鴨坦布蘇病毒病防治關(guān)鍵技術(shù)研究及應(yīng)用分析研究 醫(yī)學(xué)專業(yè)_第1頁
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文檔簡(jiǎn)介

第四章實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1病原分離鑒定實(shí)驗(yàn)

1.1PCR結(jié)果

參照已有的鴨坦布蘇病毒檢測(cè)方法對(duì)收集的雞胚尿囊液進(jìn)行PCR檢測(cè),PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生物技術(shù)公司測(cè)序。結(jié)果顯示,F(xiàn)C1-FC4及YF2樣品接種的雞胚尿囊液中均未檢測(cè)到禽坦布蘇病毒核酸,YF1,YF3和YF4樣品接種的雞胚尿囊液中檢測(cè)到DTMUV的存在。PCR擴(kuò)增片段經(jīng)測(cè)序表明與FJMH220株、YY5株及BYD-1株的同源性在99.1%。因YF1,YF3和YF4樣品都來源于同一鴨場(chǎng)的同一批鴨,由此將3份樣品分離獲得的病毒視為同一株病毒,命名為YF株。獲得的病毒經(jīng)蝕斑純化后,-80℃保存?zhèn)溆?。通過RT-PCR擴(kuò)增出病毒YF株基因組的8個(gè)基因片段,瓊脂凝膠電泳檢測(cè),片段大小與預(yù)測(cè)基本相符,結(jié)果見圖1。擴(kuò)增片段經(jīng)1%瓊脂凝膠純化回收后,克隆到pEASY-B載體中,隨后每個(gè)片段挑選3個(gè)陽性克隆送生物技術(shù)公司測(cè)序。

圖1病毒YF株基因組的擴(kuò)增

M、DNA分子量標(biāo)尺;1-8、YF毒株基因組各擴(kuò)增片段

1.2序列比對(duì)結(jié)果

序列分析表明,該株病毒全基因組全長(zhǎng)10990nt,未出現(xiàn)核苷酸插入或缺失及基因重組的變異情況,與已報(bào)道的DTMUV分離株的核苷酸同源性均在98.5%以上,且親緣關(guān)系與當(dāng)前鴨群中優(yōu)勢(shì)病毒亞群非常近。

表3坦布蘇病毒信息及序列同源性比對(duì)結(jié)果

毒株

GenBankID

宿主

YF株(%)

毒株

GenBankID

宿主

YF株(%)

核苷酸

氨基酸

核苷酸

氨基酸

XHZD/2010

JQ595407

99.2

99.0

JXSP

JQ920423

99.5

99.7

Shandong1

JX965381

99.3

99.4

Du/CH/LSD/110128

KC136210

98.5

99.0

FJMH220

JQ928189

99.3

98.6

ZJ-6

JF459991

99.4

99.5

ZJ-407

JQ314464

99.3

99.0

byd1

JQ920420

99.4

99.2

YY5

JF270480

99.2

99.1

TA

JQ289550

99.3

99.4

JS

JQ920422

99.4

99.2

WR

JX196334

99.4

99.6

JS804

JF895923

99.3

98.7

JX2

JQ920426

98.5

99.2

goose

JQ920424

99.4

99.6

duan

JQ920421

99.2

99.1

ZJGH-2

JQ314465

99.1

99.0

JS/2010

JX273153

99.4

99.1

GS-PT-7

JQ627864

99.4

99.8

WJ-1

JX549382

98.5

99.0

Sitiawan

JX477686

肉雞

87.2

96.2

MM1775

JX477685

蚊蟲

88.6

96.4

圖2坦布蘇病毒基因組分子進(jìn)化分析

GroupA為2010年后分離的坦布蘇病毒;GroupB為2010年前分離的坦布蘇病毒;黑三角(▲)標(biāo)注的毒株為本實(shí)驗(yàn)分離的毒株;圖中樹結(jié)處的阿拉伯?dāng)?shù)字為自舉檢驗(yàn)置信值(1,000次重復(fù))。

A

B

圖3基于病毒E蛋白(A)和NS5基因(B)的分子進(jìn)化分析

黑三角(▲)標(biāo)注的毒株為本實(shí)驗(yàn)分離的毒株,圖中樹結(jié)處的阿拉伯?dāng)?shù)字為自舉檢驗(yàn)置信值(1,000次重復(fù))

以上果表明,在宜豐發(fā)病場(chǎng)采集的病料中分離到了鴨坦布蘇病毒。鴨群中流行的鴨坦布蘇病毒存在2個(gè)病毒群,但主要以II群的病毒為主,其中II-C亞群的毒株為流行的優(yōu)勢(shì)病毒群。本研究分離獲得的江西分離株(YF株)基因組與已報(bào)道的高度同源,遺傳穩(wěn)定,沒有出現(xiàn)核苷酸的缺失或插入,未發(fā)生基因重組現(xiàn)象?;赮F株全基因組的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,YF株與鴨群中流行的II-C譜系病毒群親緣關(guān)系最近,這與基于YF株病毒E蛋白及NS5蛋白編碼基因的遺傳進(jìn)化分析結(jié)果一致,江西鴨群中流行的鴨坦布蘇病毒遺傳比較穩(wěn)定,未發(fā)生變異。

2病毒復(fù)制試驗(yàn)

2.1臨床結(jié)果

A組蛋鴨前期出現(xiàn)綠色稀便,死前均表現(xiàn)精神沉郁、四肢無力、頭頸歪斜、蜷縮于角落,出現(xiàn)產(chǎn)蛋極速下降情況。解剖死鴨發(fā)現(xiàn),最明顯的臨床病理變化是卵黃溶解、卵巢萎縮鈣化淤血,大部分有心冠淤血現(xiàn)象。B組、C組蛋鴨表現(xiàn)正常。

2.2PCR檢測(cè)結(jié)果

A組病料通過RT-PCR擴(kuò)增出病毒YF株的基因片段,瓊脂凝膠電泳檢測(cè),片段大小與預(yù)測(cè)基本相符,結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過病原分離鑒定,重新得到了鴨坦布蘇病毒YF毒株。B組、C組蛋鴨未見YF基因擴(kuò)增片段。

通過以上實(shí)驗(yàn)?zāi)艹晒?fù)制鴨坦布蘇病毒病,表明鴨坦布蘇病毒病不僅具有致病性,且是獨(dú)立的病毒種類,具有可復(fù)制性,且在感染機(jī)體內(nèi)能夠穩(wěn)定存在。

3病毒傳播途徑探究試驗(yàn)

3.1臨床結(jié)果

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過接觸傳播、空氣傳播方式均能使鴨群感染鴨坦布蘇病毒病,蛋鴨出現(xiàn)精神沉郁、采食下降、產(chǎn)蛋率急劇下降等臨床狀況。

表4病毒傳播途徑產(chǎn)蛋率變化情況

組別

0天

(%)

1天

(%)

2天

(%)

3天

(%)

4天

(%)

5天

(%)

6天

(%)

7天

(%)

8天

(%)

9天

(%)

10天

(%)

空氣

傳播

>90

70.97

74.19

45.16

61.29

35.48

12.90

6.45

0.00

3.23

3.57

混群

接觸

>90

83.33

72.22

27.78

5.56

16.67

11.11

11.76

5.88

6.25

0.00

空白

對(duì)照

>90

38.89

72.22

94.44

100.0

72.22

77.78

77.78

77.78

72.22

88.89

3.2病理剖檢結(jié)果

病理剖檢結(jié)果:解剖死鴨發(fā)現(xiàn),直接接觸傳播和空氣傳播感染蛋均出現(xiàn)鴨卵黃溶解、卵巢萎縮鈣化淤血、部分死鴨出現(xiàn)心冠淤血等情況,空白對(duì)照組剖檢正常,結(jié)果見圖6。

圖6病毒傳播途徑試驗(yàn)蛋鴨病理組織學(xué)檢查情況

空氣傳播組混群接觸傳播組空白對(duì)照組

結(jié)果表明鴨坦布蘇病毒病不僅具有致病性,且能夠通過混群接觸感染、空氣傳播等方式進(jìn)行傳播,在日常生產(chǎn)過程中對(duì)患病鴨群應(yīng)盡早實(shí)行較好的隔離措施等方式,才能阻止疫病的傳播。

序號(hào)

試驗(yàn)組別

存欄

1d

2d

3d

4d

5d

6d

7d

8d

9d

10d

11d

12d

1

感染對(duì)照組

30

83.33

73.33

33.33

13.33

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

2

F疫苗免疫組

30

93.33

73.33

76.67

83.33

86.67

83.33

90.00

86.67

86.67

90.00

83.33

86.67

3

中草藥預(yù)防1組

30

86.67

63.33

66.67

63.33

60.00

63.33

66.67

66.67

70.00

66.67

70.00

70.00

4

中草藥預(yù)防2組

30

100.00

56.67

53.33

63.33

63.33

63.33

70.00

73.33

73.33

70.00

70.00

73.33

5

中草藥預(yù)防3組

30

86.67

76.67

40.00

10.00

3.33

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

0.00

6

中草藥治療1組

30

73.33

50.00

20.00

16.67

20.00

13.33

26.67

20.00

26.67

36.67

43.33

50.00

7

中草藥治療2組

30

88.89

50.00

20.00

26.67

23.33

26.67

30.00

33.33

36.67

36.67

50

53.33

8

空白對(duì)照組

30

93.33

96.67

93.33

100.00

90.00

86.67

93.33

96.67

90.00

93.33

93.33

93.33

4鴨坦布蘇病毒防治試驗(yàn)

4.1試驗(yàn)后產(chǎn)蛋變化結(jié)果

攻毒前鴨群各組產(chǎn)蛋率均在90%以上。攻毒后,感染對(duì)照組產(chǎn)蛋量迅速下降,第5d降至0;中草藥預(yù)防3組未見明顯預(yù)防效果,第6d產(chǎn)蛋率降至0;F疫苗免疫組、中草藥預(yù)防1組、中草藥預(yù)防2組、中草藥治療1組和中草藥治療2組均出現(xiàn)明顯防治效果。而空白對(duì)照組產(chǎn)蛋率則基本保持穩(wěn)定。

表5鴨坦布蘇病毒病毒試驗(yàn)產(chǎn)蛋率變化表單位:%

4.2致死率結(jié)果

攻毒后發(fā)現(xiàn),感染對(duì)照組在攻毒后第5d開始出現(xiàn)死亡。結(jié)果顯示,與感染對(duì)照組比較,F(xiàn)疫苗免疫組、中草藥預(yù)防1組、中草藥預(yù)防2組、中草藥治療2組在用藥后不發(fā)生鴨只的死亡。

表6鴨坦布蘇病毒病毒試驗(yàn)各組死亡率情況表

序號(hào)

試驗(yàn)組別

原存欄

攻毒種類

最后存欄數(shù)

死亡數(shù)

死亡率

1

感染對(duì)照組

30

鴨坦布蘇病毒

27

3

10.00%

2

F疫苗免疫組

30

鴨坦布蘇病毒

30

0

0.00%*

3

中草藥預(yù)防1組

30

鴨坦布蘇病毒

30

0

0.00%*

4

中草藥預(yù)防2組

30

鴨坦布蘇病毒

30

0

0.00%*

5

中草藥預(yù)防3組

30

鴨坦布蘇病毒

27

3

10.00%

6

中草藥治療1組

30

鴨坦布蘇病毒

29

1

3.33%

7

中草藥治療2組

30

鴨坦布蘇病毒

30

0

0.00%*

8

空白對(duì)照組

30

細(xì)胞培養(yǎng)液

30

0

0.00%*

*:與感染對(duì)照組差異顯著。

4.3剖檢病理變化結(jié)果

剖檢病死鴨發(fā)現(xiàn),卵巢病變明顯,可見卵巢出血、萎縮、破裂,卵泡出血、萎縮、破裂,卵泡膜明顯增厚、渾濁,嚴(yán)重者卵黃破裂,出現(xiàn)卵黃性腹膜炎;心臟表面呈現(xiàn)大量出血點(diǎn),心臟內(nèi)膜出血,心肌外觀蒼白,并附有條索狀出血帶,見圖7。

卵黃性腹膜炎心臟病變

圖7病死鴨病理變化

卵巢變化情況結(jié)果

攻毒試驗(yàn)結(jié)束后,每組隨機(jī)挑選2只鴨進(jìn)行解剖觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn),F(xiàn)疫苗免疫組卵巢基本正常;中草藥治療1組卵巢的損傷程度較輕,卵巢上仍有卵泡發(fā)育;而其余各組蛋鴨的卵巢均存在不同程度的萎縮或者鈣化現(xiàn)象,詳見圖8。

F疫苗預(yù)防組中草藥治療1組

中草藥預(yù)防2組中草藥預(yù)防3組

感染對(duì)照組空白對(duì)照組

圖8各實(shí)驗(yàn)組卵巢情況

5流行病學(xué)調(diào)查及田間應(yīng)用試驗(yàn)

5.1流調(diào)結(jié)果

通過對(duì)全省南昌、九江、吉安等5個(gè)設(shè)區(qū)市的20個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)(含3個(gè)發(fā)病場(chǎng))進(jìn)行鴨坦布蘇病毒流行病學(xué)調(diào)查研究,共采集樣品524份進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,鴨坦布蘇病毒感染率較高,3個(gè)發(fā)病場(chǎng)均檢測(cè)出鴨坦布蘇病毒感染;20個(gè)調(diào)查場(chǎng)中有18個(gè)場(chǎng)檢測(cè)出鴨坦布蘇病毒陽性,場(chǎng)陽性率高達(dá)90.0%。流調(diào)樣品檢測(cè)結(jié)果如表7所示。

表7流調(diào)樣品檢測(cè)情況(部分)

采樣市

采樣縣

存欄量

樣品類型

樣品總數(shù)

個(gè)體陽性率

場(chǎng)陽性率

宜春市

FX-1場(chǎng)

1000

卵黃組織

36

40.00%

100%

FX-2場(chǎng)

1000

卵黃組織

36

20.00%

南昌市

JX-1場(chǎng)

280

咽腔栻子

20

25.00%

100%

JX-2場(chǎng)

500

咽腔栻子

20

20.00%

上饒市

PY-1場(chǎng)

4000

咽腔栻子

18

0

66.7%

PY-2場(chǎng)

12000

咽腔栻子

18

40.00%

PY-3場(chǎng)

4300

咽腔栻子

18

40.00%

九江市

DC-1場(chǎng)

1100

咽腔栻子

20

0

66.7%

DC-2場(chǎng)

5000

咽腔栻子

18

40.00%

DC-3場(chǎng)

2300

咽腔栻子

20

40.00%

吉安市

SC-1場(chǎng)

1500

咽腔栻子

30

40.00%

90.0%

SC-2場(chǎng)

560

咽腔栻子

30

0

SC-3場(chǎng)

490

咽腔栻子

30

20.00%

SC-4場(chǎng)

1520

咽腔栻子

30

40.00%

SC-5場(chǎng)

1500

咽腔栻子

30

40.00%

YF-1場(chǎng)

1000

咽腔栻子

30

40.00%

YF-2場(chǎng)

2000

咽腔栻子

30

40.00%

YF-3場(chǎng)

4000

咽腔栻子

30

40.00%

YF-4場(chǎng)

1200

咽腔栻子

30

20.00%

YF-5場(chǎng)

1500

咽腔栻子

30

60.00%

合計(jì)

524

30.3%

90%

5.2田間應(yīng)用結(jié)果

用試驗(yàn)篩選出的中草藥(5%牛至提取液),在吉安地區(qū)進(jìn)行了廣泛的田間試驗(yàn),主要針對(duì)吉安地區(qū)于2016年2月起,在一些蛋鴨養(yǎng)殖場(chǎng)陸續(xù)出現(xiàn)個(gè)別死亡、產(chǎn)蛋量驟降的病,按禽流感和鴨副粘病毒病治療預(yù)防仍沒有效果,造成了不小的經(jīng)濟(jì)損失。通過試驗(yàn)課題組采樣檢測(cè),大部分診斷為鴨坦布蘇病毒病,對(duì)診斷為鴨坦布蘇病毒病的蛋鴨場(chǎng)用篩選出的中草藥進(jìn)行預(yù)防治療,減輕了該病的危害,減少了養(yǎng)殖戶的損失,提高了養(yǎng)殖效益和促進(jìn)了養(yǎng)鴨者的積極性,為我省控制該病發(fā)揮了一定作用,為我省防治鴨坦布蘇病毒病提供了借鑒經(jīng)驗(yàn),田間應(yīng)用結(jié)果如表8所示。

表8田間應(yīng)用結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

應(yīng)用區(qū)域

應(yīng)用單位

起止時(shí)間

新增產(chǎn)值(萬元)

新增純收入(萬元)

應(yīng)用結(jié)果及社會(huì)效益

縣區(qū)

XGX畜牧獸醫(yī)局

2016年2月--2017年6月

95.6

19.12

通過兩年的推廣應(yīng)用,所有應(yīng)用養(yǎng)鴨場(chǎng)明顯減少了因鴨坦布蘇病毒并造成的經(jīng)濟(jì)損失,提高了養(yǎng)殖效益,提升了養(yǎng)殖戶的積極性。

JSX畜牧獸醫(yī)局

2016年2月--2017年6月

348

69.6

YFX畜牧獸醫(yī)局

2016年2月--2017年6月

133.85

26.77

QYQ畜牧獸醫(yī)局

2016年2月--2017年6月

28.18

5.6

JZQ農(nóng)業(yè)局

2016年2月--2017年6月

34.2

6.84

XJX畜牧獸醫(yī)局

2016年2月--2017年6月

84

18.48

合計(jì)

JAS畜牧獸醫(yī)局

2016年2月--2017年6月

1014.6

202.92

6結(jié)論與討論

鴨坦布蘇病毒病不僅具有致病性,且是獨(dú)立的病毒種類,具有可復(fù)制性,且在感染機(jī)體內(nèi)能夠穩(wěn)定存在。通過病毒復(fù)制實(shí)驗(yàn),結(jié)果證明實(shí)驗(yàn)功復(fù)制鴨坦布蘇病毒病,經(jīng)病毒分離、基因序列測(cè)定分析表明,其病原為黃病毒科黃病毒屬的坦布蘇病;為成功建立典型的疾病模型,保證試驗(yàn)結(jié)果具有較好的臨床意義,本研究選擇自然感染鴨分離的DTMUV野毒株,采用肌肉注射法復(fù)制疾病模型。結(jié)果證實(shí),感染鴨的臨床癥狀非常典型,剖檢病變與自然感染的條件下鴨只基本一致。

注意事項(xiàng)有:一是病毒復(fù)制需要確保整個(gè)過程處于無菌狀態(tài),不能確保則需要對(duì)收集的病毒進(jìn)行提純處理。二是在接種時(shí),進(jìn)針要避開大的血管,把握好進(jìn)針的深度,并做好密封工作,避免被污染。三是照蛋要勤快,每天進(jìn)行早中晚三次照蛋。四是要接種后孵化要保持溫度在37℃下,照蛋后要及時(shí)放進(jìn)去。四是收集尿囊液時(shí),不要在雞胚死亡后立馬收集,應(yīng)在-20℃條件下反復(fù)凍融兩次后再收集,提高病毒含量。

2.鴨坦布蘇病毒病流行特征經(jīng)本實(shí)驗(yàn)證實(shí),病毒能夠通過混群接觸感染、空氣傳播等方式進(jìn)行傳播。而且兩種傳播方式中,接觸傳播方式實(shí)驗(yàn)組引起蛋鴨產(chǎn)生精神沉郁、采食下降、產(chǎn)蛋率急劇下降等臨床癥狀較空氣傳播方式實(shí)驗(yàn)組更早出現(xiàn)。所以在日常生產(chǎn)過程中對(duì)患病鴨群應(yīng)盡早進(jìn)行隔離,并根據(jù)養(yǎng)殖場(chǎng)所處風(fēng)向因素,合理布置病鴨群與健康鴨群的鴨舍位置,才能更加有效阻止該疫病的傳播。雖然有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道鴨坦布蘇病毒能夠通過蚊蟲、節(jié)肢動(dòng)物等媒介進(jìn)行傳播,但此次試驗(yàn)受場(chǎng)地、試驗(yàn)開展季節(jié)等因素影響,未能對(duì)此傳播方式進(jìn)行證實(shí),但在實(shí)際生產(chǎn)過程中,也應(yīng)該做好滅蚊滅蟲等工作,確保鴨群養(yǎng)殖環(huán)境健康。

3.中草藥在預(yù)防鴨坦布蘇病毒病防控與治療中有一定效果。鴨坦布蘇病毒預(yù)防用藥與攻毒實(shí)驗(yàn)中,從產(chǎn)蛋變化情況評(píng)估,攻毒試驗(yàn)后攻毒組的蛋鴨產(chǎn)蛋量一直處于下降趨勢(shì),直至產(chǎn)蛋率降為0%,至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)產(chǎn)蛋量仍然未見回升。中草藥預(yù)防3組未見明顯預(yù)防效果,第6d產(chǎn)蛋率降至0;F疫苗免疫組、中草藥預(yù)防1組、中草藥預(yù)防2組、中草藥治療1組和中草藥治療2組均出現(xiàn)明顯防治效果;空白對(duì)照組產(chǎn)蛋率則基本保持穩(wěn)定。本研究結(jié)果說明F疫苗和中草藥1組、2組配方進(jìn)行預(yù)防或治療可以有效控制鴨坦布蘇病毒病對(duì)鴨群減蛋的影響。

從致死率可知,感染對(duì)照組在攻毒后第5d開始出現(xiàn)死亡,死亡率10%;中草藥預(yù)防3組死亡率為10%;中草藥治療1組死亡率為3.33%;F疫苗免疫組、中草藥預(yù)防1組、中草藥預(yù)防2組、中草藥治療2組死亡率為0。以上結(jié)果說明F疫苗和中草藥1組、2組配方能較好保護(hù)鴨群,提升鴨群抵抗鴨坦布蘇病毒侵襲的能力,降低病死率。

從卵巢恢復(fù)情況可發(fā)現(xiàn),F(xiàn)疫苗免疫組卵巢基本正常;中草藥治療1組卵巢的損傷程度較輕,卵巢上仍有卵泡發(fā)育;而其余各組蛋鴨的卵巢均存在不同程度的萎縮或者鈣化現(xiàn)象,說明F疫苗和中草藥1組配方能保護(hù)蛋鴨卵巢。

攻毒實(shí)驗(yàn)中,對(duì)攻毒劑量、注射部位、治療用藥開始時(shí)間都要做到精準(zhǔn),既要保證蛋鴨感染病毒的方式接近于自然感染,又要保證感染后蛋鴨的臨床癥狀和病例變化趨近于自然感染造成的危害。因此,此次攻毒實(shí)驗(yàn)中,攻毒劑量為5×103.5TCID50,注射部位為腿部肌肉注射,治療用藥時(shí)間為產(chǎn)蛋率下降50%左右(攻毒后第2天),初步取得了預(yù)期的實(shí)驗(yàn)效果。但實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),攻毒感染造成的產(chǎn)蛋率下降較自然感染更快,所以,在今后的類似實(shí)驗(yàn)中,應(yīng)該優(yōu)化攻毒劑量、注射部位和治療用藥開始時(shí)間。

流行病學(xué)調(diào)查也顯示,鴨坦布蘇病毒在我省流行范圍較為普遍,需加以重視,因此我們用篩選出的疫苗和中草藥組方在部分感染鴨坦布蘇病毒病的蛋鴨場(chǎng),進(jìn)行預(yù)防治療的田間試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)疫苗是預(yù)防該病發(fā)生與防控的較好選擇,中草藥在預(yù)防鴨坦布蘇病毒病的防控與治療中也有一定效果,能夠減輕該病危害,為養(yǎng)殖戶減少損失,中草藥組方用法、用量及生產(chǎn)效益比等仍需進(jìn)一步深入研究,仍需進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化和更廣的田間試驗(yàn)驗(yàn)證,展示出中草藥對(duì)治療鴨坦布蘇病毒有獨(dú)特的療效和廣闊的發(fā)展空間。

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