aoac會議課件-3m演講稿

過程中微生物快速檢測技術(shù)和

效果驗(yàn)證難點(diǎn)分析ysis

of

critical

points

of

rapid

microbial

detection

and

cleanliness

performance

validation

in

food

process飚3M公司亞太區(qū)技術(shù)?

2014

3M.s.全球日注食品安全消費(fèi)者飲食結(jié)構(gòu)變化全球加強(qiáng)食品安全

制定公眾意識的增強(qiáng)食品貿(mào)易全球化發(fā)展中國家肉和乳品消費(fèi)的增加2?

2014

3M.s.致病菌沙門單增O157:H7金葡空彎廣泛分布廣泛分布反芻動物腸道,包括牛,

,綿羊,鹿及廣泛分布產(chǎn)腸毒素(SET)土壤,水,農(nóng)場牲畜鳥,老鼠,下水道生肉,禽類,雞蛋,牛奶與乳制品,魚,生乳和巴殺乳,奶酪,冰淇淋,新鮮蔬未煮熟或生的牛肉糜,紫花苜色拉,奶油烘焙食 生禽肉

–

雞,

火品,即食熟肉,牛奶 雞,

鴨,

鵝,

野禽,未豬類致病菌來源哪些食品GB29921-2013

食品安

家標(biāo)準(zhǔn)

食品中致病菌限量2014-07-01

實(shí)施3served.致病菌檢測中的產(chǎn)品中致病菌出現(xiàn)的幾率很低樣品中致病菌的數(shù)量很少樣品中致病菌的分布不均勻可能出現(xiàn)樣品本底的干擾要求的檢測限很低:1

CFU/25

g

或更低檢測方法的靈敏度4?

2014

3M.s.檢測范圍外部生產(chǎn)加工環(huán)境原料貨車/裝卸車倉庫地板非食品接觸面空氣地板墻壁下水道貨盤通風(fēng)設(shè)備產(chǎn)品半成品成品食品接觸面設(shè)備包裝生產(chǎn)線5?

2014

3M.s.6?

2014

3M.s.環(huán)境對致病菌檢測時間的要求周一周二周三周四周五周六周日傳統(tǒng)檢測方法(5天）快速(1天）ATP檢測

(實(shí)時）7?

2014

3M.s.致病菌檢測技術(shù)平臺金字塔便捷(Tier

2)快速方法自動或手動容易操作更快的結(jié)果基礎(chǔ)(Tier

3)介意成本符合標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果時間不太重要分子Nucleic

Acid

BasedPolymerase

Chain

ReactionIsothermal

DNA

Amplification培養(yǎng)基Dehydrates/Ready

to

Use

MediaChromogenic

Agar免疫ELISA

(Lateral

Flow

/

Color

Change)ELFA

(Fluorescence)優(yōu)質(zhì)(Tier

1)快速方法前沿科技全自動靈敏度與特異性提高更快的結(jié)果8?

2014

3M.s.89?

20143M.s.第1天:預(yù)增菌第2天:二次增菌第3天:劃板第5天:判定第3天:檢測第2天:檢測技術(shù)難點(diǎn)：減少增菌步驟提高特異性提高檢出限簡化生化鑒定步驟縮短檢測時間操作簡便PCR技術(shù)原理:產(chǎn)生多個

拷貝的分子技術(shù)。依賴加熱循環(huán),包含多次的加熱與冷卻反應(yīng)循環(huán)以使DNA分解及酶 。

變性,退火和延伸的過程重復(fù)多次(30-40個循環(huán)),這樣指數(shù)級增加目標(biāo) 的拷貝數(shù)使用:Taq聚合酶熱穩(wěn)定DNA聚合酶)引物標(biāo)記的探針(檢測)包含特定DNA序列的引物與單鏈DNA上的互補(bǔ)序列結(jié)合Taq聚合酶結(jié)合到引物,然后沿DN段延伸,解讀編碼并產(chǎn)生1個拷貝雙鏈DNA分解成兩個單鏈TCGGCAGGTCAGATTATATaqTaqTCGPrimerPrimerATAAGCCGTCCAGAGAGAGCTAAGATTATATaq聚合酶

結(jié)合到引物,然后沿DN

段延伸,解讀編碼并產(chǎn)生1個拷貝1234TCGGCAGGTCTCTCTCGCATTCTAATAT10?

2014

3M.s.10Taq聚合酶驅(qū)動PCR優(yōu)點(diǎn)能夠承受PCR過程中蛋白變性的條件(高溫）最佳活性溫度75-80°C,72°C時,能在10秒內(nèi)

1000

對DNA鏈缺點(diǎn)Taq聚合酶缺少3’到5’核酸外切酶校正活性,該活性普遍存在于其他聚合酶中Taq酶的失真率為1/9,0001個400bp大小的目標(biāo)片段在20個循環(huán)后會在33%分子中包含錯誤錯誤會隨機(jī)分布11?

2014

3M.s.113M等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)和PCR的不同點(diǎn)44c

53

2

3c

3c

2c

35c

432c

3c

4c

5c

445

4c

44123561235c

456c

61c

12c

23c

344c

5c

46c

3c

4c

5

65c

6c

4c

5c

41c

2c

3c

1c

2c

1

323c

4c

4

5

65c

6c

3

1

2

1c

2c

3

3c

454c

23c

34c

5c

42c

12?

2014

3M.s.13?

2014

3M.s.3M

等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)和PCR的比較3MPCR酶鏈置換DNA

聚合酶Taq

DNA

聚合酶DNA

變性在聚合酶作用下的DNA

鏈置換高溫反應(yīng)溫度I恒溫(60°C)反復(fù)加熱冷卻的熱循環(huán)包括DNA

變性(94°C)

和酶催化的DNA

(55°C,然后72°C)擴(kuò)增連續(xù)循環(huán)擴(kuò)增(72°C

以上)線性的終產(chǎn)物多元體線性擴(kuò)增子13多組探針識別等溫核酸擴(kuò)增不同區(qū)域,DNA核酸酶提供有效快速的目標(biāo)DNA擴(kuò)增熒光檢測熱穩(wěn)定的熒光素酶催化ATP熒光反應(yīng)產(chǎn)生熒光,指示檢測到目標(biāo)菌工作原理1.通過DNA擴(kuò)增產(chǎn)生焦磷酸離子2.和Adenosine5‘phosphosulfate(APS)結(jié)合3.ATP

Sulfurylase(硫酸化酶)轉(zhuǎn)化ATP4.熱穩(wěn)定熒光素酶催化產(chǎn)生熒光14?

2014

3M.s.細(xì)菌DNA鏈引物DNA

聚合酶ATP酶熒光素酶脫氧核苷酸在等6引溫0°物DCN是隨恒A裂為聚著溫解檢合每該下A過測T酶個A，程P帶T該在脫一等P中旦來A酶恒氧首旦溫細(xì)腺P溫核產(chǎn)先D菌苷酶異利苷生引胞-將A熒脫用酸，物內(nèi)聚-P合的光氧磷焦結(jié)即的合組i素核酸合被分D酶等成酶苷硫到N熒子通部極利A酸鹽D光高與過被分短用N將釋A的高P合(P酶特A鏈脫S放P分利定和氧S出只間合的D)1腺核來N合個內(nèi)酶合產(chǎn)A苷，成焦就鏈成生酸然反A目磷生能的為發(fā)T添后應(yīng)酸P基高光加的從發(fā)鹽量將礎(chǔ)能至酸前中種的自量該序硫體吸副己子的發(fā)列酸。取高產(chǎn)標(biāo)結(jié)。光A中酐2D合被來合Pμ特就上。LMA產(chǎn)成定會去拷轉(zhuǎn)生AS的生。T所1P基成個。至檢因列D試N結(jié)劑A合管鏈。腺苷-5‘-磷酸硫酸酐(APS)3M

MDS–陽性反應(yīng)過程15?

2014

3M.s.?

2014

3M.s.1616技術(shù):ATP

生物發(fā)光檢測操作簡便的檢測方法靈敏高效的生物發(fā)光檢測僅當(dāng)目標(biāo)序列擴(kuò)增時會產(chǎn)生光信號的快速增加和減少模板的指數(shù)擴(kuò)增生物熒光的下降17?

20143M.s.簡化操作，提高效率173M

MDS沙門氏菌樣品增菌培養(yǎng)(BPW,18-24

hrs)37°C

±1°C3M

MDS大腸桿菌O157

(包括

H7)樣品增菌培養(yǎng)(BPW,8-24hrs)41.5°C±1°C3M

Method菌樣品增菌培養(yǎng)(24-30

hrs)37°C

±1°C所有致病菌項(xiàng)目的操作程序都一樣吸取20

μL增菌液至裂解管加熱15分鐘–100°C

±1°C.冷卻10分鐘（冷卻模塊），靜置5分鐘吸取20μL裂解液至反應(yīng)試劑管(含有凍干的試劑小球）將反應(yīng)管置入儀器，開始檢測15-75分鐘內(nèi)執(zhí)行擴(kuò)增實(shí)時自動報(bào)告顏色標(biāo)記的檢測結(jié)果3M

Method單增

菌樣品增菌培養(yǎng)(24-52

hrs)37°C

±1°C技術(shù):等溫DNA

擴(kuò)增利用多個特異性的引物，能夠在20-75分鐘內(nèi)對特定區(qū)域的目標(biāo)進(jìn)行快速擴(kuò)增DNA聚合酶能更強(qiáng)地抵抗復(fù)雜樣品的干擾18?

2014

3M.s.技術(shù):等溫DNA

擴(kuò)增利用鏈置換活性的DNA酶在閉合的試管中和恒溫(60°C)下進(jìn)行擴(kuò)增在20-75分鐘內(nèi)高效、高度連續(xù)地完成大量DNA的擴(kuò)增DNA擴(kuò)增中產(chǎn)生大量的焦磷酸鹽離子的副產(chǎn)物由于其高度特異性，產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物能指示目標(biāo)的擴(kuò)增19?

2014

3M.s.20?

2

1

3.s.獲得的認(rèn)證認(rèn)可3M

分子檢測沙門試劑盒ytical

Methods―AOAC

RI

031208―AOAC

OMA

2013.09―NF

VALIDATION

certified

method

3M

01/11-11/12―Health

Canada

–

MLFP

status

in

Compendium

of―Australian &

Inspection

Service

–

DAFF

Validated

Method―Brazilian

Ministry

of

Agriculture

–

MAPA

Official

Method3M

分子檢測E.coli

O157(包括H7)

試劑盒―AOAC

RI

071202―NF

VALIDATION

certified

method

3M

01/12-03/133M分子檢測—

—AOAC

RI菌試劑盒081203

(August

2012)2121?

2014

3M.s.包容性、排他性

–

性能驗(yàn)證SalmonellaListeriaE.coli

O157Listeriamonocytogenes包容性(%)>

99100100100排它性(%)100100100100包容性(%)

=

100%

-

假 率(%)：目標(biāo)菌廣泛檢測的能力。排它性(%)

=

100%

-

假陽性率(%)：抗非目標(biāo)菌干擾的能力。3M?Petrifilm?

沙門氏菌測試片23?

2014

3M.s.3M

Petrifilm

沙門氏菌快速檢測系統(tǒng)用于食品和

環(huán)境樣品增菌后的快速篩選及生化確認(rèn)（鑒定）產(chǎn)品包括：3M沙門氏菌增菌肉湯基礎(chǔ)(SEB)3M沙門氏菌增菌補(bǔ)充物(SESUP)3M

Petrifilm沙門氏菌測試片3M

Petrifilm沙門氏菌確認(rèn)反應(yīng)片3M?

Petrifilm?Salmonella

Express

System

（SALX）24?

2014

3M.s.3M?Petrifilm?

沙門氏菌測試片檢測流程24Step

1-2:水化測試片(避光靜置1小時)Step

3-5:用接種環(huán)蘸取增菌液，然后在水化好的測試片的凝膠表面上劃線Step

6:培養(yǎng)22-24小時Step7:觀察推測性陽性菌落–紅色至紅褐色菌落，帶有黃色暈圈或/和氣泡(確認(rèn)時)Step9:若發(fā)現(xiàn)有推測性陽性的菌落，加入確認(rèn)反應(yīng)片，培養(yǎng)4-5小時Step

8:用較細(xì)的記號筆在測試片的上層膜上標(biāo)記出推測性陽性的菌落Step10:僅觀察被標(biāo)記的菌落顏色變化情況。若菌落顏色變?yōu)樗{(lán)色，則該菌落被確認(rèn)為沙門氏菌25?

2014

3M.s.26低菌量樣品高菌量樣品前增菌選擇性增菌分離培養(yǎng)肉湯基礎(chǔ)+增菌補(bǔ)充物R-V

R10生化確認(rèn)18

-24

hr8 24

h4-5

hr18

-24

hr4-?520h14r3M.s.高菌量/低菌量樣品檢測流程(所有培養(yǎng)溫度：41.5±1°C)肉湯基礎(chǔ)+增菌補(bǔ)充物同一培養(yǎng)溫度低菌量樣品僅需一步增菌R-VR10(二次增菌)培養(yǎng)時間8-24hr,更方便安排實(shí)驗(yàn)時間27?

2014

3M.s.接種10uL（直徑3mm）接種環(huán)(無菌塑料,新的或材質(zhì)平滑的金屬)劃線時必須是一滿環(huán)的增菌液一步劃線劃好線后用手輕輕將上層膜壓緊，避免氣泡41.5±1°C

22-26h培養(yǎng)28加確認(rèn)片之前加確認(rèn)片之后顏色變化!生化確認(rèn)的結(jié)果---沙門陽性檢出!29?20

4

3M.s.判讀生化鑒定結(jié)果，并進(jìn)行進(jìn)一步的

學(xué)鑒定。(低菌量樣品）(高菌量樣品）測試時間:40-44

HRS測試時間:48-52

HRS樣品加入到3M沙門氏菌增菌肉湯+3M沙門氏菌增菌補(bǔ)充物(1:10

稀釋)。培養(yǎng)18-24

hr

@

41.5

±

1°C水化測試片,將增菌液劃線至測試片。培養(yǎng)24±2

hr

@

41.5

±1°C樣品加入到3M沙門氏菌增菌肉湯+3M沙門氏菌增菌補(bǔ)充物(1:10

稀釋)。培養(yǎng)18-24

hr

@

41.5

±

1°C選擇性增菌:將增菌樣品轉(zhuǎn)移至RV[R10]培養(yǎng)8-24

hr

@

41.5

±1°C水化測試片,將增菌液劃線至測試片。培養(yǎng)24±2

hr

@

41.5±1°C加入確認(rèn)反應(yīng)片，培養(yǎng)4-5

hr

@41.5

±

1°C.培養(yǎng)8-18

hr

@

36°C樣品加入到BPW(1:10

稀釋).選擇性增菌:將增菌液轉(zhuǎn)移至TTB和SC培養(yǎng)18-24

hr

@

42°C

和36°C劃線至BS和XLD（或HE等）培養(yǎng)40-48

hr和18-24

hr

@

36°C傳統(tǒng)培養(yǎng)方法顯色培養(yǎng)基將陽性可疑菌落接種到TSI和LIA斜面，24

hr

@36°C總用時88-128HRS確認(rèn)反應(yīng)片3M

Petrifilm?沙門氏菌快速測試片AOACOMA

分析方法

2014.0130?

2014

3M.s.3M

Petrifilm快速霉菌酵母測試片顯著地節(jié)省了您的操作步驟和培養(yǎng)時間Petrifilm?快速霉菌酵母測試片主要特點(diǎn)&

好處:霉菌酵母測試片培養(yǎng)48-60

小時即可得出結(jié)果AOAC

和ISO-AFNOR

的驗(yàn)證延承了其他3M測試片的優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，使用方便，貨架期久，一致性好，免去了培養(yǎng)基

、

；滅菌；培養(yǎng)皿傾注、

等等大量工作霉菌酵母測試片更容易的判讀(特殊的技術(shù)防止霉菌擴(kuò)散和疊加)新的指示劑染色技術(shù)使菌落呈現(xiàn)藍(lán)色，快速直觀的辨認(rèn)泡棉凹槽結(jié)構(gòu)使接種、壓板更加方便31?

2014

3M.s.32?

2014

3M.s.快速出結(jié)果的好處/提早放行1.

減少

空間?2至3天即可放行產(chǎn)品，不必等到5天出結(jié)果，節(jié)省了終產(chǎn)品的40％的

空間或者2.

測試片僅需很少的存放空間僅需很少的冷藏或冷凍空間節(jié)省費(fèi)用更長的保質(zhì)期更快的服務(wù)于客戶更加靈活的生產(chǎn)時間反饋更快/質(zhì)量問題的快速糾正終產(chǎn)品，原材料以及環(huán)境監(jiān)測33價(jià)值所在應(yīng)用于----所有的企業(yè)及合作其希望----微生物可以快速出結(jié)果及產(chǎn)品能夠加速放行快速霉菌酵母測試片提供了快速出結(jié)果—48小時易判讀—新的指示劑技術(shù)簡化的接種、壓板步驟—泡棉凹槽結(jié)構(gòu)節(jié)省

的空間

—可堆疊至40片和其他測試片相同的優(yōu)點(diǎn)提高生產(chǎn)效率簡便一致性好可靠性第

認(rèn)證優(yōu)于----標(biāo)準(zhǔn)的測試片,瓊脂平板以及其他即用型培養(yǎng)基測試片的判讀酵母菌vs.霉菌的菌落為區(qū)分快速霉菌酵母測試片上的酵母和霉菌的菌落,請參考下圖酵母菌菌落數(shù):42個酵母菌的菌落特征:菌落小,有明顯的邊緣,粉褐至藍(lán)綠色,菌落呈現(xiàn)凸起,菌落顏色一致霉菌菌落數(shù):12個霉菌的菌落特征:菌落大,沒有明顯的邊緣,藍(lán)綠色,隨培養(yǎng)時間的延長顏色可發(fā)生變化,菌落呈現(xiàn)扁平,菌落邊緣模糊中心深暗34?

2014

3M.s.蔓越莓雞尾酒中(釀酒酵母)樣品pH值:2.78調(diào)整(25C)空氣中的

環(huán)境樣品(25C)煙熏三文魚中的

熱帶假絲酵母菌(25C)脫脂奶粉中的白地霉菌(25C)自然樣品核桃(28C)性能

測試腰果中的曲霉(28C)天然