細(xì)胞免疫功能檢測(cè)方法 課件

細(xì)胞免疫功能檢測(cè)方法ELISPOT的建立及應(yīng)用

指導(dǎo)老師：常維山教授柴家前副教授劉永慶教授報(bào)告人：李梅

細(xì)胞免疫功能檢測(cè)方法ELISPOT的建立及應(yīng)用1ELISPOT是什么？ELISPOT：全名為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)。它結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，能夠在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子等分泌物的分泌情況原理可概括為：用抗體捕獲培養(yǎng)中細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色方式將其表現(xiàn)出來（SedgwickJD2005）。ELISPOT是什么？ELISPOT：全名為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)2ELISPOT檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)靈敏度高：在一百萬個(gè)陰性細(xì)胞中只要有一個(gè)分泌細(xì)胞因子的陽性細(xì)胞即可被檢測(cè)出來。靈敏度高于ELISA。單細(xì)胞水平：ELISPOT檢測(cè)的是單個(gè)活細(xì)胞的分泌。操作簡便：不需專門的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備?？砂凑諛?biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作，可以同時(shí)處理數(shù)百個(gè)樣品（KalyuzhnyAE2005）。ELISPOT檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)靈敏度高：在一百萬個(gè)陰性細(xì)胞中只要有3ELISPOT的流程ELISPOT的流程4細(xì)胞免疫功能檢測(cè)方法課件5底板與捕捉抗體的包被底板類型：硝酸纖維素膜板、PVDF膜板等捕捉抗體：如抗某細(xì)胞因子抗體（PurifiedRatAnti-MouseIFN-rMonoclonalAntibody）?？贵w包被：用無菌PBS（PH9.6）來稀釋包被抗體，包被量通常在1-2μg/mL（1.25ug/ml）。次日傾倒包被液，PBS洗滌數(shù)次，在滅菌吸水紙上扣干后，用完全培養(yǎng)基37℃封閉2h。傾倒封閉液，加入檢測(cè)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。底板與捕捉抗體的包被底板類型：硝酸纖維素膜板、PVDF膜板等6標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和蛋白含量的確定

Ｆolin酚法（20ug/ml-500mg/ml）

NDV濃縮抗原作1:25稀釋，在650nm波長下比色，吸光度為0.264,帶入回歸方程式y(tǒng)=629.1x，求得蛋白含量為166μg/mL，所以NDV濃縮抗原的蛋白濃度為4150μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和蛋白含量的確定Ｆolin酚法（20ug/m7脾淋巴細(xì)胞濃度對(duì)斑點(diǎn)數(shù)的影響

脾淋巴細(xì)胞濃度對(duì)斑點(diǎn)數(shù)的影響8培養(yǎng)時(shí)間對(duì)斑點(diǎn)數(shù)的影響培養(yǎng)時(shí)間對(duì)斑點(diǎn)數(shù)的影響9NDV抗原濃度對(duì)斑點(diǎn)數(shù)的影響NDV抗原濃度對(duì)斑點(diǎn)數(shù)的影響10影響試驗(yàn)效果的其他因素細(xì)胞是否具有活力是試驗(yàn)成功進(jìn)行的先決條件，凡是活力高功能保持完好的細(xì)胞，ELISPOT檢測(cè)時(shí)必定背景干凈，陰性對(duì)照斑點(diǎn)少，而試驗(yàn)組斑點(diǎn)圓潤鮮亮。

影響試驗(yàn)效果的其他因素細(xì)胞是否具有活力是試驗(yàn)成功進(jìn)行的先決條11在ELISPOT板的移動(dòng)過程中也要避免ELISPOT板的搖動(dòng)，否則會(huì)造成斑點(diǎn)的分布不均。

在細(xì)胞培養(yǎng)完成之前一定要進(jìn)行嚴(yán)格的無菌操作，試驗(yàn)過程中各步的洗滌工作一定要充分。否則會(huì)造成背景的不清晰，針尖樣雜斑的增多。

細(xì)胞免疫功能檢測(cè)方法課件12細(xì)胞免疫功能檢測(cè)方法課件13ELISPOT應(yīng)用實(shí)例

跟據(jù)間接ELISA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)（P/N>2.1），由表1OD450值可以看出，小鼠免疫后第1、3、5、7天的P/N值分別為1.02、1.33、1.97和2.22，抗體水平呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，在第7天才出現(xiàn)抗體陽性。而機(jī)體的IFN-γ水平則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在免疫后的第三天達(dá)最高值，此時(shí)分泌IFN-γ脾淋巴細(xì)胞比率177/106。分析可知，在NDV免疫小鼠時(shí)，細(xì)胞免疫與體液免疫存在著一定的時(shí)差關(guān)系，在血清抗體陽性檢出的前期IFN-γ的分泌降至最低水平。ELISPOT應(yīng)用實(shí)例跟據(jù)間接ELISA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)（P/14應(yīng)用及展望

白細(xì)胞中能夠分泌IFN-γ的細(xì)胞為TH2和CTL細(xì)胞,活化條件對(duì)細(xì)胞內(nèi)免疫染色I(xiàn)FNγ和IL-4法檢測(cè)人外周血Th1和Th2細(xì)胞的影響

Th0/Th1/Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)換（Th1與Th2細(xì)胞亞群均來源于共同的Th0前體細(xì)胞，抗原呈遞細(xì)胞(APC)可活化Th0細(xì)胞。遺傳因素、抗原類型、劑量、有無佐劑以及抗原進(jìn)入體內(nèi)的途徑，均可影響APC活化Th0細(xì)胞時(shí)的微環(huán)境，而微環(huán)境中細(xì)胞因子的類型決定Th0細(xì)胞是否分化為Th1細(xì)胞或Th2細(xì)胞）。老年哮喘患者外周血淋巴細(xì)胞內(nèi)IFNγ與IL4的變化

疫苗研究開發(fā)：ELISPOT檢測(cè)已經(jīng)成為評(píng)價(jià)疫苗細(xì)胞免疫反應(yīng)最有效的指標(biāo)之一（HarropRet.al.,2004）。對(duì)于某些持續(xù)性感染疾病，疫苗的細(xì)胞免疫保護(hù)效果甚至居于主要地位應(yīng)用及展望

白細(xì)胞中能夠分泌IFN-γ的細(xì)胞為TH2和CTL15IL-4可以促進(jìn)B細(xì)胞分化、增殖,在IgE誘導(dǎo)合成中起關(guān)鍵作用[4],誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)毒素,趨化嗜酸性粒細(xì)胞,加重氣道炎癥[5].IFN-γ與IL-4是相互拮抗的,前者可抑制IL-4的mRNA轉(zhuǎn)錄水平,并抑制由IL-4誘導(dǎo)的B細(xì)胞合成IgE[6].Th1/Th2亞群的失衡,與許多人類疾病有關(guān),多數(shù)認(rèn)為,支氣管哮喘中,Th2亞群及所屬細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì),在該病的發(fā)生發(fā)展中作用重要[2,4].由于CD4+分子IL-4可以促進(jìn)B細(xì)胞分化、增殖,在IgE誘導(dǎo)合成中起關(guān)鍵作16B7-H1/PD-1抑制途徑對(duì)慢性乙型肝炎患者T細(xì)胞免疫功能影響的研究陳良恩中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院

2007-08-242007博士B7-H1/PD-1抑制途徑對(duì)慢性乙型肝炎患者T細(xì)胞免疫功能17細(xì)胞免疫功能檢測(cè)方法課件18突變型乙型肝炎病毒前C-CDNA疫苗的基礎(chǔ)研究張敏中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院2007-07-052007博士突變型乙型肝炎病毒前C-CDNA疫苗的基礎(chǔ)研究張敏中國人民19Thanks!歡迎各位老師同學(xué)提出寶貴意見！Thanks!歡迎各位老師同學(xué)提出寶貴意見！20ELISPOT與其他細(xì)胞免疫檢測(cè)方法的比較當(dāng)特異性抗原和T細(xì)胞結(jié)合后激活細(xì)胞釋放出IFN-Y，IFN-YELISPOT可靈敏的檢測(cè)出T細(xì)胞釋出的IFN-Y，該方法己被用于多種CTL的檢測(cè)。Yang.J的研究表明，ELISPOT方法檢測(cè)CTL不但有高度的敏感性還有高度的特異性和HLA限制性，在用LMP2肽段CLG作為激刺原檢測(cè)CTL時(shí)發(fā)現(xiàn)，只有相同HLA型別(HLA-A2)的CDS+細(xì)胞能起陽性反應(yīng)。ELISPOT與其他細(xì)胞免疫檢測(cè)方法的比較當(dāng)特異性抗原和T細(xì)21細(xì)胞免疫功能檢測(cè)方法ELISPOT的建立及應(yīng)用

指導(dǎo)老師：常維山教授柴家前副教授劉永慶教授報(bào)告人：李梅

細(xì)胞免疫功能檢測(cè)方法ELISPOT的建立及應(yīng)用22ELISPOT是什么？ELISPOT：全名為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)檢測(cè)。它結(jié)合了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)，能夠在單細(xì)胞水平檢測(cè)細(xì)胞因子等分泌物的分泌情況原理可概括為：用抗體捕獲培養(yǎng)中細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子，并以酶聯(lián)斑點(diǎn)顯色方式將其表現(xiàn)出來（SedgwickJD2005）。ELISPOT是什么？ELISPOT：全名為酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)23ELISPOT檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)靈敏度高：在一百萬個(gè)陰性細(xì)胞中只要有一個(gè)分泌細(xì)胞因子的陽性細(xì)胞即可被檢測(cè)出來。靈敏度高于ELISA。單細(xì)胞水平：ELISPOT檢測(cè)的是單個(gè)活細(xì)胞的分泌。操作簡便：不需專門的實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備?？砂凑諛?biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)操作，可以同時(shí)處理數(shù)百個(gè)樣品（KalyuzhnyAE2005）。ELISPOT檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)靈敏度高：在一百萬個(gè)陰性細(xì)胞中只要有24ELISPOT的流程ELISPOT的流程25細(xì)胞免疫功能檢測(cè)方法課件26底板與捕捉抗體的包被底板類型：硝酸纖維素膜板、PVDF膜板等捕捉抗體：如抗某細(xì)胞因子抗體（PurifiedRatAnti-MouseIFN-rMonoclonalAntibody）?？贵w包被：用無菌PBS（PH9.6）來稀釋包被抗體，包被量通常在1-2μg/mL（1.25ug/ml）。次日傾倒包被液，PBS洗滌數(shù)次，在滅菌吸水紙上扣干后，用完全培養(yǎng)基37℃封閉2h。傾倒封閉液，加入檢測(cè)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。底板與捕捉抗體的包被底板類型：硝酸纖維素膜板、PVDF膜板等27標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和蛋白含量的確定

Ｆolin酚法（20ug/ml-500mg/ml）

NDV濃縮抗原作1:25稀釋，在650nm波長下比色，吸光度為0.264,帶入回歸方程式y(tǒng)=629.1x，求得蛋白含量為166μg/mL，所以NDV濃縮抗原的蛋白濃度為4150μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立和蛋白含量的確定Ｆolin酚法（20ug/m28脾淋巴細(xì)胞濃度對(duì)斑點(diǎn)數(shù)的影響

脾淋巴細(xì)胞濃度對(duì)斑點(diǎn)數(shù)的影響29培養(yǎng)時(shí)間對(duì)斑點(diǎn)數(shù)的影響培養(yǎng)時(shí)間對(duì)斑點(diǎn)數(shù)的影響30NDV抗原濃度對(duì)斑點(diǎn)數(shù)的影響NDV抗原濃度對(duì)斑點(diǎn)數(shù)的影響31影響試驗(yàn)效果的其他因素細(xì)胞是否具有活力是試驗(yàn)成功進(jìn)行的先決條件，凡是活力高功能保持完好的細(xì)胞，ELISPOT檢測(cè)時(shí)必定背景干凈，陰性對(duì)照斑點(diǎn)少，而試驗(yàn)組斑點(diǎn)圓潤鮮亮。

影響試驗(yàn)效果的其他因素細(xì)胞是否具有活力是試驗(yàn)成功進(jìn)行的先決條32在ELISPOT板的移動(dòng)過程中也要避免ELISPOT板的搖動(dòng)，否則會(huì)造成斑點(diǎn)的分布不均。

在細(xì)胞培養(yǎng)完成之前一定要進(jìn)行嚴(yán)格的無菌操作，試驗(yàn)過程中各步的洗滌工作一定要充分。否則會(huì)造成背景的不清晰，針尖樣雜斑的增多。

細(xì)胞免疫功能檢測(cè)方法課件33細(xì)胞免疫功能檢測(cè)方法課件34ELISPOT應(yīng)用實(shí)例

跟據(jù)間接ELISA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)（P/N>2.1），由表1OD450值可以看出，小鼠免疫后第1、3、5、7天的P/N值分別為1.02、1.33、1.97和2.22，抗體水平呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，在第7天才出現(xiàn)抗體陽性。而機(jī)體的IFN-γ水平則呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在免疫后的第三天達(dá)最高值，此時(shí)分泌IFN-γ脾淋巴細(xì)胞比率177/106。分析可知，在NDV免疫小鼠時(shí)，細(xì)胞免疫與體液免疫存在著一定的時(shí)差關(guān)系，在血清抗體陽性檢出的前期IFN-γ的分泌降至最低水平。ELISPOT應(yīng)用實(shí)例跟據(jù)間接ELISA結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)（P/35應(yīng)用及展望

白細(xì)胞中能夠分泌IFN-γ的細(xì)胞為TH2和CTL細(xì)胞,活化條件對(duì)細(xì)胞內(nèi)免疫染色I(xiàn)FNγ和IL-4法檢測(cè)人外周血Th1和Th2細(xì)胞的影響

Th0/Th1/Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)換（Th1與Th2細(xì)胞亞群均來源于共同的Th0前體細(xì)胞，抗原呈遞細(xì)胞(APC)可活化Th0細(xì)胞。遺傳因素、抗原類型、劑量、有無佐劑以及抗原進(jìn)入體內(nèi)的途徑，均可影響APC活化Th0細(xì)胞時(shí)的微環(huán)境，而微環(huán)境中細(xì)胞因子的類型決定Th0細(xì)胞是否分化為Th1細(xì)胞或Th2細(xì)胞）。老年哮喘患者外周血淋巴細(xì)胞內(nèi)IFNγ與IL4的變化

疫苗研究開發(fā)：ELISPOT檢測(cè)已經(jīng)成為評(píng)價(jià)疫苗細(xì)胞免疫反應(yīng)最有效的指標(biāo)之一（HarropRet.al.,2004）。對(duì)于某些持續(xù)性感染疾病，疫苗的細(xì)胞免疫保護(hù)效果甚至居于主要地位應(yīng)用及展望

白細(xì)胞中能夠分泌IFN-γ的細(xì)胞為TH2和CTL36IL-4可以促進(jìn)B細(xì)胞分化、增殖,在IgE誘導(dǎo)合成中起關(guān)鍵作用[4],誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)毒素,趨化嗜酸性粒細(xì)胞,加重氣道炎癥[5].IFN-γ與IL-4是相互拮抗的,前者可抑制IL-4的mRNA轉(zhuǎn)錄水平,并抑制由IL-4誘導(dǎo)的B細(xì)胞合成IgE[6].Th1/Th2亞群的失衡,與許多人類疾病有關(guān),多數(shù)認(rèn)為,支氣管哮喘中,Th2亞群及所屬細(xì)胞因子占優(yōu)勢(shì),在該病的發(fā)生發(fā)展中作用重要[2,4].由于CD4+分子IL-4可以促進(jìn)B細(xì)胞分化、增殖,在IgE誘導(dǎo)合成中起關(guān)鍵作37B7-H1/PD-1抑制途徑對(duì)慢性乙型肝炎患者T細(xì)胞免疫功能影響的研究陳良恩中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院

2007-08-242007博士B7-H1/PD-1抑制途徑對(duì)慢性乙型肝炎患者T細(xì)胞免疫功能38細(xì)胞免疫功能檢測(cè)方法課件39突變型乙型肝炎病毒前C-CDNA疫苗的基礎(chǔ)研究張敏中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院2007-07-052007博士突變型乙型肝炎病毒前C-CDNA疫苗的基礎(chǔ)研究張敏中國人民40Thanks!歡迎各