DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用與技術(shù)比較

DNADNADNA蛋白甲基化的聯(lián)合作用機(jī)制、RNADNA從醫(yī)學(xué)領(lǐng)域擴(kuò)展到動(dòng)植物爭(zhēng)論當(dāng)中，同時(shí)在爭(zhēng)論方法上也取得了很大的突破。現(xiàn)在用于DNA的方法或許有十多種，從應(yīng)用上來分，大致可以分成兩類：全基因組甲基化分析及特異位點(diǎn)甲基化檢測(cè)。下面，我們就這兩大類檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展分析比較，以便于在實(shí)際的科研工作中進(jìn)展選擇。一、全基因組甲基化檢測(cè)技術(shù)基于芯片平臺(tái)的全基因組甲基化篩選芯片平臺(tái)作為目前比較成熟的篩選工具，已經(jīng)在很多領(lǐng)域DNA相應(yīng)的產(chǎn)品供給，其中應(yīng)用最為廣泛的就AgilentIlluminaAgilentHumanCpGIslandMicroarrayKit，InfiniumHumanMethylation27BeadChipInfiniumHumanMethylation450KBeadChipRocheNimbleGenAffymetrixNimbleGen產(chǎn)。不同的芯片平臺(tái)，各自的試驗(yàn)過程也是不一樣的。安捷倫DNA〔MeDIP〕技術(shù)。將基因組DNA分成兩份，一份用來做MeDIP，Cy5Cy3Cy5/Cy3例顯示出該區(qū)域的甲基化程度。eArray以進(jìn)展芯片的定制。在甲基化領(lǐng)域同樣適用。AgilentMeDIPIlluminaInfiniumGoldenGate術(shù)卻做得到。IlluminaInfiniumSNP檢測(cè)，承受的是單堿基延長(zhǎng)的原理。分析利用兩個(gè)位點(diǎn)特異的探針檢測(cè)這些序列差異的位點(diǎn)，一個(gè)探針是為甲基化位點(diǎn)(M磁珠類型)設(shè)計(jì)的，而另一個(gè)是為未甲基化位點(diǎn)(U堿基延長(zhǎng)摻入了一個(gè)標(biāo)記的ddNTP，它隨后被熒光試劑染色。通過計(jì)算甲基化與未甲基化位點(diǎn)的熒光信號(hào)比例，可確定檢測(cè)位點(diǎn)的甲基化水平。IlluminaInfiniumHumanMethylation27BeadChip27,578CpG領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，除了和腫瘤相關(guān)的甲基化篩選之外，也能用于其他疾病相關(guān)甲基化檢測(cè)。因此對(duì)這款產(chǎn)品，爭(zhēng)論者賜予了很高的評(píng)價(jià)，目前此InfiniumHumanMethylation450BeadChip45CpGCpGCpGCpG腫瘤和正常組織中差異表達(dá)的甲基化位點(diǎn)等等。它的高覆蓋度、高通量以及低價(jià)格，讓它成為進(jìn)展全基因甲基化篩選的有力武器。相比之下，VeraCode，它以以矩陣微珠芯片(SentrixArrayMatrix(SAM)〕48384CpG。首先，將亞硫酸氫鹽處理的基因組DNAoligooligoUColigoPCRPCRCpGIlluminaCpG基于高通量測(cè)序平臺(tái)的甲基化圖譜分析隨著二代測(cè)序技術(shù)的告知進(jìn)展，測(cè)序本錢大幅度下降，使得真正實(shí)現(xiàn)全基因組甲基化分析的爭(zhēng)論成為可能。隨著人類甲基化圖譜繪制成功，已經(jīng)間續(xù)有多個(gè)物種的甲DNA法，如亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化與高通量測(cè)序相結(jié)合，可以實(shí)現(xiàn)單堿基精度的甲基化圖譜的構(gòu)建。此外將成熟的MeDIP技術(shù)與二代測(cè)序相結(jié)合，可以快速有效地查找基因組上的甲基化區(qū)域，從而比較不同細(xì)胞、組織、甚至疾病DNA該技術(shù)也特別適用于大樣本量的疾病表觀爭(zhēng)論。第三代測(cè)序技術(shù)的消滅，更是讓甲基化的直接測(cè)定成為可PacificBiosciences子實(shí)時(shí)(SMRTDNA成果發(fā)表在《NatureMethods》雜志上。二、特異位點(diǎn)甲基化檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用比較1PCR〔MS-PCR〕DNADNACpGC轉(zhuǎn)變?yōu)閁，假設(shè)有甲基化則PCR，即可CpG甲基化。因此依據(jù)目的基因修飾前后的轉(zhuǎn)變，就可以相應(yīng)MU這種方法靈敏度高，無需特別儀器，因此經(jīng)濟(jì)有用，是目前應(yīng)用最為廣泛的檢測(cè)方法。不過也存在確定的局限性，DNA要。另外，亞硫酸氫鹽處理也格外關(guān)鍵，假設(shè)處理不完全則可能導(dǎo)致假陽性的消滅。PCR(BSP)DNA程如下：經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后，設(shè)計(jì)引物進(jìn)展PCRPCRCpG甲基化。這種方法牢靠，且準(zhǔn)確度高，能明確目的片段中CpG測(cè)序，其結(jié)果準(zhǔn)確但要求克隆時(shí)所挑克隆較多，操作繁瑣，不易大批量操作。另外，甲基化程度的定量依靠于挑選克隆的數(shù)目，因此這種方法只能算得上是一種半定量的技術(shù)方法。BSPMSPPCR本的篩選。甲基化敏感性高區(qū)分率熔解曲線分析(MS-HRM)通過熔解曲線分析可以將單堿基序列的差異轉(zhuǎn)變成熔解曲DNADNA通過熔解曲線分析來覺察。使用該方法進(jìn)展甲基化分析僅需一對(duì)引物，相對(duì)簡(jiǎn)潔，不過這種方法對(duì)儀器的要求頗HRMPCRPCR化狀況進(jìn)展分析，并不能明確每個(gè)CpG點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。因此這種技術(shù)適用于大量樣本的檢測(cè)，CPG點(diǎn)的準(zhǔn)確檢測(cè)及甲基化程度的準(zhǔn)確定量。聯(lián)合亞硫酸氫鈉的限制性內(nèi)切酶分析法〔COBRA〕這種方法是將亞硫酸氫鹽處理與酶切相結(jié)合來進(jìn)展甲基化檢測(cè)。DNA樣本經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后，利用PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物純化后用限制性內(nèi)切酶〔BstUI〕C(5mCG5mCG)，則PCR擴(kuò)增后保存為CGCG，BstUI能夠識(shí)別并進(jìn)展切割；假設(shè)待測(cè)序列中，C未發(fā)生甲基化，則PCR后轉(zhuǎn)變?yōu)門GTG，BstUI識(shí)別位點(diǎn)喪失，不能進(jìn)展切割。這樣酶切產(chǎn)物再經(jīng)電泳分別、探針雜交、掃描定量后即可計(jì)算出原樣本中甲基化的比例。這種方法最大的優(yōu)點(diǎn)就是相對(duì)簡(jiǎn)潔，可進(jìn)展快速定量，且需要的樣本量少。然而，它的局限性也格外明顯，只能獲得特別酶切位點(diǎn)的甲基化狀況，且陰性結(jié)果并不能排解樣品DNA中存在甲基化的可能。熒光定量法〔Methyligh〕MSPMSP利用熒光染料進(jìn)展定量。TaqMan?探針法的應(yīng)用使得該技術(shù)具有更高的準(zhǔn)確性。其原理與SNPDNA甲基化位點(diǎn)上會(huì)存在單堿基的差異，依據(jù)這種差PCR，就能夠檢測(cè)甲基化的差異。這種方法最大的優(yōu)勢(shì)在于其高敏感性和較高PCRTaqMan?探針訂購(gòu)費(fèi)用較高，適用于少數(shù)位點(diǎn)大量樣本篩選。焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)，現(xiàn)在認(rèn)為焦磷酸測(cè)序技術(shù)〔Pyrosequencing〕是甲基化檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。焦磷酸測(cè)序作為一種的序列分析技術(shù)，能夠快速地檢測(cè)甲基化的頻率，對(duì)樣品中的甲基化位點(diǎn)進(jìn)展定性及定量檢測(cè)，為甲基化爭(zhēng)論供給了的途徑。在序列延長(zhǎng)過程CTC-T比例。因此，不同位點(diǎn)的甲基化變異就能被準(zhǔn)確檢測(cè)，并給出準(zhǔn)確的甲基化程度的數(shù)據(jù)。QIAGEN供給三種焦磷酸測(cè)序儀器，通量由低到高，適合不同的應(yīng)用。PyroMarkQ2424PyroMarkQ96ID上進(jìn)展。在考慮處處理成百上千個(gè)樣品所需的大量試劑時(shí)，運(yùn)行通量最大化可能會(huì)使試驗(yàn)本錢變得很高。而PyroMarkQ96MD裝有一臺(tái)高度靈敏的光檢測(cè)攝像頭，可以在削減試劑量DNA的推出，對(duì)于我們實(shí)際爭(zhēng)論供給了更有效的檢測(cè)手段。雖然焦磷酸測(cè)序可以進(jìn)展單個(gè)位點(diǎn)甲基化程度的準(zhǔn)確定量，但是目前來看，測(cè)序的片段長(zhǎng)度還比較短，只有一百bp60bp。以上是對(duì)幾種常用的特異位點(diǎn)甲基化檢測(cè)方法進(jìn)展