè)定末端氨基酸殘基數(shù)與蛋白質(zhì)分白質(zhì)

子量可確定多肽鏈的數(shù)目。—級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定測(cè)定步驟B.多肽鏈的拆分由多條多肽鏈組成的蛋白質(zhì)分子，必須先進(jìn)行拆分。可用8mol/L尿素或

6mol/L鹽酸胍處理，即可分開(kāi)多肽鏈(亞基)。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定測(cè)定步驟蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定C.

二硫鍵的斷裂幾條多肽鏈通過(guò)二硫鍵交聯(lián)在一起?？稍?/p>

8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過(guò)量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑（ICH2COOH）保護(hù)生成的巰基，以防止它重新被氧化。胰島素-巰基乙醇碘乙酸二硫鍵的斷裂D.分析每條多肽鏈的氨基酸組成經(jīng)分離、純化的多肽鏈一部分樣品進(jìn)行完全水解，離子交換柱層析分離測(cè)定氨基酸組成。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定測(cè)定步驟測(cè)定步驟E.分析多肽鏈的N-末端和C-末端殘基以便建立兩個(gè)重要的氨基酸序列參考點(diǎn)N末端

二硝基氟苯（DNFB）法丹磺酰氯（DNS）法Edman降解法氨肽酶法C末端

肼解法還原法

羧肽酶蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定Edman降解法（苯異硫

酸酯法）主要涉及三步反應(yīng)：偶聯(lián)反應(yīng)、環(huán)化斷裂反應(yīng)、轉(zhuǎn)化反應(yīng)。此法的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。脫去N末端氨基酸后，剩下的肽鏈仍然是完整的。N末端基氨基酸測(cè)定苯乙內(nèi)酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸）利用各種層析技術(shù)分離該物質(zhì)在268nm處有最大的吸收值。苯異硫 酸酯（PITC)偶聯(lián)、環(huán)化斷裂、轉(zhuǎn)化多肽與肼在無(wú)水條件下加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來(lái)，其余的氨基酸則變成肼化物。肼化物能夠與苯 縮 不溶于水的物質(zhì)而與C-端氨基酸分離。C末端基氨基酸測(cè)定①肼解法R

OH2N

CH

CRn

OHN

CH

C

OHR

n-1OHN

CH

CN-端氨基酸C-端氨基酸Rn

OCH

C

OHR

OCH

C

NHNH2+H2NH+NH2NH2

H2N氨基酸酰肼C-端氨基酸羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的C-端逐個(gè)水解。目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和Y；羧肽酶A能水解脂肪族或芳香族氨基酸（Pro除外）C-末端肽鍵；B只能水解由堿性氨基酸構(gòu)成的C-末端肽鍵；C水解C-末端的Pro

；Y能切斷各種氨基酸在C-末端的肽鍵，是一種最適用的羧肽酶。C末端基氨基酸測(cè)定②羧肽酶法測(cè)定步驟F.多肽鏈斷裂成多個(gè)肽段可采用兩種或多種不同的斷裂方法（斷裂點(diǎn)不同）將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段，并將其分離開(kāi)來(lái)。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定多肽鏈斷裂法：酶解法和化學(xué)法

酶解法:胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、羧肽酶和氨肽酶溴化

水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵。多肽鏈的選

化學(xué)法：(Cyanogen

bromide)擇性降解測(cè)定步驟蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定G.測(cè)定每個(gè)肽段的氨基酸順序Edman（苯異硫

酸酯法）氨基酸順序分析法測(cè)定步驟H.確定肽段在多肽鏈中的次序利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯(cuò) ，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定借助

肽確定肽段次序：末端殘基

H末端肽段

HOWTSAPS

（OUS）第一套肽段

HOWT

OUS

EOVE

RLA

PS第二套肽段

HO

WTOU

SEO

VERL

APS推斷全順序

HOWTOUSEOVERLAPS氨基末端殘基H羧基末端殘基S第二套肽段SEO

WTOU

VERL

APSHO第一套肽段OUS

PS

EOVERLA

HOWT片段重疊法確定肽段在多肽鏈中順序示意所得資料舉例核酸推導(dǎo)法原理：蛋白質(zhì)的氨基酸順序是由核酸的核苷酸順序決定的。測(cè)出核酸的核苷酸順序根據(jù)三個(gè)核苷酸確定一個(gè)氨基酸的推導(dǎo)出蛋白質(zhì)的氨基酸順序蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象又稱空間結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)、高級(jí)結(jié)構(gòu)、三維構(gòu)象等，是指蛋白質(zhì)分子中原子和基團(tuán)在三上的排列、分布及肽鏈的。蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象取決于一級(jí)結(jié)構(gòu)，是蛋白質(zhì)生物學(xué)功能或活性所必需的。蛋白質(zhì)的構(gòu)象可分為二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)。二、蛋白質(zhì)的構(gòu)象123蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次4Mathewset

al

(2000)

Biochemistry

(3e)

p.195蛋白質(zhì)的構(gòu)象如何維持？非共價(jià)鍵（次級(jí)鍵）（一）維持蛋白質(zhì)構(gòu)象的化學(xué)鍵非共價(jià)鍵（又稱為次級(jí)鍵或副鍵）決定生物大分子和分子復(fù)合物的高級(jí)結(jié)構(gòu)，在分子識(shí)別中起著關(guān)鍵的作用。氫鍵、疏水鍵、鹽鍵、二硫鍵和力氫鍵的形成常見(jiàn)于連接在一電負(fù)性很強(qiáng)的原子上的氫1.氫鍵(hydrogen

bond)氫鍵(hydrogen

bond)氫鍵作用弱，但數(shù)量多，在維系蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定上起著重要的作用，主鏈骨架羰基的氧原子與亞氨基的氫原子形成的氫鍵是維持蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要次級(jí)鍵。2.疏水鍵（hydrophobic

bond）疏水鍵是由兩個(gè)非極性基團(tuán)為避開(kāi)水相而聚集在一起的作用力。蛋白質(zhì)分子中許多氨基酸殘基側(cè)鏈?zhǔn)欠菢O性的，這些非極性基團(tuán)在水中相互 而形成疏水鍵，是維持蛋白質(zhì)三、四級(jí)結(jié)構(gòu)的主要作用力。三級(jí)結(jié)構(gòu)中