DB15T 2554-2022發(fā)酵番茄渣中益生性乳酸菌的分離與鑒定技術(shù)規(guī)程

ICS67.080.01CCSICS67.080.01CCSX10內(nèi)蒙古自治區(qū)地方標(biāo)準(zhǔn)DB15/T2554—2022發(fā)酵番茄渣中益生性乳酸菌的分離與鑒定技術(shù)規(guī)程TechnicalregulationfortheisolationandidentificationofTechnicalregulationfortheisolationandidentificationofprobioticlacticacidbacteriaderivedfromfermentedtomatopomace2022-04-252022-05-25內(nèi)蒙古自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布前 言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由內(nèi)蒙古自治區(qū)畜牧業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（SAM/TC19）歸口。本文件起草單位：內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院、內(nèi)蒙古大學(xué)。發(fā)酵番茄渣中益生性乳酸菌的分離與鑒定技術(shù)規(guī)程范圍本文件適用于發(fā)酵番茄渣中益生性乳酸菌的分離與鑒定。（GB4789.35食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。益生性乳酸菌lacticacidbacteria(LAB）能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸、無(wú)芽孢且具有益生性能的革蘭氏染色陽(yáng)性細(xì)菌的總稱。發(fā)酵番茄渣tomatopomace生產(chǎn)番茄醬(汁)后的番茄渣（主要由果皮、種子和少量的殘余果肉組成）經(jīng)微生物發(fā)酵后的產(chǎn)物。序列比對(duì)sequencealignment進(jìn)化樹(shù)evolutionarytrees通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析所推斷出來(lái)的進(jìn)化關(guān)系一般用分枝圖表即進(jìn)化樹(shù)來(lái)描述，這個(gè)進(jìn)化樹(shù)就描述了同一譜系的進(jìn)化關(guān)系，包括了分子進(jìn)化、物種進(jìn)化以及分子進(jìn)化和物種進(jìn)化的綜合。4材料番茄渣來(lái)源來(lái)自工廠的新鮮番茄渣。發(fā)酵番茄渣的制備與保存100g330d、60d90d30d、60和905操作規(guī)程菌株（EcheichacliCC259（SaphlocccusaureusATC252試驗(yàn)菌：從發(fā)酵番茄渣中分離出的乳酸菌。細(xì)胞Caco-2細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。電子天平（感量0.01g），超純水系統(tǒng)，高壓蒸汽滅菌鍋（137℃，0.25MPa），超低溫冰箱（-50℃～-86℃（40x～640x），pH計(jì)，PCR（200008℃～10）。試劑MRS瓊脂培養(yǎng)基，MRS肉湯，MEM培養(yǎng)液，腦心浸出液培養(yǎng)基，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，AgaroseGelDNAExtractionKit，EcoT14digestDNAMarker，DL2000DNAMarker，TaqDNA聚合酶，瓊脂糖，胎牛血清，青鏈霉素雙抗，PBS緩沖液，胃蛋白酶，胰蛋白酶，膽鹽，甘油、過(guò)氧化氫、氯化鈉、濃鹽酸、巰基乙酸鈉、丙酮酸鈉、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、甲醇等均為分析純。耗材T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，90mm培養(yǎng)皿，15mL/50mL離心管，500mL/250mL錐形瓶，0.22μM濾膜，牛津杯，加樣器，棉拭子等。見(jiàn)附錄A。稱取10.090mL30minMRS48MRS將已經(jīng)分離的菌株在MRS平板上反復(fù)劃線純化。將純化的單菌落接種于MRS肉湯中，37℃厭氧條件下培養(yǎng)24h，將菌液與60%的無(wú)菌甘油以7：3的比例混勻，密封后放置在渦旋震蕩儀上震蕩混勻，-80℃保存。乳酸菌鑒定按GB4789.35的規(guī)定操作。DNA取出-80℃凍存的乳酸菌菌株，室溫融化后用接種環(huán)挑取適量菌液，采用三區(qū)劃線法在MRS平板上劃線進(jìn)行活化。用接種環(huán)挑取單菌落到MRS肉湯中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃厭氧培養(yǎng)18h用于DNA的提取，方法參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。擴(kuò)增DNA16SrDNA16SrDNAF5-GATTTATTGGCTA-3492R-TCCTGTTCGAT-322PCR50L：TmplteN2；dNTPmitu，4μTaq(5UμL-1)，0.25μL；10×PCRbuffer(Mg2+-free)，5μL；MgCl(25μmolL-1)，3μL；27F(10μmolL-11μL；1492R(10μmolL-1)，1μL；ddHO，33.75μL。22PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min，共30個(gè)循環(huán)；72℃10min。測(cè)序PCR1500bpPCRAgaroseGelDNAExtractionKit利用Blast(/Blast.cgi)將待測(cè)菌株的16SrDNA序列與Genbank16SrDNAClustalX1.83MEGA5.05neighbor-joiningBacillussubtilisNCDO1769Bootstrap1000。MRS5mL，1000g離心10min5mL無(wú)菌1mL9mL37℃培養(yǎng)，在0、3h度稀釋涂板計(jì)數(shù)計(jì)算存活率，每種菌3個(gè)重復(fù)。存活率=3h的菌落數(shù)/0h的菌落數(shù)×100%，存活率大于10%即認(rèn)定為可以耐受胃酸的環(huán)境。MRS5%0.00.30.5MRS-THIO37℃厭氧培養(yǎng)24ODOD/OD值×100%，10Caco-2Caco-2從液氮中取出Caco-2細(xì)胞凍存管，立即放入40℃的水浴中搖晃融化。將細(xì)胞懸液吸入裝有8mL培養(yǎng)液的離心管中，300g離心8min，棄上清后加入12mL的新鮮培養(yǎng)液，用移液槍吹打均勻后加到培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。80%～90PBS1mL～2mL37℃放置2min300離心8(2PBS洗次MRS24。1000g10min3MEM1.0×108CFU/mL，1mL.2637℃培養(yǎng)3hPBS洗5303MRS37℃厭氧培養(yǎng)24g10min上清。80EscherichiacoliStaphylococcusaureusLB37，37℃培養(yǎng)24h100μLEscherichiacoliStaphylococcusaureus3100μL菌液，37℃培養(yǎng)24h（mm）5.40±0.20即可認(rèn)定為具有抑菌能力，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑大于等于15.50±0.10附錄A（表A.1規(guī)定了溶液配制方法。表A.1溶液配制溶液名稱成分制備人工胃液氯化鈉2g胃蛋白酶3.5g1000mL1N鹽酸調(diào)pH至3.0，過(guò)濾除菌，4℃保存。MRS-THIO培養(yǎng)基100mLMRS0.2