南醫(yī)大藥物分析第15章-甾體激素類藥物的分析2015幻燈片

《藥物分析》

第十五章甾體激素類藥物的分析藥學(xué)院藥物分析系鄭艷潔古人提煉秋石—古之春藥觀察時代甾體激素的發(fā)展布特南德-1929年提取純凈雌酮化學(xué)時代明代宦官塑像基本結(jié)構(gòu)：環(huán)戊烷并多氫菲ABCD12345678910111213141516171819田巛環(huán)上雙鍵的表示方法：用“”表示,雙鍵的位置寫在的右上角。雙鍵位置4

1,4

5

5(10)

分類：甾體激素腎上腺皮質(zhì)激素性激素雄性激素及蛋白同化激素孕激素雌性激素還原性UV、與羰基試劑反應(yīng)氫化可的松（天然型）腎上腺皮質(zhì)激素醋酸地塞米松腎上腺皮質(zhì)激素潑尼松腎上腺皮質(zhì)激素雄性激素甲睪酮UV、與羰基試劑反應(yīng)可成酯丙酸睪酮雄性激素蛋白同化激素苯丙酸諾龍?jiān)屑に攸S體酮UV、與羰基試劑反應(yīng)可與亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)(專屬鑒別)雌二醇雌性激素UV、與重氮苯磺酸鹽反應(yīng)炔雌醇可與硝酸銀反應(yīng)雌性激素它屬于什么類型的激素？左炔諾孕酮Answer：睪酮類強(qiáng)效孕激素米非司酮（孕激素受體拮抗劑）知識拓展：用途：與前列腺素醇合用→堿性（高氯酸滴定）藥流一、結(jié)構(gòu)與性質(zhì)1.腎上腺皮質(zhì)激素主要活性基團(tuán)性質(zhì)△4–3–酮UV、與羰基試劑反應(yīng)

C17

–

α–醇酮基還原性2.雄性激素及蛋白同化激素主要活性基團(tuán)性質(zhì)△4–3–酮UV、與羰基試劑反應(yīng)

C17–

β–羥基可成酯3.孕激素主要活性基團(tuán)性質(zhì)△4–3–酮UV、與羰基試劑反應(yīng)C17–甲酮基與亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)C17–乙炔基與AgNO3反應(yīng)4.雌激素主要活性基團(tuán)性質(zhì)A環(huán)為3–OH苯環(huán)UV、與重氮苯磺酸鹽反應(yīng)C17–乙炔基與AgNO3反應(yīng)C17–羥基可成酯二、鑒別試驗(yàn)（一）物理常數(shù)的測定1、熔點(diǎn)2、比旋度3、吸收系數(shù)（二）與強(qiáng)酸的呈色反應(yīng)甾體激素類藥物呈色H2SO4H3PO4HClO4HCl（母核）與硫酸顯色反應(yīng)

顯色熒光加水稀釋潑尼松龍深紅

絮狀↓灰潑尼松橙

黃→藍(lán)綠炔雌醚橙紅

黃綠

↓紅色

炔雌醇橙紅

黃綠

絮狀↓玫紅醋酸可的松黃或微褪色并澄

帶橙清（三）官能團(tuán)的反應(yīng)1、C17

–

α–醇酮基有強(qiáng)還原性，與氧化劑作用，被氧化成水合醛。（三）官能團(tuán)的反應(yīng)腎上腺皮質(zhì)激素藥物呈色四氮唑鹽OHˉ1、C17

–

α–醇酮基還原性A.呈色反應(yīng)腎上腺皮質(zhì)激素藥物Cu2O↓橙紅色堿性酒石酸銅B.沉淀反應(yīng)Ag↓黑色氨制硝酸銀甾酮類激素藥物呈色羰基試劑2.C3–酮基和C20–酮基＃常用的羰基試劑：2,4-二硝基苯肼、異煙肼、硫酸苯肼異煙腙（黃色）睪酮黃體酮異煙雙腙（黃色）具有甲酮基或活潑亞甲基的甾體激素類藥物呈色亞硝基鐵氰化鈉間二硝基酚芳香醛3.甲酮基黃體酮藍(lán)紫色亞硝基鐵氰化鈉其他甾體淡橙色不顯色黃體酮藍(lán)紫色

活潑亞甲基反應(yīng)（Zimmermann反應(yīng)）羰基鄰位的亞甲基叫活潑次甲基。

羰基C3、C11、C20亞甲基C2、C12、C21羰基C17亞甲基C16有機(jī)氟Fˉ有機(jī)破壞有機(jī)氯Clˉ4.有機(jī)鹵素茜素氟藍(lán)硝酸亞鈰硝酸—硝酸銀AgCl↓呈色茜素氟藍(lán)藍(lán)紫色F-雌激素類藥物紅色偶氮染料重氮苯磺酸5.酚羥基含炔基的甾體激素銀鹽沉淀硝酸銀6.乙炔基↓炔雌醇白香（四）水解產(chǎn)物的反應(yīng)特臭特臭△４-3-酮240nm苯環(huán)280nm（五）UV法醋酸甲地孕酮(288nm)3300～3000cm-13000～2700cm-11900～1650cm-11650～1450cm-11000～650cm-1（七）IR法3750～3300cm-1ν醋酸可的松結(jié)構(gòu)特征：△4–3–酮、C17–OHC20–酮基、C11–酮基、醋酸酯1630cm-1ν3420cm-1亞甲基、角甲基吸收帶1750cm-11232cm-11052cm-1結(jié)構(gòu)特征：△4–3–酮、C17–OHC17–乙炔基炔諾酮H1650cm-1ν3300cm-3270cm-1ν1615cm-1結(jié)構(gòu)特征：酚羥基、C17–OHC17–乙炔基炔雌醇1505cm-1ν3505cm-13300cm-1ν1590cm-13610cm-1ν酚羥基醇羥基1615cm-1苯環(huán)的骨架振動（八）TLC法主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別方法：對照品法要求供試品溶液所顯主斑點(diǎn)的顏色和位置與對照品溶液的主斑點(diǎn)相同。（九）HPLC法主要用于甾體激素類藥物制劑的鑒別（如：醋酸曲安奈德軟膏、醋酸氟輕松軟膏）方法：對照品法要求在含量測定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品峰的tR與對照品峰的tR一致。三、雜質(zhì)檢查（一）有關(guān)物質(zhì)定義與標(biāo)示藥物結(jié)構(gòu)不同的甾體化合物都稱為“有關(guān)物質(zhì)”Li/NH3C2H5OH弱酸雌二醇－3－甲醚苯丙酸諾龍的合成路線III強(qiáng)酸苯丙酰氯HClIII特點(diǎn)（1）可能存在多個甾體雜質(zhì)（2）結(jié)構(gòu)類似2.來源原料、中間體、異構(gòu)體、降解產(chǎn)物4.方法（具有一定分離能力）TLC法（高低濃度對比法）HPLC法（類似高低濃度對比法）（1）TLC法（高低濃度對比法）判定方法：規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目規(guī)定雜質(zhì)斑點(diǎn)顏色醋酸去氧皮質(zhì)酮檢查有關(guān)物質(zhì)

取本品加氯仿-甲醇（9：1）制成10mg/ml作為供試液，精密量取適量，加上述溶劑稀釋成0.1mg/ml作為對照液（1）與0.2mg/ml的對照液（2）；照薄層色譜法，各取5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254板上，以二氯甲烷-乙醚-甲醇-水（77:15:8:1.2）為展開劑，展開后晾干，在紫外光燈（254nm）下檢視。供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)，與對照溶液（1）所顯的主斑點(diǎn)比較，不得更深，如有1個斑點(diǎn)深于對照溶液（1）的主斑點(diǎn)，與對照液（2）所顯的主斑點(diǎn)比較，不得更深。特點(diǎn)：（1）簡便易行，不需特殊的儀器；（2）不需對照品；（3）只能控制單個雜質(zhì)的限量；（4）要求雜質(zhì)與主成分的顯色靈敏度接近。（2）HPLC法（高低濃度對比法）判定方法：規(guī)定雜質(zhì)峰數(shù)目規(guī)定雜質(zhì)峰面積醋酸可的松檢查其他甾體特點(diǎn)：（1）需特殊的儀器；（2）不需對照品；（3）可以控制雜質(zhì)的總量；

（二）游離磷酸地塞米松磷酸鈉氫化可的松磷酸鈉倍他米松磷酸鈉氫化潑尼松磷酸鈉對照品法原理：方法：檢查游離磷酸地塞米松磷酸鈉精密稱取本品20mg，置25ml量瓶中，加水15ml溶解，精密加鉬酸銨硫酸試液2.5ml與1-氨基-2-萘酚-4-磺酸溶液1ml，加水至刻度，搖勻，在20℃放置30～50分鐘，照分光光度法，在740nm處測定吸收度，與對照液4.0ml同法處理的吸收度比較，不得更大。（對照液0.0035%KH2PO4）（三）甲醇和丙酮甲醇≤0.3%丙酮≤0.5%內(nèi)標(biāo)法+校正因子GC法四、硒來源合成中用二氧化硒(SeO2)脫氫劇毒原理方法規(guī)定A供＜A對。測定對象：醋酸氟輕松、醋酸地塞米松、曲安奈得、醋酸曲安奈得等四、含量測定（一）UV法△４-3-酮240nm（±）腎上腺皮質(zhì)激素雄性激素和蛋白同化激素孕激素苯環(huán)280nm（±）雌激素（二）反應(yīng)分光光度法（比色法）1.適用于非（弱）分光光度活性藥物2.使待測組分光譜位移，避免干擾，提高選擇性3.提高測定靈敏度弱、非分光光度活性藥物強(qiáng)分光光度活性藥物化學(xué)反應(yīng)

腎上腺皮質(zhì)激素類C17-α－醇酮基強(qiáng)還原性1.原理OH-[還原]四氮唑比色法[O]OH-分子重排三苯甲瓚↓深紅氯化三苯四氮唑（TTC）紅四氮唑（RT）藍(lán)四氮唑（BT）雙甲瓚（暗藍(lán)）2.方法ChPTTC（RT）BPTTC（RT）USPBT對照品法40～45′暗醋酸潑尼松龍軟膏含量測定對照液：精密稱取醋酸潑尼松龍對照品20mg，置100ml量瓶中，加無水乙醇振搖使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得。供試液：精密稱取本品4g（約相當(dāng)于醋酸潑尼松龍20mg），置燒杯中，加無水乙醇約30ml，置水浴上加熱，充分?jǐn)嚢?，使醋酸潑尼松龍溶解，再置冰浴中冷卻，濾過，濾液置100ml量瓶中，同法提取三次，濾液并入量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得。測定法：精密量取上述溶液各1ml，分別置干燥具塞試管中，各精密加無水乙醇9ml與氯化三苯四氮唑試液2ml，搖勻，再各精密加氫氧化四甲基銨試液1ml，搖勻，在25℃暗處放置40～50分鐘，照分光光度法，在485nm的波長處分別測定吸收度，計(jì)算，即得。操作應(yīng)避光。3.討論（1）基團(tuán)對反應(yīng)速度的影響C11=O＞C11－OHC21－OH＞C21-酯C16無論何種取代基ν↓（2）溶劑、水分的影響含水量＞5%→ν↓含水10%→A↓10%含水30%→幾無反應(yīng)—無醛無水乙醇醛→A↑—無水乙醇還原性（3）O2與光線的影響反應(yīng)過程反應(yīng)產(chǎn)物怕光→避光、快速O2影響顏色強(qiáng)度和穩(wěn)定性→隔絕空氣、快速、充N2（4）堿的種類及加入順序反應(yīng)應(yīng)在強(qiáng)堿性（pH13.75）條件下進(jìn)行以氫氧化四甲基銨的結(jié)果最佳加入順序：避免皮質(zhì)激素分解（5）溫度與時間t℃↑→ν↑→甲瓚分解↑→%↓ChP25℃40～45′BP30℃1h4.特點(diǎn)：缺點(diǎn)影響因素太多優(yōu)點(diǎn)測定結(jié)果能指示藥品的穩(wěn)定性（氧化及降解產(chǎn)物無此反應(yīng)）腎上腺皮質(zhì)激素、雄性激素和蛋白同化激素、孕激素C3－酮基1.原理HCl（縮合）異煙肼比色法異煙腙（黃色）3.討論(1)反應(yīng)速度C3=O＞C17=O、C20=OC11=O不反應(yīng)反應(yīng)專屬性C3－酮基（2）溶劑的選擇異煙肼鹽酸鹽→甲醇、乙醇無水甲醇無水乙醇-植物油存在時（3）水分、O2與光線的影響含水量↑→腙水解↑→A↓→%↓不揮發(fā)溶劑、不吸收水分時→O2與光線無影響酸、異煙肼的量(4)鹽酸:異煙肼=2:1樣品:異煙肼=1:8→ν↑酸度↑→異煙肼鹽↓酸度↓→A↓溫度(5)t℃↑→ν↑*該法由于影響因素多，已被HPLC法取代1.原理λmax=465λmax=515雌激素Kober反應(yīng)比色法△△雌二醇-3-甲醚λmax=465λmax=515

Kober反應(yīng)缺點(diǎn)：（1）條件較難控制，易出雙色→黃+紅（2）重現(xiàn)性較差：①呈色強(qiáng)度和穩(wěn)定性受試劑濃度、組成、反應(yīng)時間和溫度的影響。②甾體激素提取物中其他物質(zhì)及制劑中穩(wěn)定劑、賦形劑、溶劑對測定有干擾。鐵－酚試劑[(NH4)2Fe(SO4)2

+H2SO4+H2O2+苯酚]Iron-phenolReagent濃硫酸和過氧化氫的作用：濃硫酸和過氧化氫將2價鐵氧化成3價鐵鐵－酚試劑[(NH4)2Fe(SO4)2

+H2SO4+H2O2+苯酚]*鐵鹽的作用加快黃色產(chǎn)物的形成、促進(jìn)黃色向紅色的轉(zhuǎn)變、加強(qiáng)紅色產(chǎn)物的穩(wěn)定性*酚的作用加快紅色產(chǎn)物的形成消除反應(yīng)產(chǎn)生的熒光Iron-phenolReagent2.特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)較高的靈敏度具有一定的選擇性缺點(diǎn)非化學(xué)計(jì)量反應(yīng)反應(yīng)應(yīng)控制條件、注意平行原則（三）HPLC法USP、BP、JP均采用RP－HPLC（大多內(nèi)標(biāo)法）特點(diǎn)用樣量少，靈敏度高，分離效果好，測定速度快（甾體激素類藥物常含有結(jié)構(gòu)相似的其他甾體雜質(zhì)，對利用結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì)的比色法有干擾）應(yīng)用示例-1氫化可的松

鑒別:（1）取本品約0.1mg，加乙醇1ml溶解后，加臨用新制的硫酸苯肼試液8ml，在70℃加熱15分鐘，即顯黃色。（2）取本品約2mg，加硫酸2ml使溶解，放置5分鐘，顯棕黃色至紅色，并顯綠色熒光；將此溶液傾入10ml水中，即變成黃色至橙黃色，并微帶綠色熒光，同時生成少量絮狀沉淀。（3）本品的紅外光吸收圖譜應(yīng)與對照的圖譜（光譜集283圖）一致。應(yīng)用示例-1氫化可的松

檢查:有關(guān)物質(zhì)照高效液相色譜法（附錄VD）測定。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，量取與對照溶液中潑尼松龍峰相應(yīng)的雜質(zhì)峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算，其含量不得過0.5%，其他單個雜質(zhì)的峰面積不得大于對照溶液中氫化可的松峰面積的1/2倍，未知各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液中氫化可的松峰面積的1.5倍。應(yīng)用示例-1氫化可的松

含量測定:照高效液相色譜法（附錄VD）測定。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水（28：72)為流動相；檢測波長為245nm。取氫化可的松與潑尼松龍，加甲醇溶解并稀釋制成每lml中約含5μg的溶液，取20μ1注人液相色譜儀，記錄色譜圖，出峰順序依次為潑尼松龍與氫化可的松，潑尼松龍峰與氫化可的松峰的分離度應(yīng)符合要求。取本品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每lml中約含0.lmg的溶液，精密量取20μl注人液相色譜儀，記錄色譜圖；另取氫化可的松對照品，同法測定。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)箅，即得。應(yīng)用示例-2醋酸地塞米松鑒別:（1）取本品約10mg，加甲醇1ml，微溫溶解后，加熱的堿性酒石酸銅試液1ml，即生成紅色沉淀。（2）取本品50mg，加乙醇制氫氧化鉀試液2ml，置水浴中加熱5分鐘，放冷，加硫酸溶液（1→2）2ml，緩緩煮沸1分鐘，即發(fā)生乙酸乙酯的香氣。（3）本品的紅外光吸收圖譜應(yīng)與對照的圖譜（光譜集546圖）一致。（4）本品顯有機(jī)氟化物的鑒別反應(yīng)（附錄Ⅲ）。應(yīng)用示例-3醋酸潑尼松鑒別:（1）取本品約1mg，加乙醇2ml使溶解，加10％氫氧化鈉溶液2滴與氯化三苯四氮唑試液1ml，即顯紅色。（2）取本品約5mg，加硫酸1ml使溶解，放置5分鐘，即顯橙色；將此溶液傾入10ml水中，即變成黃色，漸漸變?yōu)樗{(lán)綠色。（3）在含量測定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時間應(yīng)與對照品溶液主峰的保留時間一致。（4）本品的紅外光吸收圖譜應(yīng)與對照的圖譜（光譜集549圖）一致。應(yīng)用示例-3醋酸潑尼松檢查:有關(guān)物質(zhì)取本品，加三氯甲烷-甲醇（9:1）制成每1ml中約含4mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取1ml，置50ml量瓶中，加三氯甲烷-甲醇（9:1）稀釋至刻度．搖勻，作為對照溶液。照薄層色譜法（附錄ⅤB）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷-乙醚-甲醇-水（385:60:15:2）為展開劑，展開，晾干，在105℃干燥10分鐘，放冷，噴以堿性四氮唑藍(lán)試液，立即檢視。供試品溶液如顯雜質(zhì)斑點(diǎn)，與對照溶液的主斑點(diǎn)比較，不得更深。應(yīng)用示例-4甲睪酮鑒別:（1）取本品數(shù)毫克，加硫酸-乙醇（2:1）1ml使溶解，即顯黃色并帶有黃綠色熒光。（2）在含量測定項(xiàng)下記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時間應(yīng)與對照品溶液的下峰保留時間一致。（3）本品的紅外光吸收圖譜應(yīng)與對照的圖譜（光譜集120圖）一致。應(yīng)用示例-5黃體酮鑒別:（1）取本品約5mg，置小試管中，加甲醇0.2ml溶解后，加亞硝基鐵氰化鈉的細(xì)粉約3mg、碳酸鈉及醋酸銨各約50mg，搖勻，放置10-30分鐘，應(yīng)顯藍(lán)紫色。（2）取本品約0.5mg，置小試管中，加異煙肼約1mg與甲醇1ml溶解后，加稀鹽酸1滴，即顯黃色。（3）本品的紅外光吸收圖譜應(yīng)與對照的圖譜（光譜集434圖）一致。應(yīng)用示例-6炔雌醇鑒別:（1）取本品2mg，加硫酸2ml溶解后，溶液顯橙紅色，在反射光線下出現(xiàn)黃綠色熒光；將此溶液傾入水4ml中，即生成玫瑰紅色絮狀沉淀。（2）取本品10mg，加乙醇1ml溶解后，加硝酸銀試液5-6滴，即生成白色沉淀。（3）在含量測定項(xiàng)不記錄的色譜圖中，供試品溶液主峰的保留時間應(yīng)與對照品溶液主峰的保留時間一致。（4）本品的紅外光吸收圖譜應(yīng)與對照的圖譜（光譜集259圖）一致。練習(xí)與思考[A型題]

1、甾體激素類藥物的結(jié)構(gòu)中能和四氮唑鹽發(fā)生顯色反應(yīng)的基團(tuán)A.酚羥基B.活潑次甲基C.甲酮基D.C17-α-醇酮基E.酮基練習(xí)與思考[A型題]

2、用異煙肼比色法測定甾體激素藥物含量時，其溶液的環(huán)境是A．強(qiáng)酸性B．中性C．強(qiáng)堿性D．弱堿性E．以上都不對練習(xí)與思考[A型題]

3、能與亞硝基鐵氰化鈉反應(yīng)生成藍(lán)紫色的藥物是A．雌二醇B．黃體酮C．醋酸可的松D．苯丙酸諾龍E．以上都不對練習(xí)與思考[A型題]

4、異煙肼比色法測定甾體激素類藥物時，藥物的呈色基團(tuán)是A.酮基B.酚羥基C.活潑次甲基D.炔基E.甾體母核練習(xí)與思考[A型題]

5、四氮唑比色法可用于下列哪個藥物的含量測定A.氫化可的松B.苯丙酸諾龍C.雌二醇D.炔雌醇E.黃體酮練習(xí)與思考[A型題]

6、Kober反應(yīng)適用于哪一藥物的含量測定A.黃體酮B.雌二醇C.甲基睪丸素D.甲基炔諾酮E.氫化可的松練習(xí)與思考[A型題]

7、紅外吸收光譜圖中，羥基的伸縮振動范圍約為：A.3600-3300cm-1

B.3300-3000cm-1C.3000-2700cm-1D.2400-2100cm-1

E.1900-1650cm-1練習(xí)與思考[A型題]

8、紅外吸收光譜圖中，羰基的伸縮振動波數(shù)為：A.3600-3300cm-1

B.3300-3000cm-1C.3000-2700cm-1D.2400-2100cm-1

E.1900-1650cm-1練習(xí)與思考[A型題]

9、用四氮唑比色法測定皮質(zhì)激素類藥物，是利用C17–α醇酮基的何種性質(zhì)A．氧化性B．還原性C．可加成性D．酸性E．堿性練習(xí)與思考[A型題]

10、可與重氮苯磺酸作用生成紅色偶氮染料的甾體激素類藥物是A.醋酸可的松B.睪酮C.黃體酮D.雌二醇E.炔諾酮練習(xí)與思考[A型題]

11、醋酸地塞米松的有機(jī)氟化物反應(yīng)中，與氟離子形成藍(lán)紫色配位化合物的試液是A.溴酚藍(lán)試液B.甲基紫試液C.茜素氟藍(lán)試液D.淀粉-碘化鉀試液E.酚酞試液練習(xí)與思考[A型題]

12、不能與黃體酮反應(yīng)顯色的是A.三氯化鐵B.硫酸苯肼C.異煙肼D.亞硝基鐵氰化鈉E.2,4-二硝基苯肼練習(xí)與思考[A型題]

13、甾體激素類藥物上的酮基能與常用的羰基試劑異煙肼起縮合反應(yīng)，該反應(yīng)最適合A．△4-3-酮基D．C17上的酮基B．C20上的酮基C．C11上的酮基E．C16上的酮基練習(xí)與思考[A型題]

14、《中國藥典》(2010年版)中檢查地塞米松磷酸鈉中的甲醇和丙酮所用的方法是A．容量分析法B．UVC．GCD．HPLCE．TLC練習(xí)與思考[A型題]

15、《中國藥典》(2010年版)中檢查地塞米松磷酸鈉中游離磷酸鹽采用的方法是A．比色法B．IRC．電位滴定法D．GCE．HPLC練習(xí)與思考[A型題]

16、各國藥典對甾體激素類藥物常用HPLC或GC法測定其含量，主要原因是A.