肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗

肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗2004-02-0413:24:30.267【GB/T4789.12—1994】食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗

1主題內(nèi)容與適用范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品和食物中毒樣品中肉毒梭菌及肉毒毒素的檢驗。

2引用標(biāo)準(zhǔn)

GB4789.28食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗染色法、培養(yǎng)基和試劑

3設(shè)備和材料

3.1離心機(jī)及離心管。

3.2研缽及細(xì)沙。

3.3溫箱：30℃，35℃，37℃。

3.4顯微鏡。

3.5厭氧培養(yǎng)裝置：常溫催化除氧式或焦性沒石子酸除氧式。

3.6吸管：1mL，10mL。

3.7注射器：1mL。

3.8平皿。

3.9接種環(huán)。

3.10載玻片。

3.11小白鼠。

4培養(yǎng)基和試劑

4.1庖肉培養(yǎng)基：GB4789.28中4.67。

4.2卵黃瓊脂培養(yǎng)基：GB4789.28中4.68。

4.3明膠磷酸鹽緩沖液：GB4789.28中3.23。

4.4肉毒分型抗毒診斷血清。

4.5胰酶：活力1∶250。

4.6革蘭氏染色液：GB4789.28中2.2。

5檢驗程序

肉毒梭菌及肉毒毒素檢驗程序如下：

（圖略）

注：①報告(一)：檢樣含有某型肉毒毒素。

②報告(二)：檢樣含有某型肉毒梭菌。

③報告(三)：由樣品分離的菌株為某型肉毒梭菌。

如上所示，檢樣經(jīng)均質(zhì)處理后，及時接種培養(yǎng)，進(jìn)行增菌、產(chǎn)毒，同時進(jìn)行毒素檢測試驗。毒素檢測試驗結(jié)果可證明檢樣中有無肉毒毒素以及有何型肉毒毒素存在。

對增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物，一方面做一般的生長特性觀察，同時檢測肉毒毒素的產(chǎn)生情況。所得結(jié)果可證明檢樣中有無肉毒梭菌以及有何型肉毒梭菌存在。

為其他特殊目的而欲獲純菌株，可用增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物進(jìn)行分離培養(yǎng)，對所得純菌株進(jìn)行形態(tài)、培養(yǎng)特性等觀察及毒素檢測，其結(jié)果可證明所得純菌為何型肉毒梭菌。

6操作步驟

6.1肉毒毒素檢測

液狀檢樣可直接離心，固體或半流動檢樣須加適量(例如等量、倍量或5倍量、10倍量)明膠磷酸鹽緩沖液，浸泡、研碎，然后離心，取上清液進(jìn)行檢測。

另取一部分上清液，調(diào)pH6.2，每9份加10%胰酶(活力1：250)水溶液1份，混勻，經(jīng)常輕輕攪動，37℃作用60min，進(jìn)行檢測。

肉毒毒素檢測以小白鼠腹腔注射法為標(biāo)準(zhǔn)方法。

6.1.1檢出試驗：取上述離心上清液及其胰酶激活處理液分別注射小白鼠2只，每只0.5mL，觀察4d。注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24h內(nèi)發(fā)病、死亡。主要癥狀為豎毛，四肢癱軟，呼吸困難，呼吸呈風(fēng)箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最終死于呼吸麻痹。

如遇小鼠猝死以至癥狀不明顯時，則可將注射液做適當(dāng)稀釋，重做試驗。

6.1.2確證試驗：不論上清液或其胰酶激活處理液，凡能致小鼠發(fā)病、死亡者，取樣分成3份進(jìn)行試驗，1份加等量多型混合肉毒抗毒診斷血清，混勻，37℃作用30min，1份加等量明膠磷酸鹽緩沖液，混勻，煮沸10min；1份加等量明膠磷酸鹽緩沖液，混勻即可，不做其他處理。3份混合液分別注射小白鼠各2只，每只0.5mL，觀察4d，若注射加診斷血清與煮沸加熱的2份混合液的小白鼠均獲保護(hù)存活，而唯有注射未經(jīng)其他處理的混合液的小白鼠以特有癥狀死亡，則可判定檢樣中有肉毒毒素存在，必要時要進(jìn)行毒力測定及定型試驗。

6.1.3毒力測定：取已判定含有肉毒毒素的檢樣離心上清液，用明膠磷酸鹽緩沖液做成50倍、500倍及5000倍的稀釋液，分別注射小白鼠各2只，每只0.5mL，觀察4d。根據(jù)動物死亡情況，計算檢樣所含肉毒毒素的大體毒力(MLD/mL或MLD/g)。例如：5倍、50倍及500倍稀釋致動物全部死亡，而注射5000倍稀釋液的動物全部存活，則可大體判定檢樣上清液所含毒素的毒力為1000～10000MLD/mL。

6.1.4定型試驗：按毒力測定結(jié)果，用明膠磷酸鹽緩沖液將檢樣上清液稀釋至所含毒素的毒力大體在10～1000MLD/mL的范圍，分別與各單型肉毒抗診斷血清等量混勻，37℃作用30min，各注射小鼠2只，每只0.5mL，觀察4d。同時以明膠磷酸鹽緩沖液代替診斷血清，與稀釋毒素液等量混合作為對照。能保護(hù)動物免于發(fā)病、死亡的診斷血清型即為檢樣所含肉毒毒素的型別。

注：①未經(jīng)胰酶激活處理的檢樣的毒素檢出試驗或確證試驗若為陽性結(jié)果，則胰酶激活處理液可省略毒力測定及定型試驗。

②為爭取時間盡快得出結(jié)果，毒素檢測的各項試驗也可同時進(jìn)行。

②根據(jù)具體條件和可能性，定型試驗可酌情先省略C、D、F及G型。

④進(jìn)行確證及定型等中和試驗時，檢樣的稀釋應(yīng)參照所用肉毒診斷血清的效價。

⑤試驗動物的觀察可按陽性結(jié)果的出現(xiàn)隨時結(jié)束，以縮短觀察時間；唯有出現(xiàn)陰性結(jié)果時，應(yīng)保留充分的觀察時間。

6.2肉毒梭菌檢出(增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)試驗)

取庖肉培養(yǎng)基3支，煮沸10～15min，做如下處理：

第一支：急速冷卻，接種檢樣均質(zhì)液1～2mL；

第二支：冷卻至60℃，接種檢樣，繼續(xù)于60℃保溫10min，急速冷卻；

第三支：接種檢樣，繼續(xù)煮沸加熱10min，急速冷卻。

以上接種物于30℃培養(yǎng)5d，若無生長，可再培養(yǎng)10d。培養(yǎng)到期，若有生長，取培養(yǎng)液離心，以其上清液進(jìn)行毒素檢測試驗，方法同4.1，陽性結(jié)果證明檢樣中有肉毒梭菌存在。

6.3分離培養(yǎng)

選取經(jīng)毒素檢測試驗證實含有肉毒梭菌的前述增菌產(chǎn)毒培養(yǎng)物(必要時可重復(fù)一次適宜的加熱處理)接種卵黃瓊脂平板，35℃厭氧培養(yǎng)48h。肉毒梭菌在卵黃瓊脂平板上生長時，菌落及周圍培養(yǎng)基表面覆蓋著特有的虹彩樣(或珍珠層樣)薄層，但G型菌無此現(xiàn)象。

根據(jù)菌落形態(tài)及菌體形態(tài)挑取可疑菌落，接種庖肉培養(yǎng)基，于30℃培養(yǎng)5d，進(jìn)行毒素檢測及培養(yǎng)特性檢查確證試驗。

6.3.1毒素檢測：試驗方法同4.1。

6.3.2培養(yǎng)特性檢查：接種卵黃瓊脂平板，分成2份，分別在35℃的需氧和厭氧條件下培養(yǎng)48h，觀察生長情況及菌落形態(tài)。肉毒梭菌只有在厭氧條件下才能在卵黃瓊脂平板上生長并形成具有上述特征的菌落，而在需氧條件下則不生長。

注：為檢出蜂蜜中存在的肉毒梭菌，蜂蜜檢樣需預(yù)溫37℃(流質(zhì)蜂蜜)，或52～53℃(晶質(zhì)蜂蜜)，充分?jǐn)嚢韬罅⒓捶Q取20g，溶于100mL滅菌蒸餾水(37℃或52～53℃)，攪拌稀釋，以8000～10000r/min離心30min(20℃)，沉淀，加滅菌蒸餾水1mL，充分搖勻，等分各半，接種庖肉培