單克隆抗體的制備及應用課件

單克隆抗體的制備及應用西南大學目錄1單克隆抗體的簡介2單克隆抗體技術發(fā)展經歷3單克隆抗體的制備4單克隆抗體的應用5

展望單克隆抗體的簡介1第一部分

單克隆抗體技術的發(fā)展經歷2第二部分鼠源性單克隆抗體嵌合性單克隆抗體人源化單克隆抗體全人源單克隆抗體鼠源性單克隆抗體是來源于鼠蛋白，因此對于人體而言是外來物從而易被抵抗。嵌合性單克隆抗體是指同時具有人和鼠的來源構成，通常是30%比70%。鼠源部分用來結合抗原，人源部分用來誘導產生療效。人源化抗體就是指抗體的可變區(qū)部分或抗體全部由人類抗體基因所編碼。人源化抗體可以大大減少異源抗體對人類機體造成的免疫副反應。其抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。。單克隆抗體技術發(fā)展經歷

單克隆抗體的制備3第三部分單克隆抗的制備動物免疫11234細胞融合和選擇性培養(yǎng)雜交瘤細胞的篩選及克隆化大量制備及純化動物免疫抗原制備：制備單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機會增加，同時可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純越好，同時應根據(jù)所研究的抗原和實驗室的條件來決定。一般來說，免疫用的抗原只需初步提純甚至不提純，但抗原中混雜物很多，特別是如果這些混雜物的免疫原性較強時，則必須對抗原進行純化。免疫程序的確定：在設計免疫程序時，應考慮到抗原的性質和純度、抗原量、免疫途徑、免疫次數(shù)與間隔時間、佐劑的應用及動物對該抗原的應答能力等。沒有一個免疫程序能適用于各種抗原。細胞融合和選擇性培養(yǎng)融合過程中，常采用聚乙二醇（PEG）作為融合誘導劑。PEG促進細胞融合的機制可能是與臨近細胞膜的水分相結合使細胞間的水分被取代，降低細胞表面的極性，導致脂質雙分子層不穩(wěn)定，引起細胞膜的融合。注意：PEG的分子量和濃度與融合效果相關，PEG的分子量越大，濃度越高，其促融率也越高，但其粘度和細胞的毒性也隨之增大；濃度低于30％時，融合率低。

HAT選擇性培養(yǎng)1964年Littlefield首先發(fā)明了HAT

(H—Hypoxanthine次黃嘌呤，A—Aminopterin甲氨喋呤，T—Thymidine胸腺嘧啶核苷)選擇性培養(yǎng)。HAT選擇性培養(yǎng)基是根據(jù)次黃嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸生物合成途徑設計的。細胞內DNA的生物合成途徑主要生物合成途徑補救途徑甲氨喋呤次黃嘌呤次黃嘌呤核苷酸HGPRT+TK+胸腺嘧啶胸腺嘧啶脫氧核苷酸DNA利用糖和氨基酸合成核苷酸，進而合成DNA葉酸拮抗物氨基蝶呤可阻斷主要途徑小鼠HGPRT-骨髓瘤細胞（Sp2/0）融合后的細胞在HAT選擇培養(yǎng)基中結局Sp2/0+BSp2/0Sp2/0BBSp2/0B死亡死亡存活

克隆化：指將抗體陽性孔進行克隆化。目的是將抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、特異性抗體分泌細胞和無關抗體分泌細胞分開?？寺』脑瓌t：盡早進行，反復4-5次克隆化方法：有限稀釋法、軟瓊脂平板法、顯微克隆法陽性雜交瘤細胞應及時凍存，防染色體丟失、變異及污染mm11443322424442333244444222443333333333有限稀釋法純化方法1、鹽析2、凝膠過濾3、離子交換層析4、親和層析法鹽析：用中性鹽使蛋白質沉淀析出的方法為鹽析。大量的鹽加入到蛋白溶液中，高濃度的鹽離子有很強的水化力，可奪取蛋白質的水化層，使蛋白質膠粒失水發(fā)生凝聚而沉淀析出。

血清｜50%飽和度硫酸胺

上清（清蛋白）沉淀（球蛋白）｜33%飽和度硫酸胺上清沉淀擬球蛋白r球蛋白離子交換層析法DEAE纖維素：結合溶液中帶負電荷的蛋白質，又稱陰離子交換劑CM纖維素：結合溶液中帶正電荷的蛋白質，又稱陽離子交換劑將抗原（或抗體）連接到固相載體上，特異性吸附液相中的抗體（或抗原），形成抗原抗體復合物，然后改變條件，使抗原抗體復合物解離洗脫出純化的抗體（或抗原）。A蛋白-SepharoseCL4B親和層析法：單克隆抗體的應用4第四部分作為親和層系的配體單克隆抗體能與其相應的抗原特異性結合，因而能能夠從復雜系統(tǒng)中識別出單個成分。只要得到針對某一成分的單克隆抗體，固定在層析柱上，通過親和層析，即可從復雜的混合物中分離、純化這一特定成分。

優(yōu)點：與其他提取方法相比，具有簡便、快速、經濟、產品活性高等優(yōu)點。蛋白質提純

先用待提純蛋白質制成單抗，再將單抗固定在惰性固相基質上，制成層析柱。而后倒入混合液，當混合液流經單抗時，相應的蛋白質與單抗特異性結合，雜質則隨洗脫劑流走。再用特殊的洗脫劑將蛋白質洗脫下來，則可將蛋白質提純。在親和層析中單克隆抗體是主要的配體作為生物治療的導向武器以抗腫瘤為例：將針對某一腫瘤抗原的單克隆抗體與化療藥物或放療物質連接，利用單克隆抗體的導向作用，將藥物或放療物質攜帶至靶器官，直接殺傷靶細胞，稱為腫瘤導向治療。另外，將放射性標記物與單克隆抗體連接，注入患者體內可進行放射免疫顯像，協(xié)助腫瘤的診斷。常見抗腫瘤細胞毒劑：化療藥物、細菌毒素、植物毒素或放射性同位素等。這不僅提高了抗體的療效，也可降低細胞毒劑對正常細胞的毒性反應。作為免疫抑制劑抗人T淋巴細胞單抗（McAb）作為一種新型免疫抑制劑，已廣泛應用于臨床治療自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反應，其作用機理有賴于McAb的種類及其免疫學特性。例子：對于同種骨髓移植的供體骨髓，在體外經抗T細胞單抗加補體處理，能夠減輕移植物抗宿主病的發(fā)生。作為研究工作中的探針利用單克隆抗體的特性可把它作為研究工作中的探針。此時，可以從分子、細胞和器官的不同水平上，研究抗原物質的結構與功能關系，進而可以從理論上闡明其機理。例子：用熒光物質標記單抗作為探針，能快速地確定與其結合的相應生物大分子在細胞中的位置和分布。3佐劑能刺激吞噬細胞對抗原的處理5可刺激致敏淋巴細胞的分裂和漿細胞產生抗體2增加抗原的表面積，使抗原易于被巨噬細胞吞噬7改變抗體的產生類型以及產生遲發(fā)型變態(tài)反應，并使其增強4可促進淋巴細胞之間的接觸，增強輔助T細胞的作用6可提高機體初次和再次免疫應答增強抗原的免疫原性1改變抗原的物理性狀，可使抗原物質緩慢地釋放，延長了抗原的作用時間將單抗制成佐劑加在疫苗里，則可減少疫苗接種時藥物的用量和避免多次接種并不能引起機體更好地產生免疫應答，從而減少疫苗接種的風險。佐劑的作用機理：細胞因子的測定激素測定腫瘤抗原的檢測免疫細胞及其亞群的的檢測病原微生物抗原、抗體的檢測作為檢驗醫(yī)學實驗室的診斷試劑，單克隆抗體以其特異性強、純度高、均一性好等優(yōu)點，廣泛應用于酶聯(lián)免疫吸附試驗、放射免疫分析、免疫組化和流式細胞儀等技術。并且單克隆抗體的應用，很大程度上促進了商品化試劑盒的發(fā)展。檢驗醫(yī)學診斷試劑農獸藥快速檢測農獸藥屬于小分子物質，半抗原，無免疫原性，不能刺激動物產生抗體，必須先將其制備成人工抗原，以人工抗原免疫動物，使動物的免疫系統(tǒng)發(fā)生應答反應，從而制備出對該農藥具特異性的多或單克隆抗體國外已制備多種